氟斑牙兒童甲狀腺激素異常與DIO1基因多態(tài)性的關(guān)系

金祥，崔玉山，曹立春

近年來人群甲狀腺疾病譜發(fā)生了巨大變化，與1999年相比，2011年我國成人甲狀腺腫的患病率明顯下降，但亞臨床甲狀腺功能減退、甲狀腺結(jié)節(jié)患病率快速上升［1］，甲狀腺癌發(fā)病率也已升至人群癌癥發(fā)病率的第9 位［2］。甲狀腺疾病譜的改變可能與高分辨率B 超等先進(jìn)技術(shù)的普及有關(guān)［3］，但是甲狀腺疾病與氟關(guān)系的研究較少。氟對(duì)人體呈現(xiàn)“U”型效應(yīng)，高氟不僅可引起氟斑牙和氟骨癥，已有證據(jù)發(fā)現(xiàn)其還可損傷動(dòng)物甲狀腺的結(jié)構(gòu)和功能［4］，因此探索氟與人體甲狀腺功能改變的關(guān)系具有重要意義。

除環(huán)境因素外，遺傳因素與甲狀腺疾病也密切相關(guān)［5］。Ⅰ型脫碘酶（type 1 selenodeiodinase，DIO1）可促進(jìn)甲狀腺素（T4）向三碘甲狀腺原氨酸（T3）轉(zhuǎn)化，保證血液中T3的含量［6］，是甲狀腺激素的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。已知DIO1的基因多態(tài)性可能與甲狀腺的腫大有關(guān)［7］。DIO1基因多態(tài)性是否可調(diào)節(jié)氟與甲狀腺激素的關(guān)系值得深入研究。本研究擬選取正常和氟斑牙兒童，檢測(cè)兒童甲狀腺激素水平，并分析DIO1基因多態(tài)性在氟斑牙與甲狀腺激素關(guān)系中的作用。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 2018年6月—2019年6月，在天津市歷史水氟區(qū)和非水氟地區(qū)各隨機(jī)選擇1 所小學(xué)，分別在3～5 年級(jí)用隨機(jī)整群抽樣法抽取4 個(gè)班和2 個(gè)班，分別抽取當(dāng)?shù)爻錾砷L(zhǎng)的7～12 歲兒童120 名和60 名，經(jīng)父母知情同意后進(jìn)行調(diào)查。以氟斑牙作為兒童氟暴露指標(biāo)，檢測(cè)兒童氟斑牙程度，并對(duì)兒童進(jìn)行問卷的調(diào)查。排除父母不同意及信息不全者后，剩余169名兒童納入本研究。其中正常兒童（正常組）79名，氟斑牙兒童（氟斑牙組）90名。

1.2 氟斑牙的檢測(cè) 由專業(yè)口腔科醫(yī)生采用我國《氟斑牙診斷》（WS/T 208-2011）標(biāo)準(zhǔn)對(duì)兒童氟斑牙進(jìn)行診斷。本研究將“正常”和“可疑”歸為“正常組”，將“極輕”、“輕度”、“中度”和“重度”歸為“氟斑牙組”。

1.3 尿碘檢測(cè) 收集兒童晨尿15 mL，采用砷鈰催化分光光度方法（WS/T 107-2006）進(jìn)行尿碘的檢測(cè)。

1.4 甲狀腺激素和DIO1基因多態(tài)性的檢測(cè) 使用非抗凝管和EDTA抗凝管分別收集3 mL靜脈血，非抗凝管血液離心后提取血清，利用化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)促甲狀腺激素（TSH）、游離三碘甲狀腺原氨酸（FT3）和游離甲狀腺素（FT4）。本文參照Chen 等［8］研究，TSH 正常參考值為0.3～5 mIU/L、FT3和FT4正常參考值分別為4.78～6.96 pmol/L和13.4～20.6 pmol/L。

