豬鼻支原體分子生物學(xué)檢測(cè)方法研究進(jìn)展

李天芝

（山東綠都生物科技有限公司，山東 濱州 256600）

豬鼻支原體（Mycoplasma hyorhinis,Mhr）無(wú)細(xì)胞壁，大小介于細(xì)菌和病毒之間，具有高度可變的多種形態(tài)，可在細(xì)胞內(nèi)寄生，也能在體外培養(yǎng)基純培養(yǎng)，但初次分離難度大。Mhr是細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中常見(jiàn)污染源，也與人類肺癌、胃癌、乳腺癌、大腸癌等多種癌癥具有相關(guān)性，Mhr具有重要的公共衛(wèi)生學(xué)意義。Mhr對(duì)外界環(huán)境抵抗力弱，常規(guī)消毒劑即可迅速殺滅。Mhr感染豬后能引起豬肺炎、多發(fā)性漿膜炎、關(guān)節(jié)炎、結(jié)膜炎、中耳炎等多種疾病[1]，3～10周齡仔豬多發(fā)[2]，一年四季均可發(fā)病，可造成豬生長(zhǎng)發(fā)育緩慢，飼料報(bào)酬降低等，常與其它豬病混合感染，加重病情[3]。Mhr主要通過(guò)直接接觸和呼吸道飛沫傳播。Mhr是豬鼻腔、氣管、支氣管黏液中的常在菌，10%母豬和40%斷奶仔豬呼吸道黏液中均有該菌存在[4]，當(dāng)豬群密度大、通風(fēng)不良、飼料突變、轉(zhuǎn)群、斷奶或受到其它應(yīng)激時(shí)容易發(fā)病。Mhr作為一種條件性致病菌，長(zhǎng)期被忽視，近年來(lái)，Mhr引起的疾病增加，對(duì)豬場(chǎng)危害嚴(yán)重。本文就近年來(lái)Mhr常規(guī)PCR法、套式PCR法、多重PCR、熒光PCR方法、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)等5種分子生物學(xué)檢測(cè)方法研究進(jìn)展進(jìn)行綜述，以期為該病的快速診斷和防控提供參考。

1 常規(guī)PCR法

PCR是以病原核酸為模板進(jìn)行病原快速檢測(cè)的方法，較病原分離鑒定等傳統(tǒng)的方法，檢測(cè)速度快、靈敏度高，在動(dòng)物疾病診斷上得到了廣泛的應(yīng)用。沈強(qiáng)等[5]建立一種可靠的Mhr PCR檢測(cè)方法，擴(kuò)增Mhr目的基因大小為364 bp，最低可檢測(cè)模板濃度0.5 ng/mL的Mhr DNA含量，方法特異性好，與其它豬常見(jiàn)導(dǎo)致呼吸道和多發(fā)性漿膜炎病原無(wú)交叉反應(yīng)。李石友等[6]采集疑似Mhr的感染病豬肺臟并提取DNA作為模版，根據(jù)GenBank的數(shù)據(jù)庫(kù)中Mhr膜蛋白P37的序列設(shè)計(jì)1對(duì)特異性引物，建立Mhr PCR檢測(cè)方法。試驗(yàn)結(jié)果顯示，擴(kuò)增目的基因片段大小為494 bp，該法最低可檢測(cè)濃度為3.44×10-8ng/μL Mhr DNA含量，為快速準(zhǔn)確鑒別Mhr提供了一種有效的臨診手段，也對(duì)藥物的使用具有指導(dǎo)意義。

