細(xì)胞3D培養(yǎng)技術(shù)及其在水產(chǎn)養(yǎng)殖上的應(yīng)用

唐 旖，蔡 靈，楊 明

(1.自然資源部第三海洋研究所，福建 廈門 361005；2.上海大學(xué)環(huán)境與化學(xué)工程學(xué)院，上海 200444)

細(xì)胞培養(yǎng)作為研究細(xì)胞生物學(xué)乃至生物學(xué)的技術(shù)之一，在生命科學(xué)研究領(lǐng)域占有重要地位。自Roux于1885 年從雞胚中分離細(xì)胞并首次建立體外細(xì)胞培養(yǎng)以來，單層細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)已有百余年的歷史[1]，而且已經(jīng)在遺傳學(xué)、免疫學(xué)、實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)和腫瘤學(xué)等各個(gè)領(lǐng)域內(nèi)取得了巨大的成果[2]。水產(chǎn)動物的細(xì)胞培養(yǎng)始于20世紀(jì)60年代，其中最具有代表性的是魚類細(xì)胞的體外培養(yǎng)技術(shù)。Wolf和Quimby建立了世界上第一個(gè)魚類細(xì)胞系，即虹鱒魚生殖腺細(xì)胞系(RTG-2)。目前，魚類細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)已經(jīng)成為魚類生物學(xué)研究領(lǐng)域中一種重要的研究手段，除了被廣泛應(yīng)用于魚類細(xì)胞建系外，還被應(yīng)用于魚類胚胎干細(xì)胞、魚類病毒學(xué)、魚類免疫學(xué)、魚類細(xì)胞因子與生長因子、魚類毒理學(xué)和腫瘤(癌)學(xué)、魚類內(nèi)分泌學(xué)、魚類細(xì)胞工程、遺傳育種與基因工程、抗病毒藥物與藥物檢測、魚類資源保護(hù)等方面的研究[3]。

長期以來，細(xì)胞的體外培養(yǎng)一直是在培養(yǎng)皿或培養(yǎng)瓶的二維平面上進(jìn)行的。然而越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，在二維的玻璃或聚苯乙烯底物上生長的真核細(xì)胞與體內(nèi)三維結(jié)構(gòu)中的真實(shí)細(xì)胞狀態(tài)有很大不同，如細(xì)胞與細(xì)胞、細(xì)胞與基質(zhì)間的相互作用、細(xì)胞分化等方面[4-6]。為了更好地模擬細(xì)胞在體內(nèi)的生長模式，3D細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)逐漸發(fā)展起來并被越來越多的研究者所接受。3D細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)最初的設(shè)想是設(shè)計(jì)一個(gè)生物相容性微孔支架，讓細(xì)胞在支架中生長，模擬其在體內(nèi)的3D狀態(tài)[7]。但隨著研究的深入，不同的參數(shù)被考慮加進(jìn)培養(yǎng)系統(tǒng)，包括細(xì)胞的類型、支架材料的選擇、特殊用途的需要等，這使得3D培養(yǎng)系統(tǒng)的復(fù)雜性越來越高。如今，3D細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)已經(jīng)在神經(jīng)細(xì)胞、癌癥和干細(xì)胞等許多領(lǐng)域被廣泛應(yīng)用，3D培養(yǎng)系統(tǒng)也已發(fā)展得多種多樣，并仍在不斷改進(jìn)和創(chuàng)新。本文在介紹國內(nèi)外大量已有的相關(guān)研究成果的基礎(chǔ)上，對3D細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的特點(diǎn)、發(fā)展歷程和應(yīng)用進(jìn)行了簡單的總結(jié)，并對3D細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)在水產(chǎn)養(yǎng)殖上的應(yīng)用前景進(jìn)行了簡介和展望。

1 3D細(xì)胞培養(yǎng)的發(fā)展歷程

1.1 二維(2D)細(xì)胞培養(yǎng)的局限性

傳統(tǒng)的細(xì)胞研究大多采用2D培養(yǎng)的方式，細(xì)胞在二維平面上呈單層生長。但這種培養(yǎng)方式與細(xì)胞在體內(nèi)所處的3D環(huán)境有很大區(qū)別，二維的平面使細(xì)胞失去了原來特定的形態(tài)功能特征和分化能力[4]。

