DNA分子標(biāo)記技術(shù)在壇紫菜(Pyropia haitanensis)中的應(yīng)用

吳曉雯，王鐵桿，劉 穎，張 鵬

(浙江省海洋水產(chǎn)養(yǎng)殖研究所，浙江 溫州 325035)

壇紫菜(PyropiahaitanensisChang et Zheng)隸屬于紅藻門(Rhodophyta)，紅藻綱(Rhodophyceae)，紅毛菜科(Bangiaceae)，法紫菜屬(Pyropia)[1]，是一種暖溫帶大型藻類，在浙江、福建和廣東都有分布，是我國特有經(jīng)濟(jì)種類[2]。目前我國壇紫菜的總產(chǎn)量占全國紫菜總產(chǎn)量的75%[3]。壇紫菜味美價廉，富含蛋白質(zhì)、多糖、大量人體必需氨基酸、礦物質(zhì)和維生素，是品質(zhì)較高的營養(yǎng)保健品，可供食用和藥用，有著“營養(yǎng)寶庫”的美稱，其經(jīng)濟(jì)價值和生態(tài)價值越來越來越受到大家的關(guān)注。

DNA分子標(biāo)記指的是與特定基因或標(biāo)記連鎖的一段經(jīng)過擴(kuò)增并可以檢測出的DNA序列。分子標(biāo)記具有以下優(yōu)點(diǎn)：1)在生物不同生長階段，不同組織都可以進(jìn)行基因檢測；2)基因型不受環(huán)境的影響；3)表現(xiàn)為顯性或共顯性遺傳，有利于對隱性基因的選擇；4)標(biāo)記數(shù)量較多[4]。自從1974年Gmdzicker等創(chuàng)立限制性片段長度多態(tài)性技術(shù)以來，已有幾十種名稱各異的分子標(biāo)記技術(shù)相繼問世。近年來已有多種分子標(biāo)記技術(shù)在藻類的相關(guān)研究中得到了很好的應(yīng)用，已經(jīng)被廣泛用于藻類種質(zhì)鑒定[5]、雜種優(yōu)勢性狀跟蹤[6]、遺傳多樣性分析[7]等研究中。

隨著育種技術(shù)的快速發(fā)展，DNA分子標(biāo)記技術(shù)和傳統(tǒng)的育種技術(shù)的結(jié)合程度也越發(fā)緊密，提高育種選擇的準(zhǔn)確性，提高育種效率，縮短育種時間，對紫菜新品種培育也有積極的促進(jìn)作用。因此，本文對DNA分子標(biāo)記技術(shù)在壇紫菜的應(yīng)用研究進(jìn)行綜述，主要介紹了DNA分子標(biāo)記技術(shù)在壇紫菜遺傳學(xué)多樣性、物種鑒定、指紋圖譜構(gòu)建、種群和親緣關(guān)系方面的研究，同時闡述現(xiàn)在壇紫菜研究存在的問題，并對發(fā)展前景進(jìn)行展望。

1 常見的DNA分子標(biāo)記技術(shù)

DNA分子標(biāo)記是以生物DNA的多態(tài)性為研究基礎(chǔ)的遺傳標(biāo)記，具有無表型效應(yīng)、不受環(huán)境因素影響的特征，隨著生物分子技術(shù)的發(fā)展，目前較為常見的DNA分子標(biāo)記主要有：限制性內(nèi)切酶片段長度多態(tài)性標(biāo)記(Restriction fragment length polymorphism，RFLP)、隨機(jī)擴(kuò)增片段長度多態(tài)性標(biāo)記(Randomly amplified polymorphic DNA，RAPD)[8-9]、擴(kuò)增片段長度多態(tài)性標(biāo)記技術(shù)(Amplified fragment length polymorphism，AFLP)[10]、特定序列擴(kuò)增標(biāo)記技術(shù)(Sequence characterized amplified regions，SCAR)[11]、相關(guān)序列擴(kuò)增多態(tài)性(Sequence related amplified polymorphism，SRAP)、簡單重復(fù)序列(Simple sequence repeats，SSR)、簡單序列重復(fù)區(qū)間擴(kuò)增多態(tài)性(Inter-simple sequence repeat，ISSR)[12]，詳見表1。由于每一種DNA分子標(biāo)記都有其優(yōu)缺點(diǎn)，不能達(dá)到全面和完美的實(shí)驗效果，因此，結(jié)合需要解決主要問題選擇合適的分子標(biāo)記尤為重要，否則直接影響實(shí)驗結(jié)果和分析。

