基于高通量測(cè)序?qū)δ蠘O菲爾德斯半島土壤微生物多樣性的初步研究

李桂秀，宋易洋，趙 芯，王國(guó)良

(1.煙臺(tái)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山東 煙臺(tái) 264005；2.北京市農(nóng)林科學(xué)院北京農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究中心，北京 100097)

南極大陸是世界上最晚被發(fā)現(xiàn)的大陸，也是世界上居住人口最少的大陸。南極大陸位于地球的最南端，氣候惡劣，營(yíng)養(yǎng)匱乏，不利于生物的生存。但是這種極端環(huán)境下生長(zhǎng)的生物具有耐低溫、耐高鹽、抗輻射等特點(diǎn)[1]，有別于其他大陸的生物，因而具有廣泛的研究意義[2]。南極土壤經(jīng)過(guò)長(zhǎng)時(shí)間的積累與沉積，成為了微生物生存的棲息地。這些微生物往往具有適應(yīng)其特殊環(huán)境的形態(tài)學(xué)、生理學(xué)上的特異性[3]，為微生物學(xué)注入新的思路和方向。與其他大陸相比，南極大陸的環(huán)境較為封閉，受人類(lèi)改造較少，從而微生物群落更為原始，受人類(lèi)活動(dòng)的影響也較少[4-5]，因此研究南極土壤微生物不僅可以為開(kāi)發(fā)利用微生物資源提供重要的理論依據(jù)[6]，還可以為生命的起源和進(jìn)化提供重要的線索[7]。

目前世界上僅有1%的微生物可以用純培養(yǎng)的方式獲得，剩余99%的微生物難以用傳統(tǒng)方法進(jìn)行研究[8]。隨著高通量測(cè)序技術(shù)的普及和宏基因組學(xué)研究技術(shù)的發(fā)展，人們逐漸揭開(kāi)了環(huán)境微生物世界的神秘面紗[9]。宏基因組是指整個(gè)環(huán)境中所含有的遺傳物質(zhì)的總和[10]。宏基因組學(xué)技術(shù)的發(fā)展克服了大部分微生物難以培養(yǎng)的難題，通過(guò)直接獲取環(huán)境中所有微生物的遺傳信息并進(jìn)行生物信息學(xué)分析，研究環(huán)境中微生物的多樣性，了解微生物的群體結(jié)構(gòu)和生態(tài)功能[11-12]。

本研究以中國(guó)第31次南極科學(xué)考察采自菲爾德斯半島3個(gè)站點(diǎn)的土壤樣本為研究對(duì)象，對(duì)其進(jìn)行宏基因組DNA(gDNA)提取，用高通量測(cè)序和生物信息學(xué)技術(shù)對(duì)其進(jìn)行測(cè)序分析，初步揭示了南極土壤微生物的多樣性，為后續(xù)南極土壤新物種的發(fā)現(xiàn)和功能基因的挖掘提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣本采集與處理

實(shí)驗(yàn)中采用的樣本來(lái)自中國(guó)第31次南極科學(xué)考察(2014-10-30出發(fā))，取樣地點(diǎn)為菲爾德斯半島。3個(gè)取樣點(diǎn)分別涵蓋了苔蘚植物、雪縫水和山坡區(qū)域，采樣時(shí)用無(wú)菌鏟取距離表層約5～10 cm深度的土壤樣本，每個(gè)采樣點(diǎn)取3份重復(fù)混合而成，去除可見(jiàn)根，混合后放到無(wú)菌密封塑料袋中低溫保存。所有樣本低溫條件運(yùn)輸至國(guó)內(nèi)，長(zhǎng)期以-80℃溫度條件儲(chǔ)存于中國(guó)科學(xué)院北京基因組研究所(表1)。

表1 3例南極土壤樣本位點(diǎn)信息

1.2 宏基因組DNA提取

3例南極土壤樣本使用電子天平各稱取0.1 g，用基因組提取試劑盒(江蘇康為世紀(jì)，CW2091S)進(jìn)行宏基因組DNA(gDNA)提取。采用NanoDrop微量分光光度計(jì)和瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA的純度和完整性，用Qubit dsDNA HS試劑盒(Invitrogen，Q32854)檢測(cè)DNA濃度，達(dá)到實(shí)驗(yàn)要求的gDNA存于-20℃，以備建庫(kù)。