2D與3D細(xì)胞培養(yǎng)相比，最明顯的區(qū)別在于沒有細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的作用。ECM是多細(xì)胞有機(jī)體中，細(xì)胞周圍由多種大分子組成的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)。它含有膠原蛋白、彈性蛋白和層粘連蛋白等蛋白質(zhì)，這些蛋白質(zhì)賦予組織機(jī)械特性，并幫助組織基質(zhì)內(nèi)細(xì)胞之間的通訊[6]。ECM并非僅僅起惰性支持物的作用，或者將細(xì)胞連接在一起，形成組織器官，而是含有大量信號分子，積極參與控制細(xì)胞的生長、極性、形狀、遷移和代謝活動[8]。

關(guān)于2D細(xì)胞培養(yǎng)的局限性，很早就有研究者進(jìn)行相關(guān)報(bào)道。Lanotte等[9]在進(jìn)行造血細(xì)胞的研究培養(yǎng)時(shí)發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞可以附著在固體基質(zhì)上，并保持其功能活性，這意味著誘導(dǎo)環(huán)境中的一些細(xì)胞成分可能會丟失，而且細(xì)胞間相互作用的能力可能會降低。另外，也有很多研究表明，2D環(huán)境中培養(yǎng)的細(xì)胞與3D培養(yǎng)的細(xì)胞在組織結(jié)構(gòu)、形態(tài)功能方面有很大差異，3D細(xì)胞表現(xiàn)出更符合體內(nèi)真實(shí)的狀況。例如，在神經(jīng)細(xì)胞的研究中，神經(jīng)干細(xì)胞通常在培養(yǎng)皿中作為漂浮的聚集體或附著在培養(yǎng)皿表面的單層膜進(jìn)行擴(kuò)增。雖然用這些方法培養(yǎng)細(xì)胞被證明是一種有效的擴(kuò)大細(xì)胞的方法，但這些系統(tǒng)也限制細(xì)胞生長到固定的幾何形狀，特別是在單層膜的情況下，細(xì)胞只在二維平面中擴(kuò)大。這種形態(tài)的改變可能會對細(xì)胞的原有功能產(chǎn)生影響[10]。

1.2 3D細(xì)胞培養(yǎng)的發(fā)展

早在20世紀(jì)70—80年代就有研究者斷斷續(xù)續(xù)地開始了細(xì)胞3D培養(yǎng)的探索。3D細(xì)胞培養(yǎng)的最初設(shè)想是設(shè)計(jì)一個(gè)生物相容性的微孔支架，細(xì)胞在支架中呈三維懸浮生長。膠原蛋白是其中應(yīng)用較早的支架材料之一，它是哺乳動物體內(nèi)含量最為豐富的動物蛋白，也是細(xì)胞外基質(zhì)的主要組成化合物，因?yàn)榫哂辛己玫纳锵嗳菪?、可生物降解性以及生物活性，所以其在食品、醫(yī)藥、組織工程等領(lǐng)域獲得廣泛的應(yīng)用[11-12]。Kleinman團(tuán)隊(duì)在20世紀(jì)70年代就對各類膠原蛋白的形態(tài)、結(jié)構(gòu)、功能及其與細(xì)胞之間的作用關(guān)系進(jìn)行了系統(tǒng)的研究，包括細(xì)胞粘附、蛋白與細(xì)胞的結(jié)合、膠原基質(zhì)的制備等[13-18]。最開始被應(yīng)用于細(xì)胞培養(yǎng)的膠原蛋白是從小鼠體內(nèi)的提取的[19]。Lanotte等[9]用0.5 mol/L乙酸從大鼠尾腱中提取了I型膠原，并用以膠原與培養(yǎng)基按比例混合的簡單方法來進(jìn)行造血細(xì)胞的3D培養(yǎng)。隨后，膠原蛋白被從各種不同的動物組織中提取出來并用于細(xì)胞培養(yǎng)。

但是由于來源不同的細(xì)胞及其周圍的環(huán)境的差異性，這種簡單的方法不能很好地適用于所有細(xì)胞的3D培養(yǎng)，于是有研究者提出了改良方法。組織工程支架就是一種較為基礎(chǔ)的方式，它由生物材料或合成聚合物制成，能提供生物功能信號并與細(xì)胞良好地相互作用，同時(shí)能實(shí)現(xiàn)對結(jié)構(gòu)性質(zhì)的精確控制。Almany等[20]描述了一種由纖維蛋白原主鏈組成并與雙官能聚乙二醇(PEG)側(cè)鏈交聯(lián)的生物合成雜合支架。