表1 常見DNA分子標(biāo)記

2 DNA分子標(biāo)記技術(shù)在壇紫菜中的應(yīng)用現(xiàn)狀

2.1 遺傳多樣性分析

DNA分子標(biāo)記在壇紫菜的多樣性研究方面應(yīng)用較廣。胡則輝等[13]從壇紫菜絲狀體獲得基因組DNA，經(jīng)過克隆篩選測序，獲得172個微衛(wèi)星序列，其中完美型序列107個(占62.2%)，并發(fā)現(xiàn)壇紫菜的(GC)n與(CG)n含量非常豐富，該研究為今后微衛(wèi)星標(biāo)記在壇紫菜遺傳多樣性的研究應(yīng)用奠定分子理論基礎(chǔ)；謝潮添等[14]使用SRAP分子標(biāo)記從15個壇紫菜種質(zhì)篩選出15對特異性引物，多態(tài)位點(diǎn)占75.4%，表明壇紫菜遺傳多樣性較高；楊惠等[15]利用EST-SSR序列設(shè)計合成了10對引物，檢測到 4個位點(diǎn)在8個不同來源壇紫菜葉狀體間存在多態(tài)性，認(rèn)為可以從壇紫菜EST數(shù)據(jù)庫中篩選SSR標(biāo)記進(jìn)行遺傳多樣性分析；陳昌生等[16]利用ISSR 分子標(biāo)記對福建省3個野生壇紫菜種群共60 個個體進(jìn)行了遺傳多樣性分析，結(jié)果表明壇紫菜種群內(nèi)個體間的遺傳變異較大，遺傳多樣性水平較高；紀(jì)德華等[17]以野生型壇紫菜(♀)和經(jīng)過人工誘變選育獲得的紅色型(♂)壇紫菜進(jìn)行雜交并獲得絲狀體和葉狀體雜交后代，挑選出其中5個性狀穩(wěn)定子代品系為實(shí)驗材料，篩選出21條ISSR引物，多態(tài)位點(diǎn)高達(dá)94.8%，發(fā)現(xiàn)雜交可以顯著提高壇紫菜的遺傳多樣性水平，并提出ISSR標(biāo)記是預(yù)測雜種優(yōu)勢的有效工具；江靈芝等[18]對浙江4株不同壇紫菜進(jìn)行ISSR分析，結(jié)果顯示多態(tài)性條帶達(dá)88.71%，說明浙江附近島嶼的野生壇紫菜遺傳多樣性較為豐富。通過以上研究發(fā)現(xiàn)，壇紫菜遺傳多樣性較高，使用ISSR分子標(biāo)記檢測的遺傳多態(tài)性更高。