1.3 宏基因組文庫(kù)構(gòu)建和高通量測(cè)序

根據(jù)Qubit檢測(cè)的濃度，取10 ng gDNA起始建庫(kù)，利用自動(dòng)聚焦聲波基因組剪切儀Covaris M220將gDNA打斷成200 bp左右的片段后，使用1.8×DNA純化磁珠(Vazyme，N411)對(duì)片段化產(chǎn)物進(jìn)行純化，用通用DNA文庫(kù)構(gòu)建試劑盒(Vazyme，ND607)進(jìn)行文庫(kù)構(gòu)建。文庫(kù)使用全自動(dòng)核酸分析系統(tǒng)Qsep100和熒光定量PCR儀(BioRad，CFX96)分別進(jìn)行片段分布和濃度測(cè)定。檢測(cè)合格的文庫(kù)送往北京貝瑞和康生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序平臺(tái)為Illumina NovaSeq 6000，測(cè)序策略是Paired-end 150。

1.4 數(shù)據(jù)處理

首先用FastQC對(duì)下機(jī)數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量評(píng)估，生成質(zhì)檢報(bào)告，根據(jù)質(zhì)檢報(bào)告用Trimmomatic[13]選擇過(guò)濾標(biāo)準(zhǔn)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行修剪過(guò)濾，以去除接頭和低質(zhì)量堿基等。然后用MetaPhlAn2[14]對(duì)處理過(guò)的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，基于參考數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)快速實(shí)現(xiàn)序列的物種分類(lèi)[15]，獲取環(huán)境中微生物的豐度和群落結(jié)構(gòu)[16]。GraPhlAn[17]是一種用于生成分類(lèi)和系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的綜合可視化工具，利用這個(gè)軟件對(duì)微生物群落數(shù)據(jù)進(jìn)行可視化，構(gòu)建物種群落結(jié)構(gòu)圖。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 基因組DNA提取和文庫(kù)構(gòu)建

電泳檢測(cè)如圖1所示，主帶完整性較好，輕微降解，無(wú)明顯雜帶。NanoDrop測(cè)定樣本吸光值A(chǔ)260/A280(表2)均分布于1.8～2.0之間，說(shuō)明純度符合實(shí)驗(yàn)要求。根據(jù)Qubit檢測(cè)結(jié)果(表2)，樣本量可以滿足2次及以上的建庫(kù)需求。

表2 NanoDrop和Qubit檢測(cè)gDNA質(zhì)量結(jié)果

注：M表示Super DNA Marker(江蘇康為世紀(jì)，CW2583)，59、61、62分別表示樣本S59、S61、S62。

Notes：M represented Super DNA Marker(CWBIO，Jiangsu，CW2583).59，61 and 62 represented samples S59，S61 and S62，respectively.

Qsep100以電泳峰圖和凝膠電泳圖展示宏基因組文庫(kù)片段分布(圖2)，結(jié)果顯示文庫(kù)分布于300～500 bp范圍內(nèi)，峰值集中在400 bp左右，無(wú)接頭和引物二聚體等小片段，文庫(kù)質(zhì)量符合上機(jī)測(cè)序要求。

注：圖a、b、c分別代表樣本S59、S61、S62，上半部分是電泳峰圖，下半部分是凝膠電泳圖。

Notes：Figures a，b and c represented samples S59，S61 and S62，respectively，with the upper half being the electrophoresis peak map and the lower half being the gel electropherogram.

2.2 數(shù)據(jù)質(zhì)控

先用FastQC對(duì)從測(cè)序公司返回的下機(jī)數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)控，下機(jī)數(shù)據(jù)與質(zhì)控的詳細(xì)信息見(jiàn)表3。原始數(shù)據(jù)中會(huì)包含接頭信息、低質(zhì)量堿基、未測(cè)出的堿基等，這些數(shù)據(jù)會(huì)對(duì)后續(xù)信息分析造成干擾，因而在分析之前會(huì)用Trimmomatic按照一定的過(guò)濾標(biāo)準(zhǔn)對(duì)其進(jìn)行過(guò)濾清除，獲得有效數(shù)據(jù)，即Clean reads，用于后續(xù)生物多樣性分析。

