環(huán)狀RNA在椎間盤退變中的作用機(jī)制及臨床價值

張凱，施錦濤，張曉勃，王克平，周海宇,*

1蘭州大學(xué)第二醫(yī)院骨科，蘭州 730030；2甘肅省骨與關(guān)節(jié)疾病研究重點實驗室，蘭州 730030；3蘭州市西固區(qū)人民醫(yī)院骨科，蘭州 730060

腰背痛是骨關(guān)節(jié)疾病最常見的癥狀之一，與椎間盤退變(intervertebral disc degeneration，IDD)密切相關(guān)[1]。據(jù)統(tǒng)計，有75%～80%的人群在生活中經(jīng)歷過這種疼痛[2]。IDD導(dǎo)致的病理改變主要包括髓核(nucleus pulposus，NP)細(xì)胞凋亡和細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)分解，而目前的治療以緩解癥狀為主，并不能逆轉(zhuǎn)IDD的病理改變。最新研究發(fā)現(xiàn)，環(huán)狀RNA(circular RNAs，circRNAs)作為內(nèi)源性競爭RNA能夠自發(fā)地與微小RNA(microRNA，miRNA)結(jié)合，調(diào)控IDD相關(guān)基因的表達(dá)，通過影響髓核細(xì)胞凋亡、ECM穩(wěn)態(tài)，誘導(dǎo)促炎因子表達(dá)及調(diào)節(jié)壓力負(fù)荷等方式參與IDD的病理過程[3]。本文對近年來circRNAs在IDD發(fā)病機(jī)制中的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述，旨在為IDD的診斷和治療提供參考。

1 CircRNA概況

CircRNA是一種普遍存在于真核生物中的新型非編碼RNA(noncoding RNA，ncRNA)，是由單鏈線性RNA的首尾端以3'，5'-磷酸二酯鍵形成的閉合環(huán)狀分子[4]。1976年，Sanger等[5]在研究類病毒RNA時發(fā)現(xiàn)了一種無蛋白外殼包裹的單鏈閉合環(huán)狀RNA，首次證實了circRNAs的存在。但受限于當(dāng)時的研究技術(shù)及檢測水平，其發(fā)現(xiàn)并未引起研究者的廣泛關(guān)注。隨著高通量測序和生物信息學(xué)技術(shù)的廣泛應(yīng)用，越來越多的circRNAs相繼被發(fā)現(xiàn)和報道[6-9]，其生物學(xué)功能相關(guān)研究也更加深入。

CircRNAs由來源于外顯子和(或)內(nèi)含子的核酸片段組成，根據(jù)來源不同可分為外顯子circRNA (ecRNA)、內(nèi)含子circRNA(ciRNA)和外顯子-內(nèi)含子circRNA(EIciRNA)。這些核酸片段通過不同的排列組合組成了數(shù)量龐大的circRNAs庫，目前人體中明確存在的circRNAs至少在14萬種以上[10]，研究其功能對人們了解疾病的發(fā)展進(jìn)程起著至關(guān)重要的作用。根據(jù)目前的研究結(jié)果，可將其生物學(xué)功能總結(jié)為以下幾方面：①作為內(nèi)源性競爭RNA(ceRNA)。CircRNAs具有大量的miRNA應(yīng)答元件(miRNA response element，MRE)，能夠競爭性結(jié)合miRNA，繼而抑制miRNA發(fā)揮其生物學(xué)功能，如circCCDC9能結(jié)合miR-6792-3p并抑制miRNA對靶基因CAV1的調(diào)控作用，繼而延緩胃癌的發(fā)展[11]。②調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄。CircRNAs能與mRNA結(jié)合并參與mRNA的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，如circ_406961可與白細(xì)胞介素增強(qiáng)結(jié)合因子2(ILF2)相互作用，影響其對轉(zhuǎn)錄激活因子3(STAT3)和絲裂源蛋白激酶8(MAPK8)的磷酸化[12]。③與蛋白產(chǎn)生交互作用。如circPABPN1可與RNA結(jié)合蛋白HuR結(jié)合，抑制后者與核多聚腺苷酸結(jié)合蛋白(PABPN1)mRNA的結(jié)合，降低PABPN1翻譯的效率[13]。④直接翻譯合成蛋白質(zhì)。CircRNAs可像mRNA一樣作為模板并指導(dǎo)蛋白質(zhì)的合成，如circSHPRH可以編碼一種新肽SHPRH-146aa，能防止SNF2組蛋白連接子PHD環(huán)解旋酶(SHPRH)被E3連接酶降解[14]。除上述主要生物學(xué)功能外，circRNAs還可通過調(diào)控細(xì)胞間信號傳遞、調(diào)節(jié)細(xì)胞分化、充當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)支架等[15-16]方式參與疾病的發(fā)生發(fā)展。

