CRISPR/Cas9 技術(shù)在大豆抗病蟲育種中的應(yīng)用前景

（黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院佳木斯分院，佳木斯 154007）

大豆是世界上主要的糧食作物之一，其含油量較高，是重要的油料作物之一，又由于其蛋白質(zhì)含量也很高，具有很高的營養(yǎng)價(jià)值。現(xiàn)在食品加工和工業(yè)技術(shù)發(fā)展較快，使得大豆的用途更加廣泛，如大豆冰淇淋[1]、大豆酸奶[2]等。人們對大豆需求量越來越大，我國大豆的產(chǎn)量早已不能滿足人們的需求，造成大豆產(chǎn)量低的原因有很多，病蟲害是很重要的因素之一，病蟲害同時(shí)也影響其質(zhì)量。為了減少大豆病蟲害對產(chǎn)量的影響，眾多防治方法中最為有效的辦法是選擇抗病品種，因此，抗病蟲品種的培育就顯得尤為重要。培育大豆的抗病蟲品種一般通過常規(guī)育種、分子育種、轉(zhuǎn)基因育種，其中常規(guī)育種育種年限長，具有物種界限等缺點(diǎn)；轉(zhuǎn)基因育種，人們對其安全性爭議較大；CRISPR/Cas9 技術(shù)的出現(xiàn)可能會(huì)消除人們對轉(zhuǎn)基因安全性的顧慮。CRISPR/Cas9 技術(shù)可能會(huì)推動(dòng)大豆抗病蟲育種的進(jìn)程，為大豆抗病蟲育種提供一種新的途徑。

1 大豆病蟲害

目前對我國甚至全世界大豆產(chǎn)量和質(zhì)量影響較大的病蟲害主要有3 種：疫霉根腐病、花葉病毒病、孢囊線蟲病[3]；另外在我國東北地區(qū)，灰斑病對大豆的產(chǎn)量影響也較為嚴(yán)重。生產(chǎn)上應(yīng)用化學(xué)防治和耕作栽培措施能夠降低一定的產(chǎn)量損失，但這些措施能夠起到的作用有限，且化學(xué)防治還會(huì)有環(huán)境污染等缺點(diǎn)；又由于這些病害的生理小種會(huì)隨著時(shí)間的推移產(chǎn)生變異，防治會(huì)更加困難。因此，培育抗病蟲品種就顯得尤為重要，能從根本上解決問題，并且是目前最為經(jīng)濟(jì)有效的手段。

2 抗病蟲品種的培育方法

可以通過傳統(tǒng)的育種手段，通過遺傳改良，抗性基因的聚合培育抗病蟲品種，但由于其育種周期長、預(yù)見性差并且不能利用外源的抗性基因等缺點(diǎn)，使得新品種的培育比較困難?，F(xiàn)在隨著分子生物學(xué)、基因工程的發(fā)展，使得轉(zhuǎn)基因技術(shù)發(fā)展較快，轉(zhuǎn)基因技術(shù)可以將抗性基因聚合，甚至可以打破物種界限引用外源抗性基因，目前應(yīng)用轉(zhuǎn)基因技術(shù)來達(dá)到改良作物抗性，已經(jīng)得到了很廣泛的應(yīng)用；但轉(zhuǎn)基因一般會(huì)引入外源基因，所以人們對轉(zhuǎn)基因食品安全性有所擔(dān)心。

3 CRISPR/Cas9 技術(shù)在大豆中的應(yīng)用

近年來，隨著CRISPR/Cas9 技術(shù)的出現(xiàn)，其能夠識別目標(biāo)基因并進(jìn)行切割，在細(xì)胞中又具有核酸修復(fù)機(jī)制，因此在這個(gè)過程中能夠引起基因突變或缺失，由于在整個(gè)過程中不會(huì)引入外源基因，因此，美國將CRISPR/Cas9 技術(shù)編輯過的作物定義為非轉(zhuǎn)基因作物。CRISPR/Cas9 技術(shù)已經(jīng)應(yīng)用于大豆[4]、玉米[5]、水稻[6]等作物。

在玉米、水稻、番茄等作物中DDM1是維持基因組甲基化水平的重要調(diào)節(jié)因子，利用CRISPR/Cas9 技術(shù)在大豆中創(chuàng)制了Gmddm1突變體，大豆Gmddm1突變體由于DDM1基因突變降低了基因組DNA 甲基化水平，并且Gmddm1突變體在田間表現(xiàn)和對照相比分枝增多、植株矮化并且易斷枝，單株產(chǎn)量降低[7]。

WRINKLED（WRI）在大豆油脂合成中具有關(guān)鍵作用，在大豆中利用CRISPR/Cas9 技術(shù)將WRI11a基因的表達(dá)進(jìn)行抑制，甚至是沉默，創(chuàng)制GmWRI1a基因突變體，研究發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因突變體植株中糖酵解和脂肪合成相關(guān)基因的表達(dá)量下降，揭示了WRI11a基因在大豆中增加油分含量發(fā)揮作用機(jī)理[8]。

4 大豆病蟲害基因的相關(guān)研究

Wang 等[9]通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法將帶有SMV 3′-UTR 的CP基因轉(zhuǎn)入感大豆花葉病毒的大豆品種，結(jié)果發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植株對大豆花葉病毒具有一定的抗性。幾丁質(zhì)是真菌細(xì)胞壁的成分之一，如果植物中存在幾丁質(zhì)酶，幾丁質(zhì)酶能夠分解真菌細(xì)胞壁，使得真菌死亡。Salehi 等[10]采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法將來自菜豆的幾丁質(zhì)酶插入到pBI121 載體上，并轉(zhuǎn)入到感立枯絲核菌的大豆品種中，通過PCR 分子檢測出陽性轉(zhuǎn)基因植株，并將葉片進(jìn)行立體鑒定，發(fā)現(xiàn)與其對照相比，能有效控制立枯絲核菌在葉片上的蔓延，說明轉(zhuǎn)基因植株對立枯絲核菌具有一定的抗性。

5 展望

CRISPR/Cas9 技術(shù)編輯的植物，能減少人們對轉(zhuǎn)基因食品安全的擔(dān)憂，同時(shí)該技術(shù)也是轉(zhuǎn)基因育種技術(shù)的一次革新，會(huì)加快轉(zhuǎn)基因育種的發(fā)展進(jìn)程，可以結(jié)合前人對大豆抗病和感病基因的研究，利用CRISPR/Cas9 技術(shù)進(jìn)行基因的編輯，能夠加快大豆的抗病蟲育種進(jìn)程，從而降低大豆在病蟲害方面的產(chǎn)量損失。