表3 質(zhì)控統(tǒng)計(jì)結(jié)果

2.3 生物豐度分析

根據(jù)獲得的物種豐度表(表4)、韋恩圖(圖3)和相對(duì)豐度熱圖(圖4)，分析了3例樣本不同水平上的優(yōu)勢(shì)菌群。由圖4看出，樣本S59、S61、S62均有明顯的紅色和黃色區(qū)域，這說(shuō)明這些紅色和黃色區(qū)域所覆蓋的細(xì)菌數(shù)量相對(duì)較大，且均具有不同的黑色區(qū)域，表明樣本間的差異性較大。其中，S61樣本中細(xì)菌豐度較大，優(yōu)勢(shì)菌群是假單胞桿菌屬(Pseudomonas)，與S59和S62樣本相比，具有的特殊菌種是深藍(lán)紫色桿菌(Janthinobacteriumlividum)、威隆假單胞菌(Pseudomonasveronii)和雷爾氏菌屬(Ralstonia)；S59樣本中的細(xì)菌和真菌的豐度各占59.83%和39.92%，細(xì)菌優(yōu)勢(shì)菌種是曼德氏假單胞菌(Pseudomonasmandelii)，特殊菌群是游動(dòng)放線菌屬(Actinoplanes)，真菌優(yōu)勢(shì)菌種是白色念珠菌(Candidaalbicans)；S62真菌的豐度略高，約58.13%，其中真菌優(yōu)勢(shì)菌種和S59一致，細(xì)菌的優(yōu)勢(shì)菌群是假單胞菌屬(Pseudomonas)，無(wú)特殊菌群。

表4 3例南極土壤樣本微生物豐度表

注：第3～5列表示三個(gè)樣本中不同物種的相對(duì)豐度，單位是%；Unclassified表示沒(méi)有具體的物種分類(lèi)或?qū)?yīng)的編號(hào)。

Notes：Columns 3～5 represented the relative abundance of different species in the three samples，the unit was %；Unclassified meant there was no specific species classification or corresponding number.

注：X軸：上側(cè)表明樣本的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，下側(cè)表明樣本號(hào)；Y軸：左側(cè)展示物種的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，右側(cè)是物種名稱；方形網(wǎng)格中的顏色強(qiáng)度表示微生物相對(duì)豐度，由黃到黑表示豐度由高到低。

Notes：The heatmap indicated the relative abundance of each genus in different samples.The X-axis clustering indicated the phylogenetic relationships of these samples(upper side)and samples name(under side)，the Y-axis clustering exhibited the variables and phylogenetic relationships of each bacterial species in different samples(left side)and species name(right side).The color intensity in the square grid represented the relative abundance of species.From yellow to black，the abundance was high to low.

2.4 物種群落結(jié)構(gòu)分析

GraPhlAn軟件選取前100個(gè)最豐富的進(jìn)化枝構(gòu)成的物種群落結(jié)構(gòu)圖(圖5)中，從內(nèi)而外依次表示界門(mén)綱目科屬種，整個(gè)生物群落細(xì)菌的多樣性很高，有8個(gè)門(mén)14個(gè)綱21個(gè)目32個(gè)科48個(gè)屬，豐度大于1%的(即圖5中顏色標(biāo)注的區(qū)域)分別是酸桿菌目(Acidobacteriales)、放線菌目(Actinomycetales)、伯克氏菌目(Burkholderiales)、柄桿菌目(Caulobacterales)、嗜纖維菌目(Cytophagales)、嗜甲基菌目(Methylophilales)、顫藻目(Oscillatoriales)、假單胞菌目(Pseudomonadales)、根瘤菌目(Rhizobiales)、酵母目(Saccharomycetales)、鞘脂桿菌目(Sphingobacteriales)、鞘脂單胞菌目(Sphingomonadales)；節(jié)點(diǎn)越大，豐度越高，由此可以看出物種的豐度差異明顯，其中假單胞菌目(Pseudomonadales)和酵母目(Saccharomycetales)的物種豐度最高。

注：不同顏色表示不同的目分類(lèi)，見(jiàn)右側(cè)圖例；字母所代表的具體物種或者屬，在左側(cè)的圖例中標(biāo)出。A：顆粒菌屬；B：游動(dòng)放線菌屬；C：痤瘡丙酸桿菌；D：噬纖維菌屬；E：薄層菌屬；F：螺狀菌屬；G：地桿菌屬；H：微鞘藻屬；I：短波單胞菌屬；J：柄細(xì)菌屬；K：沼澤紅假單胞菌；L：紅假單胞菌屬；M：根瘤菌；N：中慢生根瘤菌屬；O：鞘氨醇單胞菌；P：雷爾氏菌屬；Q：硫單胞菌屬；R：極地單胞菌屬；S：貪噬菌屬；T：深藍(lán)紫色桿菌；U：紫色桿菌屬；V：曼德氏假單胞菌；W：假單胞菌屬；X：威隆假單胞菌；Y：白色念珠球菌。