從長遠(yuǎn)來看，許多研究人員希望避免使用從活組織中提取材料，因?yàn)檫@些材料可能因批次的不同而出現(xiàn)差異，很難根據(jù)特定實(shí)驗(yàn)的需要進(jìn)行定制，因此大量的人工合成材料引起了人們的關(guān)注。Sun等[21]研究了三維電紡纖維支架的纖維直徑和纖維間距對人真皮成纖維細(xì)胞行為的影響。他們將兩種不同模型材料聚苯乙烯和聚乳酸制成直徑范圍較寬的纖維，在專門研制的三維細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)中構(gòu)建。該方法確定了電紡支架設(shè)計(jì)的一些基本微結(jié)構(gòu)參數(shù)和成纖維細(xì)胞三維生長的一些關(guān)鍵差異。另一種通常使用的支架材料是聚乙二醇(PEG)，因?yàn)樗菀妆还倌芑?。Loessner等[22]采用了高度靈活的全合成PEG基支架，由8臂PEG組成，通過微調(diào)不同組分，獲得具有不同硬度的水凝膠。

除凝膠和支架外，近些年還出現(xiàn)了一些新型的3D培養(yǎng)模型，如3D細(xì)胞微流控系統(tǒng)和磁力懸浮系統(tǒng)。3D細(xì)胞微流控系統(tǒng)通過將模擬細(xì)胞外基質(zhì)復(fù)雜生物化學(xué)和幾何形狀的表面與調(diào)節(jié)液體和可溶性因子運(yùn)輸?shù)奈⒘黧w通道相結(jié)合，為細(xì)胞生長和刺激的時(shí)空控制創(chuàng)造了新的機(jī)會[23]。Ong等[24]提出了一種在不使用水凝膠的情況下在微流體系統(tǒng)中三維接種和培養(yǎng)哺乳動物細(xì)胞的新方法。用一種瞬時(shí)細(xì)胞間聚合物接頭和微制造柱陣列的組合在微流體通道中形成和固定3D多細(xì)胞聚集體，這種方式減少了用于細(xì)胞支持的水凝膠的嵌入。

2 3D細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)在水產(chǎn)養(yǎng)殖上的應(yīng)用

水產(chǎn)動物的細(xì)胞培養(yǎng)是從20世紀(jì)60年代開始慢慢發(fā)展起來的，起初主要被用于病毒的分離和純化，目前這項(xiàng)技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于魚類細(xì)胞、貝類外套膜上皮細(xì)胞等的培養(yǎng)。細(xì)胞的3D培養(yǎng)技術(shù)也是一項(xiàng)在細(xì)胞培養(yǎng)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的新技術(shù)，目前在癌癥[25]、神經(jīng)干細(xì)胞[26]、心臟細(xì)胞再生[27]等方面發(fā)揮了重要作用。雖然因?yàn)榘l(fā)展時(shí)間較晚，3D細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)在水產(chǎn)動物的細(xì)胞培養(yǎng)方面還鮮有報(bào)道，但這項(xiàng)技術(shù)的應(yīng)用應(yīng)引起重視。

2.1 3D細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)在魚類細(xì)胞培養(yǎng)上的應(yīng)用前景

魚類細(xì)胞的培養(yǎng)始于20世紀(jì)60年代，之后各種魚類的細(xì)胞系相繼建立，到目前為止，國內(nèi)外報(bào)道的魚類細(xì)胞系已經(jīng)超過280株。與哺乳動物的細(xì)胞培養(yǎng)相比，魚類細(xì)胞的培養(yǎng)比較容易，對傳代培養(yǎng)時(shí)間的要求彈性比較大，適溫范圍廣，經(jīng)過幾十年的發(fā)展，已被廣泛應(yīng)用于魚類病毒學(xué)、水產(chǎn)養(yǎng)殖、魚類生理和免疫學(xué)以及資源保護(hù)等方面[28]，尤其在對魚類病毒的預(yù)防和治療上發(fā)揮了很大作用[29]。