2 CircRNAs與椎間盤退行性疾病

椎間盤退行性疾病(intervertebral disc degeneration disease，DDD)是一種以IDD為特征性改變的脊柱關(guān)節(jié)疾病，也是臨床上引起腰背痛的主要原因。正常的椎間盤由中心的髓核、外層的纖維環(huán)和上下軟骨終板組成，其中髓核是維持椎間盤功能的主要部分，可通過產(chǎn)生ECM、分泌促炎因子、緩沖壓力負(fù)荷等方式保持椎間盤的完整性[17]。目前引起IDD的確切病因仍不清楚，可能與髓核細(xì)胞凋亡、ECM代謝失衡、炎性因子增多、壓力負(fù)荷過度和軟骨終板變性等多種因素相關(guān)[18]。隨著測序技術(shù)和生物信息學(xué)的廣泛應(yīng)用，越來越多的研究發(fā)現(xiàn)circRNAs參與調(diào)控IDD相關(guān)基因的表達(dá)，可通過影響髓核細(xì)胞凋亡、破壞ECM穩(wěn)態(tài)、誘導(dǎo)促炎因子表達(dá)等方式調(diào)節(jié)IDD的病理過程。

3 CircRNAs在IDD中的作用

3.1 CircRNAs與髓核細(xì)胞凋亡 凋亡是機(jī)體為維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)而自主控制的程序性細(xì)胞死亡過程，正常椎間盤的增殖和凋亡保持相對穩(wěn)定，但年齡增長、過度的壓力負(fù)荷及炎癥反應(yīng)等因素都會引起髓核細(xì)胞過度凋亡，使椎間盤的正常結(jié)構(gòu)難以維持，加速其退變過程，所以維持髓核細(xì)胞數(shù)量穩(wěn)定在椎間盤退變過程中至關(guān)重要。Guo等[19]通過生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)circGRB10與miR-328-5p之間存在負(fù)向調(diào)控關(guān)系；應(yīng)用RT-qPCR技術(shù)對比40對樣本中circGRB10和miR-328-5p的表達(dá)水平發(fā)現(xiàn)，退變的髓核細(xì)胞中circGRB10表達(dá)下降而miR-328-5p表達(dá)上升。隨后，通過實驗驗證了circGRB10可結(jié)合miR-328-5p并導(dǎo)致細(xì)胞增殖相關(guān)靶基因通過酪氨酸激酶受體(ERBB2)通路表達(dá)上調(diào)，抑制髓核細(xì)胞凋亡。Xie等[20]也在分析circRNAs芯片數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)上發(fā)現(xiàn)，circERCC2在椎間盤退變過程中低表達(dá)，并通過體內(nèi)和體外實驗證實circERCC2可通過與miR-182-5p結(jié)合而調(diào)控去乙酰化酶SIRT1(Sirtuin1)的表達(dá)，而SIRT1又可通過SIRT1/Parkin途徑調(diào)控細(xì)胞的自噬和凋亡[21-24]。Cui等[25]通過siRNA干擾髓核細(xì)胞中circ_001653的表達(dá)并進(jìn)行流式細(xì)胞檢測發(fā)現(xiàn)，與對照組比較，干擾組中G1期細(xì)胞數(shù)量減少而S期細(xì)胞數(shù)量增多，說明circ_001653能夠抑制髓核細(xì)胞增殖。此外，circVMA21能通過影響X連鎖凋亡抑制蛋白(XIAP)的表達(dá)而調(diào)控髓核細(xì)胞凋亡，加快或延緩IDD進(jìn)程[26]。

