布魯氏菌病虎紅平板凝集試驗(yàn)的影響因素及注意事項(xiàng)

劉坤洋

（遼寧省農(nóng)業(yè)發(fā)展服務(wù)中心，遼寧 沈陽(yáng) 110164）

目前，布魯氏菌抗體檢測(cè)仍是我國(guó)布病診斷最常用、最主要的檢測(cè)方法。其中虎紅平板凝集試驗(yàn)（RBPT）具有試驗(yàn)試劑成本低廉、操作簡(jiǎn)便、快速、檢出率高等優(yōu)勢(shì)，被廣泛應(yīng)用于布病的大規(guī)模篩查，同時(shí)由于本方法不需要特殊的試驗(yàn)設(shè)備，更適于基層實(shí)驗(yàn)室和現(xiàn)場(chǎng)試驗(yàn)。現(xiàn)將RBPT中的影響檢測(cè)結(jié)果的因素及應(yīng)注意的問(wèn)題進(jìn)行簡(jiǎn)要分析。

1 RBPT的影響因素

1.1 RBPT抗原

RBPT抗原的質(zhì)量是影響布病血清學(xué)試驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確性的關(guān)鍵性因素之一，不同廠家的抗原對(duì)同一批血清樣本的檢測(cè)結(jié)果存在不同程度的差異，如果RBPT的假陽(yáng)性率過(guò)高，不僅造成工作量加大，也會(huì)造成不必要的經(jīng)濟(jì)損失。

1.2 血清

血清質(zhì)量也是影響布病血清學(xué)試驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確性的重要因素之一，而采集的時(shí)間與分離方式直接影響血清的質(zhì)量。用于RBPT的血清最好是新鮮、清亮透明、無(wú)溶血、防止細(xì)菌污染，并且避免反復(fù)凍融。纖維蛋白原能與虎紅抗原產(chǎn)生非特異性凝集反應(yīng)，而且纖維蛋白原含量越高凝集反應(yīng)發(fā)生的越快、越強(qiáng)。因此，如果待檢血清中含有纖維蛋白原也會(huì)出現(xiàn)RBPT假陽(yáng)性結(jié)果，嚴(yán)重影響檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

1.3 溫度

試驗(yàn)時(shí)，RBPT抗原與被檢樣品的溫度、環(huán)境溫度對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性也有很大影響。RBPT用的抗原需要恢復(fù)至室溫（22±4℃），并且使用前要充分混合均勻。血清與溫度和時(shí)間成反比關(guān)系，放置血清的時(shí)間越短，溫度越低，假陽(yáng)性率越高。由此可見(jiàn)，在一定溫度范圍內(nèi)，溫度越高，血清學(xué)反應(yīng)進(jìn)行的越快。本試驗(yàn)要求在室溫下進(jìn)行，因此，在試驗(yàn)前要注意觀察環(huán)境溫度是否適合進(jìn)行本試驗(yàn)。

1.4 藥物

血清中的藥物濃度也會(huì)干擾檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性，在經(jīng)過(guò)治療后或治療期間血清凝集不明顯。因此，在血液樣品采集前除了要查明動(dòng)物的免疫背景，還要查清動(dòng)物的患病及治療情況，以免出現(xiàn)誤診、漏診現(xiàn)象。

1.5 試驗(yàn)操作

RBPT雖然操作簡(jiǎn)便，但在試驗(yàn)過(guò)程中操作是否規(guī)范、抗原及血清加入的量是否準(zhǔn)確并混勻、結(jié)果判定的時(shí)間是否準(zhǔn)確等因素也會(huì)影響試驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

2 注意事項(xiàng)

2.1 對(duì)照的設(shè)立

每次試驗(yàn)時(shí)必須設(shè)立標(biāo)準(zhǔn)陰性、陽(yáng)性血清對(duì)照，用以判斷試驗(yàn)是否成立。同時(shí)在試驗(yàn)前應(yīng)使用弱陽(yáng)性對(duì)照血清確定試驗(yàn)條件的敏感性。

2.2 試劑的保存及使用

RBPT抗原應(yīng)用OIE標(biāo)準(zhǔn)血清校準(zhǔn)過(guò)的血清進(jìn)行最后標(biāo)化，于4℃暗處保存，避免凍結(jié)和污染。試驗(yàn)時(shí)使用的抗原應(yīng)與用0.5%石碳酸生理鹽水1/45稀釋的OIE標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清出現(xiàn)清晰的陽(yáng)性反應(yīng)，而不與1/55稀釋的血清反應(yīng)。為了避免RBPT抗原被污染，降低溫度變化對(duì)抗原靈敏度的影響，可以每次試驗(yàn)前只取出足夠本次試驗(yàn)用的抗原量。

2.3 血清

采集的血液樣本在分離血清之前，避免長(zhǎng)時(shí)間晃動(dòng)以及與冰袋接觸，以免發(fā)生溶血。為了分離到合格的血清樣本，最好在早晨喂料前或停食后6小時(shí)進(jìn)行采血，將裝有血液的注射器或采血管擺成斜面，以促進(jìn)血清更好的析出。除特殊要求外，用于血清學(xué)試驗(yàn)時(shí)采集血液樣本時(shí)不要加抗凝劑，以免影響對(duì)檢測(cè)結(jié)果做出正確的判定。血清樣品在使用前一定要上下顛倒混勻，對(duì)于冰凍保存的血清樣品應(yīng)充分融化后再進(jìn)行試驗(yàn)。

2.4 試驗(yàn)操作

雖然RBPT操作易于掌握，結(jié)果判定直觀，但在試驗(yàn)過(guò)程中所用抗原和血清量都很少，試驗(yàn)時(shí)加入的量一定要準(zhǔn)確。抗原與血清混合均勻后室溫輕微搖晃4分鐘后立即判定結(jié)果，若抗原抗體反應(yīng)超過(guò)4分鐘后也會(huì)產(chǎn)生假陽(yáng)性結(jié)果。

3 討論

RBPT作為快速、準(zhǔn)確篩查布魯氏菌病特異性抗體的簡(jiǎn)便方法，不僅反應(yīng)敏感穩(wěn)定，同時(shí)由于抗原的pH為3.65±0.05，可抑制引起非特異性反應(yīng)的IgM、增強(qiáng)特異性IgG的活性，也具有較好的特異性。但在試驗(yàn)操作過(guò)程中要嚴(yán)格按照標(biāo)準(zhǔn)的操作規(guī)程進(jìn)行，注意影響試驗(yàn)的各種因素，降低各種因素對(duì)試驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確性的影響。