利用血液DNA提取試劑盒［天根生化科技（北京）有限公司，DP304］提取抗凝管中靜脈血DNA，采用Sequenom SNP分型檢測(cè)實(shí)驗(yàn)（MassARRAY 法）測(cè)定DIO1 rs2294512 位點(diǎn)的單核苷酸多態(tài)性，引物通過Sequenom公司的assay design 3.1軟件進(jìn)行設(shè)計(jì)，上游引物5′-ACG TTG GAT GGG CCT ATT ACC TGA AAC AGC-3′，下游引物5′-ACG TTG GAT GAG GAG TGA AAA TGG TGC TTG-3′。引物稀釋后配置反應(yīng)體系，進(jìn)行PCR擴(kuò)增（95 ℃15 min；94 ℃20 s，56 ℃30 s，72 ℃60 s，45個(gè) 循 環(huán)；72 ℃3 min；10 ℃保存），SAP（shrimp alkaline phosphatase，蝦堿性磷酸酶）消化反應(yīng)，單堿基延伸終止反應(yīng)，樹脂純化后的延伸產(chǎn)物移至384孔Spectro CHIP芯片上，質(zhì)譜分析后使用TYPER 4.0軟件進(jìn)行分析并輸出結(jié)果。

1.5 其他影響因素調(diào)查 利用自制的調(diào)查問卷對(duì)兒童基本情況及潛在甲狀腺影響因素進(jìn)行調(diào)查，包括年齡、性別、每日觀看電子產(chǎn)品時(shí)間、1周中每天鍛煉20 min以上的天數(shù)、近期是否有大的精神創(chuàng)傷、直系親屬有無甲狀腺疾病、生氣頻率、壓力大小等。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 24.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。正態(tài)分布計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）描述，多組間比較采用方差分析，2 組間比較采用t檢驗(yàn)；非正態(tài)分布資料采用M（P25，P75）描述，2組間比較采用秩和檢驗(yàn)。率的比較采用χ2檢驗(yàn)、Fisher 確切概率法或秩和檢驗(yàn)（指標(biāo)變量為有序變量時(shí)）。基因遺傳平衡采用Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)方法。采用二分類Logistic 回歸模型分層分析氟暴露對(duì)甲狀腺激素的影響及強(qiáng)度，第一步進(jìn)行氟斑牙及其他因素對(duì)甲狀腺激素影響的單因素分析，其中DIO1 rs2294512位點(diǎn)的基因型分為野生型（AA）和突變型（GA+GG）；第二步，根據(jù)基因型分層后，分別將氟斑牙和單因素分析P＜0.2 的因素［9］納入多因素Logistic分析。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 不同地區(qū)兒童氟斑牙情況 正常地區(qū)共納入兒童57名，氟斑牙兒童2名（3.5%），歷史水氟地區(qū)共納入兒童112 名，氟斑牙兒童88 名（78.6%），兩地氟斑牙率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=85.498，P＜0.01）。

2.2 2組兒童基本情況 正常組和氟斑牙組兒童性別分布、年齡、BMI和尿碘含量差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05），見表1。Hardy-Weinberg 平衡檢驗(yàn)顯示2 組兒童DIO1 rs2294512 位點(diǎn)的基因型頻率均符合遺傳平衡法則（χ2分別為0.003 和0.251，均P＞0.05）。不同組兒童DIO1 rs2294512 位點(diǎn)基因型及等位基因頻率分布差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05），見表2。

Tab.1 Comparison of the basic situation between two groups表1 2組兒童基線情況對(duì)比

2.3 2組兒童甲狀腺激素水平及異常率比較 與正常組比較，氟斑牙組FT3水平升高，F(xiàn)T4水平下降，F(xiàn)T3/FT4升高（均P＜0.05），但TSH水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表3。氟斑牙組FT3過高比例較高，而正常組FT4過高比例較高（P分別為0.008和0.039），見表4。

Tab.2 Genotype balance test of DIO1 rs2294512 in two groups of children表2 2組兒童DIO1 rs2294512位點(diǎn)基因型及等位基因頻率分布

Tab.3 Comparison of thyroid hormone levels between two groups of children表3 2組兒童甲狀腺激素水平比較 （±s）

Tab.3 Comparison of thyroid hormone levels between two groups of children表3 2組兒童甲狀腺激素水平比較 （±s）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01