3.2 CircRNAs與ECM穩(wěn)態(tài) ECM是髓核細(xì)胞生存的微環(huán)境，主要由膠原蛋白、聚蛋白聚糖、非膠原蛋白、彈性纖維、糖蛋白及水組成，其中Ⅱ型膠原蛋白和聚蛋白聚糖是維持椎間盤正常結(jié)構(gòu)和功能的最重要成分。在正常椎間盤中，ECM的分解和合成相對穩(wěn)定，各種原因引起的ECM分解增加都會對椎間盤的正常結(jié)構(gòu)和功能產(chǎn)生不良影響，如Ⅱ型膠原蛋白和聚蛋白聚糖過度分解會引起纖維環(huán)溶解，髓核脫水和纖維化，以及軟骨終板鈣化[27]，還會使ECM的吸水性減弱、含水量降低，導(dǎo)致椎間盤不能耐受壓力，髓核細(xì)胞也會因為缺乏營養(yǎng)物質(zhì)和生長因子而凋亡，繼而加速IDD過程[28]。目前研究發(fā)現(xiàn)，circRNAs調(diào)控ECM主要通過影響ECM代謝和調(diào)控促炎因子的表達(dá)兩種方式。

3.2.1 CircRNAs與ECM代謝 基質(zhì)金屬蛋白酶(M M Ps)及血小板反應(yīng)蛋白去整合素金屬肽酶(ADAMTSs)是降解ECM中膠原蛋白和聚蛋白聚糖的主要酶。研究顯示，MMPs和ADAMTSs在IDD組織中表達(dá)升高，而抑制其表達(dá)可促進(jìn)ECM修復(fù)并延緩IDD進(jìn)程[29]。Guo等[30]通過RT-qPCR技術(shù)對比了正常和退變的髓核組織，發(fā)現(xiàn)circFAM169A在退變組織中表達(dá)增高，隨后通過細(xì)胞實驗證實circFAM169A能通過miR-583/BTRC途徑激活NF-κB通路，促進(jìn)髓核細(xì)胞中MMP-13和ADAMTS-5的合成，進(jìn)而降低ECM中Ⅱ型膠原蛋白和聚蛋白聚糖的含量，促進(jìn)IDD的發(fā)生。Cui等[25]通過分析芯片數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，circ_001653在椎間盤退變組織中高表達(dá)，且circ_001653能下調(diào)miR-486-3p介導(dǎo)的細(xì)胞遷移，從而誘導(dǎo)透明質(zhì)酸結(jié)合蛋白(CEMIP)的表達(dá)，促進(jìn)MMP-3、MMP-13和ADAMTS-4、ADAMTS-5的合成，影響ECM中Ⅱ型膠原蛋白和聚蛋白聚糖的含量，加速IDD進(jìn)程。除了能促進(jìn)ECM分解外，部分circRNAs還可抑制MMPs和ADAMTSs的表達(dá)，從而抑制膠原蛋白和蛋白聚糖的過度降解，延緩IDD進(jìn)程。Chen等[31]應(yīng)用免疫熒光和Western blotting檢測發(fā)現(xiàn)，circGLCE在退變組織中表達(dá)下降，而circGLCE能抑制MMP-13和ADAMTS-4的合成、增加ECM中Ⅱ型膠原蛋白和蛋白多糖的含量，表明circGLCE在IDD過程中起保護(hù)作用。Song等[32]發(fā)現(xiàn)，circRNA_104670可以與miR-17-3p直接結(jié)合，而miR-17-3p的靶基因為MMP-2，所以circRNA_104670能間接調(diào)控MMP-2的表達(dá)，延緩ECM中Ⅱ型膠原蛋白的分解。此外，circRNAs還能通過影響炎性因子的表達(dá)、調(diào)節(jié)壓力負(fù)荷誘導(dǎo)的基質(zhì)降解等方式，間接延緩IDD的進(jìn)程，如circ_4099、circCIDN等[33-34]。