Notes：The dots on the cladogram represented the specific bacterial taxa whose colors were the same as those of the corresponding orders.The size of dots was proportional to the relative abundance.A：Granulicella；B：Actinoplanes；C：Propionibacteriumacnes；D：Cytophaga；E：Hymenobacter；F：Spirosoma；G：Pedobacter；H：Microcoleus；I：Brevundimonas；J：Caulobacter；K：Rhodopseudomonaspalustris；L：Rhodopseudomonas；M：Mesorhizobiumloti；N：Mesorhizobium；O：Sphingomonasmelonis；P：Ralstonia；Q：Thiomonas；R：Polaromonas；S：Variovorax；T：Janthinobacteriumlividum；U：Janthinobacterium；V：Pseudomonasmandelii；W：Pseudomonas；X：Pseudomonasveronii；Y：Candidaalbicans.

3 討論

本研究通過(guò)對(duì)中國(guó)第31次南極科學(xué)考察采自菲爾德斯半島3個(gè)站點(diǎn)的南極土壤樣本提取的宏基因組進(jìn)行建庫(kù)測(cè)序，對(duì)測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行生物信息學(xué)分析，獲得了南極土壤中豐富的微生物種群數(shù)據(jù)信息，為分離培養(yǎng)新菌種、獲取生物活性物質(zhì)和篩選功能基因等提供了信息資源。

16S rRNA在研究環(huán)境微生物多樣性上應(yīng)用廣泛[18]，但是對(duì)16S測(cè)序結(jié)果進(jìn)行分析僅能確定物種至屬[19]，因此只能在門(mén)、綱、目、科、屬這些級(jí)別進(jìn)行微生物群落進(jìn)化和種屬親緣關(guān)系分析，而對(duì)宏基因組的高通量測(cè)序可以進(jìn)一步確定至種名，并且覆蓋更多的功能基因區(qū)域。MetaPhlAn2是基于數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)獲取生物物種信息的，但本次數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，很多物種并沒(méi)有鑒定到種，而只是鑒定到屬，這可能是因?yàn)槟蠘O土壤中存在的大部分物種是未經(jīng)開(kāi)發(fā)和研究的，數(shù)據(jù)庫(kù)中并不存在此物種的基因序列，只能根據(jù)基因序列的相似性鑒定到相關(guān)屬。這也側(cè)面反映了南極土壤中微生物多樣性高，新物種存在概率大，南極土壤將成為未來(lái)新物種開(kāi)發(fā)和研究的熱點(diǎn)。

本研究用MetaPhlAn2分析得出的優(yōu)勢(shì)菌群是假單胞菌屬，這與劉春影等[20]探索南極可培養(yǎng)土壤微生物的多樣性結(jié)果一致。與張麗珉等[21]的研究略有差異，他們發(fā)現(xiàn)南極羅斯海區(qū)域中嗜冷桿菌屬(Psychrobacter)為優(yōu)勢(shì)細(xì)菌類(lèi)群，枝孢屬(Cladosporium)為優(yōu)勢(shì)真菌類(lèi)群，這說(shuō)明南極土壤微生物具有區(qū)域差異性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果中的極地單胞菌屬(Polaromonas)是構(gòu)成冰川微生物群系的重要部分，已經(jīng)有研究發(fā)現(xiàn)極地單胞菌屬的一些質(zhì)?？梢詭椭拗鬟m應(yīng)極地地區(qū)的惡劣條件[22]，比如低溫，可以將該微生物的功能基因和低溫酶等投入工廠生產(chǎn)和實(shí)際應(yīng)用。

本研究系統(tǒng)地介紹了南極土壤微生物種群的多樣性，詳細(xì)闡述了各個(gè)樣本的優(yōu)勢(shì)菌群和特殊菌群，初步了解了南極土壤微生物的群落結(jié)構(gòu)和物種豐度。后期會(huì)結(jié)合二代高通量測(cè)序技術(shù)與三代長(zhǎng)分子測(cè)序技術(shù)[23]，深入挖掘南極土壤微生物的潛在價(jià)值，比如篩選功能基因簇；同時(shí)結(jié)合宏轉(zhuǎn)錄組[24]數(shù)據(jù)分析，研究微生物群落的動(dòng)態(tài)結(jié)構(gòu)以及其適應(yīng)南極環(huán)境的作用機(jī)制等。