2 套式PCR法

套式PCR，又稱巢式PCR。采用兩對(duì)引物擴(kuò)增目的基因片段，第2對(duì)引物在第1對(duì)引物的內(nèi)部設(shè)計(jì)，以第1對(duì)引物的擴(kuò)增產(chǎn)物為模板進(jìn)行再次擴(kuò)增，經(jīng)兩輪擴(kuò)增，保證了擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性，提高了PCR檢測(cè)的敏感性。白方方等[7]應(yīng)用巢式聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)建立了一種檢測(cè)Mhr的方法，試驗(yàn)中以酚-氯仿法制備模板DNA，根據(jù)Mhr P37序列高度保守區(qū)設(shè)計(jì)2對(duì)引物，建立Nested PCR診斷方法。在特異性檢測(cè)試驗(yàn)中，設(shè)計(jì)的引物不能擴(kuò)增出豬絮狀支原體、豬滑液支原體、豬肺炎支原體、雞毒支原體、胸膜肺炎放線桿菌、豬瘟病毒、豬流感病毒、豬圓環(huán)病毒2型及豬繁殖與呼吸綜合征病毒等病原體。敏感性試驗(yàn)表明，第1次PCR和第2次PCR的敏感度分別為3.01 mg/L和3.01×10-4mg/L。對(duì)41份臨床樣品肺組織的檢測(cè)中，普通PCR和巢式PCR的檢出率分別為 29.3%（12/41）和 82.9%（34/41）。彭凌等[8]根據(jù)Mhr P69基因序列設(shè)計(jì)2對(duì)引物，建立了Mhr套式PCR診斷方法，對(duì)建立的方法進(jìn)行特異性、敏感性檢測(cè)，同時(shí)進(jìn)行臨床檢測(cè)。結(jié)果表明，應(yīng)用建立的套式PCR方法對(duì)MhrDNA的檢出限為1.4×10-5ng/μL，與常見(jiàn)感染豬的細(xì)菌、病毒均無(wú)交叉反應(yīng)。利用建立的套式PCR方法對(duì)23份臨床樣品進(jìn)行檢測(cè)，陽(yáng)性檢出率為73.9%。

3 多重PCR法

多重PCR是一種特殊的PCR技術(shù)，它在同一PCR體系中，加入多對(duì)引物，同時(shí)檢測(cè)2種或2種以上的病毒DNA，它具有快速、靈敏度高、高效、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)而廣泛用于臨床的快速診斷。吳靜波等[9]根據(jù)副豬嗜血桿菌（HPS）的P2蛋白基因和Mhr的P37蛋白基因分別設(shè)計(jì)了1對(duì)引物，建立HPS和Mhr雙重PCR檢測(cè)方法，并進(jìn)行特異性和靈敏度試驗(yàn)，同時(shí)應(yīng)用所建立方法對(duì)臨床樣品進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示，該方法可特異性檢測(cè)出HPS和Mhr，對(duì)其他細(xì)菌無(wú)非特異性擴(kuò)增，檢測(cè)靈敏度可達(dá)到100 copies，并可根據(jù)擴(kuò)增產(chǎn)物的大小區(qū)分HPS P2蛋白基因的Ⅰ和Ⅱ兩個(gè)基因型，初步判定HPS的致病性。對(duì)32份呼吸道疾病臨床樣品的檢測(cè)結(jié)果顯示，HPS和Mhr陽(yáng)性率分別為59.4%和53.1%，雙重感染的樣品為34.4%。劉茂軍等[10]根據(jù)豬肺炎支原體（MHP）和Mhr的16S rRNA基因設(shè)計(jì)3條引物，建立MHP和Mhr的雙重PCR檢測(cè)方法，并對(duì)該方法進(jìn)行了特異性和敏感性試驗(yàn)。應(yīng)用建立的方法檢測(cè)了臨床樣品和疫苗樣品。結(jié)果顯示，該方法具有良好的特異性，最低可檢測(cè)到0.66 ng的MHP基因組DNA和0.58 ng Mhr基因組DNA。臨床樣品和疫苗樣品檢測(cè)結(jié)果與普通PCR檢測(cè)結(jié)果一致。