3.2.2 CircRNAs與促炎因子 研究表明，促炎因子增多也是IDD的主要特征之一，其能刺激神經(jīng)內(nèi)生長并引起神經(jīng)性疼痛，是造成腰背痛的主要原因[35]。促炎因子如腫瘤壞死因子(TNF)、白細(xì)胞介素(IL)和干擾素(IFN)等，主要由髓核細(xì)胞分泌[36]，其中TNF-α和IL-1β的研究最為深入。IL-1β和TNF-α能誘導(dǎo)ECM降解相關(guān)酶基因的表達(dá)，如MMP-1、3、7、9、13和ADAMTS-1、4、5、9、15等，所以抑制促炎因子的表達(dá)能維持ECM穩(wěn)態(tài)、緩解椎間盤退變[37]。目前研究發(fā)現(xiàn)，多種circRNAs可作為ceRNA與miRNAs結(jié)合，調(diào)控下游促炎因子的表達(dá)，影響IDD的病理進(jìn)程。Guo等[30]研究發(fā)現(xiàn)，circFAM169A在退變的髓核組織中高表達(dá)，且能作為miR-583的ceRNA與其競爭性結(jié)合，影響miR-583對下游靶基因BTRC的調(diào)控，而BTRC能使NF-κB的結(jié)合物降解，激活NF-κB通路誘導(dǎo)的IL-1β和TNF-α的表達(dá)，上述促炎因子已被證實可以降解ECM、加重IDD[37]。Cui等[25]的研究發(fā)現(xiàn)，circ_001653能通過與miR-486-3p競爭性結(jié)合，間接調(diào)控其靶基因CEMIP介導(dǎo)的TNF-α和IL-1β表達(dá)，致使促炎因子介導(dǎo)的ECM降解作用增強(qiáng)。Wang等[38]通過研究IL-1β介導(dǎo)的IDD模型發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)的circSEMA4B能競爭性結(jié)合miR-431，促進(jìn)Wnt/β-catenin通路介導(dǎo)的ECM分解。此外，TNF-α還能通過NF-κB/MAPK通路誘導(dǎo)circ_4099的表達(dá)，而升高的circ_4099能通過miR-6161-5p/Sox9信號軸調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子Sox9對Ⅱ型膠原蛋白和聚蛋白聚糖的表達(dá)，起到維持ECM穩(wěn)態(tài)和保護(hù)椎間盤的作用[33]。

3.3 CircRNAs與壓力負(fù)荷 椎間盤作為一個吸收和緩沖機(jī)械應(yīng)力的結(jié)構(gòu)，在日常生活中會受到不同程度的壓力負(fù)荷。研究表明，過度的壓力負(fù)荷會增加普通人群患IDD的風(fēng)險，而且機(jī)械應(yīng)力也是導(dǎo)致椎間盤重塑的主要原因[39]。已有研究證實，過度的壓力負(fù)荷會誘導(dǎo)髓核細(xì)胞凋亡和ECM降解，加速IDD進(jìn)程[40-41]。Xiang等[34]初次揭示了壓力損傷中circRNAs的作用，通過對比壓力損傷的髓核細(xì)胞和正常髓核細(xì)胞中circRNAs的表達(dá)變化發(fā)現(xiàn)，circCIDN在壓力損傷細(xì)胞中表達(dá)顯著降低。隨后，通過分析StarBase和TargetScan數(shù)據(jù)庫，預(yù)測circCIDN可能通過與miR-34a-5p結(jié)合，影響其靶基因SIRT1對髓核細(xì)胞自噬、凋亡以及衰老的調(diào)控功能，并通過細(xì)胞和動物實驗進(jìn)行了驗證。此外，軟骨終板變性也是IDD的主要改變之一。Xiao等[42]研究發(fā)現(xiàn)，壓力負(fù)荷能夠誘導(dǎo)終板軟骨細(xì)胞表達(dá)circRNA_0058097，而后者可通過miR-365a-5p/HDAC4通路導(dǎo)致終板軟骨細(xì)胞退變。所以，壓力負(fù)荷導(dǎo)致的circRNAs改變也在IDD過程中起到重要作用。圖1簡要總結(jié)了上述與IDD相關(guān)的circRNAs的表達(dá)差異及作用機(jī)制，如circFAM169A在退變組織中表達(dá)升高，繼而競爭性結(jié)合miR-583，阻斷了miRNA對下游BTRC/NF-κB通路的抑制作用，該通路激活會誘導(dǎo)TNF-α和IL-1β的表達(dá)，促進(jìn)ECM降解，加重IDD。