2.2 物種鑒定

RAPD只適合大規(guī)模種群遺傳學(xué)研究，不適合系統(tǒng)發(fā)育研究，徐滌等[19]使用RAPD技術(shù)對5個紫菜品系的遺傳差異進(jìn)行分析，成功擴(kuò)增出壇紫菜特異性片段，有效區(qū)分于其他紫菜，可為紫菜種質(zhì)庫的品系管理提供可信的分子證據(jù)；陳奕欣等[20]以福建省主要栽培品種和誘變篩選的突變品系為實(shí)驗材料，使用AFLP標(biāo)記技術(shù)有效區(qū)分了樣品間存在的差異；紀(jì)德華等[17]使用ISSR標(biāo)記對以野生型壇紫菜(♀)和經(jīng)過人工誘變選育獲得的紅色型(♂)壇紫菜雜交獲得的絲狀體和葉狀體進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)雜交使壇紫菜的遺傳多樣性水平得到提高，出現(xiàn)明顯的雜種優(yōu)勢，雖從遺傳距離角度分析母本細(xì)胞質(zhì)基因在雜種性狀遺傳方面發(fā)揮了重要的作用，但后期仍需要從基因序列多角度進(jìn)一步佐證；吳亞亞等[21]對高蛋白、生長快的兩個優(yōu)良品系和野種種群葉狀體進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)這兩個優(yōu)良品系雖來自野生種群，但從基因型分析養(yǎng)殖種群和野生群已經(jīng)出現(xiàn)遺傳分化，雖然是DNA特異性標(biāo)記，但依舊會受到非特異性擴(kuò)增條帶的影響，從而影響主觀判斷；張鵬等[22]從52 對微衛(wèi)星引物中篩選出7 對引物對壇紫菜9個品系(2個野生品系、2個優(yōu)良品系、2個雜交品系、3個色素突變品系)絲狀體進(jìn)行了親緣關(guān)系分析，該研究發(fā)現(xiàn)在引物PC-40 界定的遺傳座位上，“申福1號”和優(yōu)質(zhì)6號的絲狀體和葉狀體均出現(xiàn)了區(qū)別于其他品系的等位基因，該結(jié)果證明可以使用SSR特異性標(biāo)記對不同紫菜品系進(jìn)行有效區(qū)分，但是由于壇紫菜微衛(wèi)星側(cè)翼序列保守性未知，因此需要考慮假陽性條帶對實(shí)驗的影響；魏玲[23]通過對壇紫菜研究發(fā)現(xiàn)，壇紫菜品系之間遺傳相似性在51.85%～81.48%之間，具有豐富的遺傳多樣性，SSR標(biāo)記可以用于鑒定出壇紫菜純系和雜合品系；王婷等[24]篩選出9個RAPD標(biāo)記，并進(jìn)一步將兩個特異性標(biāo)記成功轉(zhuǎn)化為特異SCAR 標(biāo)記(Z26-600和Z26-360)，實(shí)驗證明其可以作為“閩豐1號”(Z-26)品系的特異和穩(wěn)定性標(biāo)記，但并非所有RAPD的特異分子標(biāo)記都能成功地轉(zhuǎn)換成SCAR 標(biāo)記；張慶杰等[25]使用SSR標(biāo)記，成功地在“申福2號”絲狀體和葉狀體擴(kuò)增出特異性條帶，認(rèn)為SSR標(biāo)記9#引物可以用于該品系的種質(zhì)鑒定；Kim等[26]使用PCR-RFLP分子標(biāo)記對6種紫菜進(jìn)行鑒定并取得了較好的成果，有效將壇紫菜與其他紫菜分離。目前的分子標(biāo)記技術(shù)，雖然存在缺陷，但是都可以有效地將壇紫菜與其他的物種區(qū)分開，這是紫菜研究工作的基礎(chǔ)。

2.3 指紋圖譜的構(gòu)建

楊銳等[27]利用AFLP技術(shù)對浙江和福建兩省的野生壇紫菜以及栽培壇紫菜進(jìn)行分析，得到了可靠的AFLP可靠指紋圖譜，并找到可作為篩選與生長性狀相關(guān)的標(biāo)記；劉必謙等[28]采用3對EST-SSR引物擴(kuò)增出的5個條帶構(gòu)建了8個壇紫菜絲狀體品系的DNA 指紋，使得每個絲狀體品系都有獨(dú)一的指紋模式；Zuo等[29]通過基因庫獲得壇紫菜11個微衛(wèi)星多態(tài)位點(diǎn)，認(rèn)為可用于紫菜的遺傳圖譜構(gòu)建、分子輔助標(biāo)記等；Qian等[30]首次利用SRAP分子標(biāo)記技術(shù)對三種紫菜的16個樣品進(jìn)行遺傳學(xué)分析，建立了各自特有的遺傳圖譜；謝潮添等[31]利用ISSR技術(shù)將4個壇紫菜色素突變體擴(kuò)增出現(xiàn)的特異性條帶，轉(zhuǎn)化為計算機(jī)可以識別和處理的數(shù)碼指紋的指紋圖譜，雖然該圖譜使用引物條帶作為圖譜，擴(kuò)增的條帶可能存在假陽性，但給壇紫菜的鑒定工作帶來了較大的便利和新的工作思路；隨后，謝潮添等[32]根據(jù)3對SSR引物對44個壇紫菜種質(zhì)材料擴(kuò)增出的16個多態(tài)位點(diǎn)構(gòu)建出44個壇紫菜的特異性DNA指紋圖譜，并在之前工作基礎(chǔ)上，開發(fā)出相應(yīng)的數(shù)碼指紋識別軟件，為壇紫菜種質(zhì)的自動化鑒定和信息化管理奠定了基礎(chǔ)，但是由于標(biāo)記本身固有缺陷，在后期受人為因素影響較大，缺乏相應(yīng)的指紋圖譜識別軟件，因此在實(shí)際應(yīng)用中難度較大；同年，徐燕等[33]以野生型壇紫菜純系(♀)和紅色型壇紫菜純系(♂)作為雜交親本，創(chuàng)建了由157 個株系組成的壇紫菜DH 作圖群體，并用經(jīng)過篩選的24 對SRAP 引物和16 對SSR 引物對父母本及作圖群體各株系進(jìn)行雙標(biāo)記分析，首次構(gòu)建壇紫菜分子遺傳連鎖圖譜，其基因組覆蓋率為92.0%。目前，壇紫菜DNA 指紋圖譜構(gòu)建存在統(tǒng)計方式、條帶判斷主觀性和不同實(shí)驗室的研究數(shù)據(jù)難以共享等問題，需要做進(jìn)一步研究。