4 熒光PCR方法

熒光PCR是在常規(guī)PCR技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的一種高度靈敏的核酸定量技術(shù)，它融匯了傳統(tǒng)PCR技術(shù)靈敏、快速、特異的特點(diǎn)以及光譜技術(shù)的高敏感性和高精確定量的優(yōu)點(diǎn)，檢測(cè)速度快、敏感性高，可直接觀察擴(kuò)增結(jié)果，不需要后續(xù)電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物，減少了對(duì)環(huán)境氣溶膠污染的可能，避免了假陽(yáng)性結(jié)果。據(jù)信號(hào)基團(tuán)的不同，實(shí)時(shí)熒光定量PCR可以分為染料法和探針?lè)▋煞N。白方方等[11]根據(jù)GenBank中登錄的Mhr P37基因序列設(shè)計(jì)并合成引物及MGB探針，構(gòu)建含有P37基因的重組質(zhì)粒，以其為標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并檢測(cè)該方法的特異性、敏感性和重復(fù)性。結(jié)果顯示該方法具有良好的特異性，與豬肺炎支原體、豬絮狀支原體、豬滑液支原體、雞毒支原體、副豬嗜血桿菌、豬胸膜肺炎放線桿菌、豬圓環(huán)病毒、豬瘟病毒及豬流感病毒無(wú)交叉反應(yīng)，對(duì)Mhr的檢測(cè)敏感性為10 copies/μL，并且穩(wěn)定性好，變異系數(shù)小于2%。利用建立的熒光定量PCR方法對(duì)55份臨床樣品進(jìn)行檢測(cè)，陽(yáng)性檢出率為87.3%（48/55），而分離培養(yǎng)方法和普通PCR的陽(yáng)性檢出率分別為41.8%（23/55）和29.1%（16/55）。武昱孜等[12]根據(jù)MHP P97序列和Mhr P37序列的特異性引物，分別標(biāo)記FAM和Texas Red熒光報(bào)告基團(tuán)的2條TaqMan探針，建立和優(yōu)化雙重實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)條件和體系，同時(shí)檢測(cè)其敏感性、特異性和重復(fù)性。建立的雙重?zé)晒舛縋CR對(duì)豬肺炎支原體和Mhr的最低檢測(cè)值均為10 copies/μL，與豬源致病菌、病毒和其他常見(jiàn)細(xì)菌均無(wú)交叉反應(yīng)，各濃度標(biāo)準(zhǔn)品的Ct值變異系數(shù)小于5%，重復(fù)性好。檢測(cè)72份臨床樣本，其中豬肺炎支原體的肺陽(yáng)性率為80%，鼻拭子陽(yáng)性率為22%，支氣管肺泡灌洗液陽(yáng)性率為58.33%，Mhr的肺陽(yáng)性率為40%，鼻拭子陽(yáng)性率為66%，支氣管肺泡灌洗液陽(yáng)性率為41.67%。

5 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（LAMP）方法是日本學(xué)者Notomi等發(fā)明的一種新的適用于基因診斷的恒溫核酸擴(kuò)增技術(shù)，不需要復(fù)雜的儀器設(shè)備，一臺(tái)水浴鍋或恒溫箱就能實(shí)現(xiàn)反應(yīng)，結(jié)果可通過(guò)肉眼觀察白色渾濁或綠色熒光的生成來(lái)判斷，簡(jiǎn)便快捷，具有靈敏度高、操作簡(jiǎn)單、反應(yīng)時(shí)間短、臨床使用不需要特殊的儀器等優(yōu)點(diǎn)，特別適合在現(xiàn)場(chǎng)和基層部門應(yīng)用。劉博婷等[13]以Mhr的P37基因序列為靶基因，設(shè)計(jì)1組特異性引物，對(duì)反應(yīng)體系的引物濃度、MgSO4、dNTPs、反應(yīng)溫度和時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化，并進(jìn)行了特異性和靈敏度試驗(yàn)，旨在建立Mhr的簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確的分子檢測(cè)方法。同時(shí)應(yīng)用所建立的方法對(duì)臨床樣品進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，最佳反應(yīng)體系為MgSO46 mmol/L，dNTPs 1.2 mmol/L， 內(nèi)引物（FIP/BIP）1.6 μmol/L，外引物（F3/B3）0.2 μmol/L，Bst DNA 聚合酶8 U，60℃擴(kuò)增60 min。靈敏度是常規(guī)PCR的100倍，并且與其他病原菌無(wú)任何交叉反應(yīng)。對(duì)23份呼吸道疾病臨床樣品進(jìn)行檢測(cè)的結(jié)果顯示，普通PCR和LAMP的檢出率分別為23.4%和79.6%。