組別正常組氟斑牙組t n 79 90 TSH（mIU/L）3.07±1.48 3.25±1.48 0.803 FT3（pmol/L）6.52±0.70 6.75±0.69 2.104＊FT4（pmol/L）18.36±2.08 17.24±1.68 3.840＊＊FT3/FT4 0.36±0.05 0.39±0.05 4.383＊＊

2.4 不同基因型兒童甲狀腺激素水平 DIO1 rs2294512位點(diǎn)上AA為野生型，GG為突變型，GA為混合型，加性模型（AAvs.GAvs.GG）、顯性模型（AAvs.GA+GG）和隱性模型（AA+GAvs.GG）3 種模型不同亞組間甲狀腺激素水平差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05），見表5。

2.5 FT3和FT4過高率影響的單因素分析 分析FT3和FT4過高比例變化的影響因素，研究樣本量分別為168 和167 例。結(jié)果顯示，正常兒童的FT3過高率低于氟斑牙兒童，但FT4過高率高于氟斑牙兒童（P＜0.05）。不同壓力兒童FT4過高率分布差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表6。

2.6 不同DIO1基因型兒童氟暴露和甲狀腺激素異常的關(guān)系 分析FT3過高影響因素時(shí)，以FT3是否異常為因變量（正常=0，過高=1），自變量為氟斑牙水平（正常=0，氟斑牙=1），調(diào)整因素為年齡（＜9 歲=0，≥9歲=1）和每日觀看電子產(chǎn)品時(shí)間（≤1 h=0，＞1 h=1）；分析FT4過高影響因素時(shí)以FT4是否異常為因變量（正常=0，過高=1），自變量為氟斑牙水平（正常=0，氟斑牙=1），調(diào)整因素為壓力（很小=0，一般=1，較大=2）。結(jié)果顯示，總?cè)巳杭癉IO1基因?yàn)锳A基因型兒童，氟斑牙兒童較正常兒童更易FT3過高，而未發(fā)現(xiàn)GA+GG基因型兒童氟斑牙與FT3過高之間存在關(guān)聯(lián)。總?cè)巳褐?，氟斑牙兒童相較正常兒童不易FT4過高（P=0.035），但根據(jù)DIO1基因分層后，未發(fā)現(xiàn)氟斑牙與FT4過高之間存在關(guān)聯(lián)，見表7。

Tab.4 Comparison of thyroid hormone abnormality between two groups of children表4 2組兒童甲狀腺激素水平正常與異常分布的比較 例（%）

Tab.5 Comparison of thyroid hormone levels between different genotype children表5 不同基因型兒童甲狀腺激素水平比較（±s）

Tab.5 Comparison of thyroid hormone levels between different genotype children表5 不同基因型兒童甲狀腺激素水平比較（±s）

均P＞0.05

模型加性模型n 88 66 15顯性模型88 81隱性模型基因型AA GA GG F AA GA+GG t AA+GA GG t 154 15 TSH（mIU/L）3.22±1.55 3.13±1.31 3.01±1.83 0.179 3.22±1.55 3.10±1.41 0.535 3.18±1.45 3.01±1.83 0.432 FT3（pmol/L）6.59±0.64 6.74±0.77 6.53±0.74 1.033 6.59±0.64 6.70±0.77 0.982 6.66±0.70 6.53±0.74 0.672 FT4（pmol/L）17.70±1.86 17.74±2.14 18.28±1.61 0.567 17.70±1.86 17.84±2.06 0.430 17.71±1.98 18.28±1.61 1.062 FT3/FT4 0.37±0.05 0.38±0.06 0.36±0.06 1.256 0.37±0.05 0.38±0.06 0.199 0.38±0.06 0.36±0.06 1.278

Tab.6 The influence of other factors on high FT3 and FT4表6 其他因素對(duì)FT3和FT4過高的影響

Tab.7 Logistic analysis of the relationship between high FT3 and FT4 and dental fluorosis in children withdifferent DIO1 genotypes表7 不同DIO1基因型兒童氟斑牙FT3和FT4過高影響的Logistic分析