2.4 種群親緣關(guān)系分析

陳驍?shù)萚34]通過對2個代表性壇紫菜栽培品種和27個野生品種和2個條斑紫菜進(jìn)行比較，條斑紫菜純度較高，野生壇紫菜和養(yǎng)殖壇紫菜遺傳差異較大，遺傳育種仍有較大的發(fā)展空間。謝潮添等[31]用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)對4個不同顏色壇紫菜(P.haitanensis)絲狀體品系及1個野生型對照品系進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)這4個不同養(yǎng)殖壇紫菜絲狀體間的平均遺傳距離為0.572 7，它們同野生型對照的平均遺傳距離為0.656 4，養(yǎng)殖型已經(jīng)與野生型發(fā)生明顯的差異。趙玲敏等[35]對10個野生壇紫菜的5.8S rDNA-ITS區(qū)片段序列進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果顯示ITS區(qū)序列有差異，5.8S rDNA雖保守，但與其他紫菜同區(qū)域存在較大差異，認(rèn)為可以用該段區(qū)域?qū)喜诉M(jìn)行種質(zhì)鑒定和系統(tǒng)進(jìn)化分析。該結(jié)論也得到了Li等[36]和Chen等[37]的證實(shí)；Li等[38]使用基因間隔區(qū)(Intergenic spacer region，IGS)對福建、廣東、浙江的壇紫菜進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)這三個區(qū)域的壇紫菜有顯著差異；王鑫等[39]使用AFLP技術(shù)壇紫菜和條斑紫菜的雜交后代品系進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，在分子水平上后代與親代均存在不同之處，但是與壇紫菜親緣關(guān)系較遠(yuǎn)?？傊?，現(xiàn)代分子標(biāo)記在紫菜親緣關(guān)系分析中起著重要的作用。

3 存在的問題

3.1 壇紫菜特殊生活史問題

一方面，壇紫菜生活史存在異型交替的葉狀體和絲狀體兩個世代[2]。壇紫菜的雌雄葉狀體都能進(jìn)行單性生殖，經(jīng)過染色體加倍后，產(chǎn)生純合二倍體絲狀體，且后代葉狀體是單性可育的。另一方面，有性生殖的壇紫菜屬于雌雄同體，壇紫菜減數(shù)分裂發(fā)生在殼孢子萌發(fā)時的最初兩次分裂，減數(shù)分裂完成后殼孢子產(chǎn)生的4 個子細(xì)胞繼續(xù)分裂，最終發(fā)育成為直線排列的2～4塊遺傳組成不同的鑲嵌葉狀體，在缺乏明顯標(biāo)記的情況下，是無法區(qū)分同一葉狀體上的各塊嵌合體的，因此也就無法對其進(jìn)行準(zhǔn)確的遺傳分析，葉狀體只有經(jīng)過單性生殖純化后才可以作為理想實(shí)驗材料，以減少嵌合體的干擾；而壇紫菜全生活史的實(shí)驗培養(yǎng)技術(shù)難度較大，造成實(shí)驗材料較難獲得。