6 小結(jié)

疾病的正確診斷是進(jìn)行有效防控的前提和基礎(chǔ)，隨著規(guī)?；B(yǎng)殖的發(fā)展，臨床上的豬病變得越來(lái)越復(fù)雜，老病新發(fā)和疾病混感現(xiàn)象增加，很難通過(guò)臨床表現(xiàn)和眼觀病變?cè)\斷疾病，需要通過(guò)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)進(jìn)行精準(zhǔn)診斷，從而及時(shí)采取有效的措施，降低損失。Mhr是豬只體內(nèi)的常在菌，當(dāng)豬受到應(yīng)激時(shí)，容易發(fā)病，近年來(lái)，引起了廣泛關(guān)注，可與多種疾病混感后繼發(fā)多種疾病，給養(yǎng)豬業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。傳統(tǒng)的病原分離方法操作繁瑣，耗時(shí)長(zhǎng)，對(duì)臨床疾病的診斷不實(shí)用，血清學(xué)方法不能判定是否現(xiàn)癥感染，只能說(shuō)明豬只以前曾經(jīng)感染過(guò)Mhr，結(jié)合豬群表現(xiàn)出的臨床癥狀和病變表現(xiàn)，進(jìn)行分子生物學(xué)檢測(cè)，是當(dāng)前診斷該病最可靠的方法。當(dāng)前有多種Mhr分子生物學(xué)檢測(cè)方法，但各有利弊，常規(guī)PCR方法雖然檢測(cè)速度快、特異性強(qiáng)，但不能定量，且檢測(cè)敏感性不高。熒光PCR方法雖然克服了常規(guī)PCR的缺陷，但儀器和探針的合成價(jià)格昂貴，檢測(cè)成本比較高，不適合基層應(yīng)用。LAMP方法雖然簡(jiǎn)單、方便，適合基層進(jìn)行推廣應(yīng)用，但靈敏度太高，易出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果。隨著技術(shù)的不斷發(fā)展，已經(jīng)出現(xiàn)了免核酸提取熒光PCR擴(kuò)增技術(shù)、便攜式熒光PCR儀器及除模板外PCR組份凍干保存技術(shù)，如能應(yīng)用于Mhr分子檢測(cè)，必將開(kāi)發(fā)出更方便、更快捷、成本更低的病毒分子檢測(cè)技術(shù)，方便疾病快速確診，從而更好地做好Mhr的防控工作。進(jìn)行病料檢測(cè)時(shí)一定要選擇合適的病料樣品，活豬可采集鼻腔式子，具體做法為將棉簽伸入豬鼻中隔刺激，豬打3次噴嚏后，拔出棉簽，pH 7.4 PBS液中4℃冰箱浸泡過(guò)夜，10 000 r/min離心5 min，取沉淀提取基因組DNA。死亡豬可采集病變與健康交界處肺臟組織。針對(duì)Mhr無(wú)有效疫苗預(yù)防，雖可用林可霉素、大環(huán)內(nèi)酯類藥物治療，但容易產(chǎn)生耐藥性，效果不理想，只能采取綜合性防控措施，如加強(qiáng)飼養(yǎng)管理，提高豬只機(jī)體抗病力。飼喂優(yōu)質(zhì)全價(jià)配合飼料，不喂霉變飼料。豬舍加強(qiáng)保溫，保持豬舍清潔衛(wèi)生，做好消毒工作，定期通風(fēng)、降低氨氣濃度、減少飼養(yǎng)密度、減少應(yīng)激以降低Mhr相關(guān)疾病發(fā)病率和病情的嚴(yán)重程度。