魚類細(xì)胞培養(yǎng)與其他動物細(xì)胞培養(yǎng)一樣，總體上可分為原代培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)。一般來說，傳代培養(yǎng)的細(xì)胞在經(jīng)過幾次傳代后，會逐漸失去原細(xì)胞的生理生化功能特性，而原代培養(yǎng)的細(xì)胞仍能保留部分同在體內(nèi)細(xì)胞一樣的生理功能特性[30]，因此，原代細(xì)胞更適合用來進(jìn)行相關(guān)的魚類學(xué)實(shí)驗(yàn)。但即使是原代培養(yǎng)的細(xì)胞，也受到很多限制，在實(shí)踐中，短期培養(yǎng)的魚類細(xì)胞功能基因可以正常表達(dá)，但是長期體外培養(yǎng)條件下的細(xì)胞會丟失許多功能。這可能是由于體外培養(yǎng)的細(xì)胞缺少在體內(nèi)條件下的ECM環(huán)境和有效的細(xì)胞間相互作用所造成的，而3D細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)能給魚類細(xì)胞創(chuàng)造一個(gè)類似于魚體內(nèi)的懸浮環(huán)境，使細(xì)胞長期保持原有的生理功能和特性。用膠原凝膠作為支架進(jìn)行魚類細(xì)胞的3D培養(yǎng)或許是一個(gè)可行的方法。Falguni等[31]從淡水魚中提取了膠原蛋白并首次研究了這種膠原蛋白的生物相容性和免疫原性，他們用這種膠原蛋白支架進(jìn)行了3D細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示魚膠原蛋白支架表現(xiàn)出和牛膠原蛋白相當(dāng)?shù)募?xì)胞活力，表明源自淡水的魚膠原支架在性質(zhì)上具有高度生物相容性。Choi等[32]用靜電紡絲法制造了一種由魚膠原蛋白(FC)和聚己內(nèi)酯(PCL)混合物組成的新型納米纖維支架，這種新型支架以魚膠原蛋白的含量來控制納米纖維的直徑大小，以支架結(jié)構(gòu)促進(jìn)細(xì)胞粘附、擴(kuò)散、突起和增殖，為魚類細(xì)胞的3D培養(yǎng)提供了潛在的平臺。

2.2 3D細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)在貝類上的應(yīng)用前景

對貝類的組織和細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)始于20世紀(jì)70年代，已報(bào)道的關(guān)于貝類的組織培養(yǎng)主要集中在文蛤、牡蠣等常見貝類[33-35]。外套膜是珍珠貝孕育珍珠的場所，是珍珠貝插核形成珍珠的必要條件，目前插核所用的外套膜大多采自于珍珠貝活體膜。關(guān)于貝類外套膜組織的離體培養(yǎng)已有很多嘗試，相關(guān)研究證明，離體條件下培養(yǎng)的珍珠貝外套膜組織和自然狀態(tài)下的一樣，都能分泌豐富的珍珠質(zhì)[36]。用3D細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)對珍珠貝的外套膜組織進(jìn)行離體培養(yǎng)，將有利于減少珍珠貝的使用量，從而增加經(jīng)濟(jì)效益。

貝類養(yǎng)殖是水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的一個(gè)重要部分，貝類細(xì)胞的3D培養(yǎng)技術(shù)還可以被用于貝類病毒的研究。體外培養(yǎng)的細(xì)胞是進(jìn)行病理和免疫機(jī)理研究的良好素材，不僅可以被用于鑒定病毒，還可以被用于研究病毒的感染、復(fù)制、形態(tài)發(fā)生和遺傳變異等。此外，通過培養(yǎng)貝類的免疫細(xì)胞，可進(jìn)行貝類免疫機(jī)制的研究和篩選增強(qiáng)免疫機(jī)能的活性物質(zhì)或藥物[37]。因此，細(xì)胞的3D培養(yǎng)技術(shù)應(yīng)用對貝類的疾病防治可能具有重要意義。

3 展望

在各種研究數(shù)據(jù)的支持下，3D細(xì)胞培養(yǎng)模型優(yōu)于2D傳統(tǒng)培養(yǎng)已經(jīng)成為共識。與2D培養(yǎng)相比，3D培養(yǎng)中的細(xì)胞更接近于與細(xì)胞形狀和環(huán)境有關(guān)的體內(nèi)情況，已被用于研究多種組織和細(xì)胞，包括前列腺、乳腺、肌肉、結(jié)腸、食道、成纖維細(xì)胞和胚胎干細(xì)胞等。3D培養(yǎng)技術(shù)雖然具有明顯的優(yōu)勢，但在應(yīng)用方面仍不夠成熟。對不同來源的細(xì)胞需要形成不同的模擬環(huán)境，這需要相對復(fù)雜的條件和技術(shù)。但可以預(yù)見的是，隨著材料科學(xué)和生物工程技術(shù)的發(fā)展，3D細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)將會越來越成熟。水產(chǎn)動物的細(xì)胞培養(yǎng)在近些年發(fā)展快速，但同時(shí)也面臨著一些問題，而3D培養(yǎng)系統(tǒng)為細(xì)胞培養(yǎng)提供了一種新思路，將會有力地推動水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展。