3.2 單一分子標(biāo)記缺陷問題

由于很多標(biāo)記處于不同的發(fā)展階段，技術(shù)不夠成熟，存在一定的局限性，加上可能存在的錯誤統(tǒng)計方式，導(dǎo)致某些實(shí)驗結(jié)果出現(xiàn)重復(fù)性較差、可靠性較低且無法驗證等問題。另外，目前壇紫菜領(lǐng)域的相關(guān)研究一般使用單一的分子標(biāo)記分析，這是產(chǎn)生假陽性結(jié)果和造成誤判的一個重要原因。因此，需要采用多個標(biāo)記同時進(jìn)行鑒定的方法來避免造成誤判，只有多個特異性標(biāo)記都為陽性的情況下，才能確定后續(xù)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。

3.3 技術(shù)發(fā)展緩慢

關(guān)于DNA分子標(biāo)記技術(shù)在壇紫菜中的應(yīng)用，早年研究較多，但是從時間角度來分析，早期研究比例較大，近幾年發(fā)展較為緩慢，主要還是集中在遺傳多樣性分析、品種鑒定，指紋圖譜繪制等方面，但是與經(jīng)濟(jì)性狀相關(guān)的標(biāo)記較少。

4 展望

遺傳育種是提高壇紫菜品質(zhì)和產(chǎn)量的重要環(huán)節(jié)之一，傳統(tǒng)的育種方法主要參考個體大小、色素含量、藻體長寬、厚度等形態(tài)學(xué)特征進(jìn)行篩選，隨著新品系的不斷研發(fā)，需要結(jié)合現(xiàn)代分子技術(shù)，從基因角度去分析壇紫菜的遺傳多樣性、遺傳結(jié)構(gòu)，構(gòu)建遺傳圖譜，并篩選出生長速度快、高蛋白、抗病害、抗高溫等高產(chǎn)量紫菜品種，從而推動壇紫菜產(chǎn)業(yè)高質(zhì)量發(fā)展。

隨著對壇紫菜的深入研究，嚴(yán)興洪等[40]通過壇紫菜的人工色素突變體與野生型進(jìn)行的雜交實(shí)驗推導(dǎo)及細(xì)胞學(xué)實(shí)驗觀察，認(rèn)為壇紫菜的減數(shù)分裂發(fā)生的位置在殼孢子萌發(fā)時第一和第二次細(xì)胞分裂時期，而且壇紫菜大部分為雌雄異體，很容易發(fā)生品系間雜交，不具無性生殖，在人工調(diào)控下，也能發(fā)育為雌雄同體進(jìn)行自交而培育出純系，這些特點(diǎn)為壇紫菜今后深入研究奠定良好的基礎(chǔ)。

目前，分子生物學(xué)和分子技術(shù)的不斷進(jìn)步和革新，已經(jīng)有越來越多的分子標(biāo)記被開發(fā)：EST標(biāo)記、SNP標(biāo)記、STS標(biāo)記、SSCP標(biāo)記、線粒體DNA標(biāo)記、葉綠體DNA標(biāo)記、核糖體DNA標(biāo)記，基于逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的分子標(biāo)記等，特別是測序技術(shù)的快速發(fā)展，更多方便有效的分子標(biāo)記技術(shù)將會被開發(fā)和應(yīng)用，針對不同的研究目的可以選擇更為合適的研究方法。例如，Xu等[41]利用SLAF-seq技術(shù)，構(gòu)建了壇紫菜第一個高密度遺傳圖譜，有效確定了與6個經(jīng)濟(jì)性狀相關(guān)的高精度15個QTL定位。但是總的來說，在水產(chǎn)特別是壇紫菜的研究，起步較晚，基礎(chǔ)較為薄弱，但是分子標(biāo)記技術(shù)是藻類可持續(xù)較好發(fā)展的重要保證技術(shù)之一，建立在分子標(biāo)記基礎(chǔ)上與經(jīng)濟(jì)性狀相關(guān)的輔助育種技術(shù)已經(jīng)逐漸取得成效，有充分的理由可以相信，在眾多研究者的不懈堅持和努力下，分子標(biāo)記將會在壇紫菜甚至在其他紫菜研究中有更多的應(yīng)用，在紫菜遺傳育種和種質(zhì)改良中發(fā)揮越來越重要的作用。