3 討論

3.1 氟是甲狀腺結(jié)構(gòu)和功能的影響因素 氟是人體必需的微量元素，適量的氟對(duì)人體的生長(zhǎng)發(fā)育具有重要的作用，人體攝入過低時(shí)會(huì)造成齲齒等現(xiàn)象；而攝入過高時(shí)，也會(huì)對(duì)人體的健康造成損害。有研究發(fā)現(xiàn)，隨著總攝氟量的增加，兒童氟斑牙患病率逐漸在增加，呈顯著的劑量-效應(yīng)關(guān)系［10］，因此氟斑牙常作為氟的內(nèi)暴露指標(biāo)。氟過量除了可引起骨相組織的改變，還可損傷神經(jīng)系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)等［11］。氟對(duì)甲狀腺的影響也得到了初步的研究，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)已證實(shí)高氟可影響大鼠甲狀腺的結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致甲狀腺激素分泌紊亂［4］。甲狀腺疾病譜近幾年發(fā)生了較大的變化，其是否與氟暴露有關(guān)值得深入研究。

人群流行病學(xué)調(diào)查研究同樣發(fā)現(xiàn)高氟可擾亂人群甲狀腺激素，但結(jié)果存在差異。Zhang 等［12］發(fā)現(xiàn)高氟地區(qū)兒童與對(duì)照兒童相比，T3水平無變化，但T4水平下降，TSH 水平上升。向杰等［13］則發(fā)現(xiàn)飲水型氟中毒重病區(qū)兒童TSH 高于正常水氟地區(qū)，總T3和總T4水平無差異。本研究未探討不同水氟地區(qū)兒童甲狀腺激素差異，而是根據(jù)兒童氟斑牙情況進(jìn)行分組，探討兒童甲狀腺激素水平差異，發(fā)現(xiàn)TSH 無差異，但是氟斑牙兒童FT3水平高于正常兒童，F(xiàn)T4水平較低，且FT3和FT4過高比例存在差異?？紤]到甲狀腺激素降低和升高的機(jī)制可能不同，且本研究FT3和FT4過低比例均較低，因此多因素分析只探討了氟斑牙對(duì)甲狀腺FT3和FT4過高關(guān)系，發(fā)現(xiàn)氟暴露易使FT3過高，而不易使FT4過高。

3.2 DIO1 rs2294512基因多態(tài)性在氟影響甲狀腺激素中的調(diào)節(jié)作用 DIO1是硒酶家族的一員，其可催化碘化甲狀腺氨酸選擇性去碘，哺乳動(dòng)物肝臟、腎臟和甲狀腺均可高表達(dá)DIO1，且肝臟DIO1 活性被認(rèn)為是甲狀腺功能正常狀態(tài)下機(jī)體維持血漿T3水平的關(guān)鍵［14］。有學(xué)者對(duì)DIO1 基因多態(tài)性與甲狀腺疾病和甲狀腺激素關(guān)系進(jìn)行了研究，如AlRasheed 等［15］的研究未發(fā)現(xiàn)DIO1 rs2294512位點(diǎn)的多態(tài)性與甲狀腺癌之間的關(guān)系；而王文強(qiáng)［7］認(rèn)為DIO1 rs2294512位點(diǎn)的多態(tài)性可能與甲狀腺的腫大有關(guān)，等位基因A攜帶兒童更易患甲狀腺腫大；Panicker等［16］研究了DIO1 基因9 個(gè)位點(diǎn)多態(tài)性與甲狀腺激素的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)DIO1 rs2235544和rs11206244位點(diǎn)與FT3/FT4比例有關(guān)，且rs2235544 位點(diǎn)C 等位基因?qū)е翭T3水平上升、FT4水平下降。本研究顯示攜帶DIO1 rs2294512位點(diǎn)AA型的兒童易受氟的影響，導(dǎo)致FT3過高比例增加。

綜上所述，氟斑牙兒童FT3水平較高，F(xiàn)T4水平較低，F(xiàn)T3過高率偏高且FT4過高率偏低，未發(fā)現(xiàn)DIO1 rs2294512位點(diǎn)的多態(tài)性與FT3和FT4之間的關(guān)系，但是攜帶DIO1 rs2294512位點(diǎn)AA型的氟斑牙兒童FT3水平易升高。