4 CircRNAs的臨床研究價值

4.1 作為疾病診斷的標(biāo)志物 CircRNAs的特殊閉環(huán)結(jié)構(gòu)能夠保護(hù)其不受核酸外切酶的影響，所以較線性RNA分子更加穩(wěn)定。有研究顯示，circRNAs的半衰期是線性RNA的2.5倍[43]。CircRNAs具有穩(wěn)定性好、表達(dá)豐度高的特點，且在不同疾病中存在明顯的表達(dá)差異，在疾病的臨床診斷中具有潛在的實用價值[44]。表1總結(jié)了部分可作為骨科疾病診斷標(biāo)志物的circRNAs。隨著circRNAs研究的不斷深入，將來會有更多與疾病相關(guān)的circRNAs被發(fā)現(xiàn)并運(yùn)用到各種疾病的診斷中。

圖1 CircRNAs在椎間盤退變組織中的表達(dá)差異及作用機(jī)制Fig.1 Expression differences and mechanisms of circRNAs in the degenerative tissue of intervertebral disc

表1 常見骨科疾病的診斷標(biāo)志物circRNAsTab.1 The circRNAs as biomarkers in common orthopedic diseases

4.2 作為疾病的靶向治療藥物 隨著對外泌體研究的不斷深入，人們發(fā)現(xiàn)其包含的內(nèi)容物非常廣泛，包括各種生長因子、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、核酸和circRNAs等[51]，而且外泌體中含有的circRNAs豐富且穩(wěn)定，并可在外周循環(huán)和尿液中檢測到[52]。最近研究發(fā)現(xiàn)，包含circRNA_0000253的外泌體在退變組織中含量最高，且能通過miR-141-5p/SIRT1軸促進(jìn)IDD，表明circRNAs可通過外泌體轉(zhuǎn)運(yùn)的方式轉(zhuǎn)移至不同組織而發(fā)揮生物學(xué)功能，這為生物治療(包括基因靶向治療)提供了理論依據(jù)，使其有望成為一種新型的靶向治療藥物[53]。

綜上所述，近年來，IDD的發(fā)病率逐年增高且發(fā)病人群呈年輕化趨勢，目前最有效的治療措施仍是外科手術(shù)，雖然手術(shù)治療能緩解或消除患者的癥狀，但并不能逆轉(zhuǎn)IDD的進(jìn)程，所以亟需新的有效的治療手段。隨著芯片測序和生物信息學(xué)的快速發(fā)展，越來越多的研究證實circRNAs在多種疾病的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著重要調(diào)控作用。目前研究發(fā)現(xiàn)，circRNAs在IDD進(jìn)程中主要充當(dāng)ceRNA而發(fā)揮miRNA“海綿”的作用，通過結(jié)合miRNAs影響其對靶基因轉(zhuǎn)錄和翻譯的調(diào)控，而circRNAs在IDD中是否具有其他生物學(xué)功能仍需進(jìn)一步研究。由于circRNAs具有穩(wěn)定性、保守性及組織特異性等特點，并且能通過外泌體轉(zhuǎn)運(yùn)至靶組織發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)，其在疾病篩查、診斷和藥物靶向治療方面具有巨大潛能，因此未來需進(jìn)一步研究circRNAs在IDD診斷和治療中的作用。