自噬調(diào)控因子mTOR對心肌缺血再灌注損傷的作用機(jī)制研究進(jìn)展

韓利民，羅小紅，趙海龍*

1遵義醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室，貴州遵義 563000；2重慶市長壽區(qū)人民醫(yī)院病理科，重慶 401220

缺血性心臟病已成為我國居民死亡的第二大病因，臨床上采用經(jīng)皮冠狀動脈介入治療(percutaneous coronary intervention，PCI)可有效地改善心肌灌注，是降低患者病死率的重要措施[1]。 但心肌缺血后血流再灌注常會對心肌產(chǎn)生二次損傷，該過程被稱為心肌缺血再灌注(ischemia/reperfusion，I/R)損傷。據(jù)統(tǒng)計，美國每年約有66萬人因初發(fā)急性心肌梗死死亡，約30萬人因再發(fā)心肌梗死死亡[2]。探索更多治療PCI術(shù)后心肌I/R損傷的策略仍然是現(xiàn)階段亟待解決的問題之一。

自噬是細(xì)胞通過單層或雙層膜包裹待降解物形成自噬體，然后運(yùn)送到溶酶體形成自噬溶酶體，并進(jìn)行多種酶消化及降解的過程[3-4]。多項證據(jù)表明，自噬參與了心肌I/R損傷過程，自噬不足或過度均是引起心肌I/R損傷的重要原因，但其具體機(jī)制尚不完全清楚[5-7]。哺乳動物雷帕霉素靶點(mammalian target of rapamycin，mTOR)是自噬的重要調(diào)控因子，已被證實與腫瘤、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、代謝性疾病及心血管疾病等多種疾病息息相關(guān)[8-14]。近年來，有關(guān)心肌I/R損傷的體內(nèi)及體外研究表明，多種藥物均可通過mTOR調(diào)控自噬，從而在一定程度上改善心肌I/R損傷[6,15-18]。本文對mTOR在心肌I/R損傷中的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述，旨在明確自噬調(diào)控因子mTOR改善心肌I/R損傷的相關(guān)作用機(jī)制，以期為治療心肌I/R相關(guān)藥物的研發(fā)提供依據(jù)。

1 mTOR簡介

1.1 mTOR的結(jié)構(gòu) mTOR是哺乳動物中雷帕霉素的直接靶點，屬于磷脂酰肌醇-3激酶相關(guān)激酶(phosphatidylinositol-3-kinase PI3K related protein kinase，PIKK)家族成員。mTOR結(jié)構(gòu)包括氨基端20個串聯(lián)重復(fù)序列，羧基端的蛋白激酶結(jié)構(gòu)域，以及位于激酶上游的FRB、FAT兩個結(jié)構(gòu)域和下游的FATC結(jié)構(gòu)域[19]。mTOR與不同適配器蛋白結(jié)合可形成mTORC1及mTORC2兩種復(fù)合物。其中，mTOR調(diào)控蛋白(regulatory protein associated with mTOR，raptor)是mTORC1的核心元件之一，主要負(fù)責(zé)底物的募集；mLST8是其另一個核心元件，可激活激酶結(jié)構(gòu)域；40 ku大小的富含脯氨酸蛋白激酶B底物蛋白(proline-rich AKT substrate 40，PRAS40)、DEP結(jié)構(gòu)域含有雷帕霉素靶蛋白相互作用蛋白(DEP domain-containing mTOR interacting protein，deptor)與raptor作用，發(fā)揮負(fù)向調(diào)節(jié)mTORC1的功 能[20]。而mTORC2的活性區(qū)域是mTOR的雷帕霉素不敏感伴侶(rapamycin-insensitive companion of mTOR，rictor)，其功能是與底物結(jié)合；protor 1/2、mSin1通過與rictor結(jié)合以維持mTORC2的穩(wěn)定及活化[21]。

1.2 mTOR的生物學(xué)功能 mTOR是細(xì)胞生長發(fā)育的關(guān)鍵因子，在維持機(jī)體正常的生物學(xué)功能中起重要作用。Potter等[22]的研究證實，采用不同劑量的mTOR抑制劑雷帕霉素喂食果蠅幼蟲可導(dǎo)致其出現(xiàn)行為缺陷及發(fā)育遲緩。Sciarretta等[20]研究發(fā)現(xiàn)，mTOR基因敲除(mTOR-KO)的新生小鼠心肌細(xì)胞發(fā)育不良，在出生3周后可迅速出現(xiàn)擴(kuò)張型心肌病導(dǎo)致死亡。p70S6K是mTOR的下游基因，可控制細(xì)胞生長、增殖及分化等過程，mTOR可直接促使其磷酸化，從而使p70S6K激活[23]。同時，mTOR也可激活真核起始因子4F(eukaryotic translation initiation factor 4F，eIF4G)，并抑制4EBP1/2增強(qiáng)mRNA轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)蛋白質(zhì)合成[24]。此外，mTOR還可直接激活膽固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白(sterol regulatory element binding protein，SREBP)及過氧化物酶體增殖物激活受體γ(peroxisome proliferator activated receptor γ，PPARγ)，同時間接抑制Lipin1的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)脂質(zhì)合成[25]。

2 mTOR對自噬過程的影響及其調(diào)控機(jī)制

自噬過程通過溶酶體對非功能性蛋白進(jìn)行降解，可促使?fàn)I養(yǎng)物質(zhì)被機(jī)體重新利用，因此曾被看作是機(jī)體在各種應(yīng)激條件下(如缺血、缺氧等)的一種自我保護(hù)反應(yīng)[26]。mTOR是自噬的重要負(fù)性調(diào)控因子，可通過抑制自噬復(fù)合物ULK-ATG13-FIP200形成，從而抑制自噬過程的激活[27]。AMPK/mTOR及PI3K/AKT/mTOR是調(diào)控自噬的兩條重要信號通路，前者在能量不足時被激活，而后者在感受到胰島素等生長因子后被激活。Zeng等[28]發(fā)現(xiàn)，在心肌缺血階段，AMPK/mTOR信號通路被激活，電鏡下可觀察到心肌細(xì)胞自噬小體數(shù)量明顯增加。Wang等[29]發(fā)現(xiàn)，與正常大鼠相比，糖尿病性腦病大鼠模型中PI3k/AKT/mTOR信號增加，使自噬水平下降。由此可見，不同條件下mTOR介導(dǎo)的自噬在維持機(jī)體的穩(wěn)態(tài)中均發(fā)揮著重要作用。

3 mTOR對心肌缺血及再灌注階段的不同作用及其機(jī)制

自噬在心肌I/R損傷中具有雙重作用，適度自噬可促進(jìn)細(xì)胞存活，而過度自噬則會引起細(xì)胞發(fā)生自噬性死亡。mTOR在不同階段可通過不同機(jī)制調(diào)控自噬水平，減輕心肌細(xì)胞的損害。

3.1 mTOR在心肌缺血階段的作用及機(jī)制 Lin等[15]研究發(fā)現(xiàn)，在心肌缺血階段，mTOR因能量不足及缺氧被抑制，從而激活自噬過程，促進(jìn)心肌細(xì)胞存活。AMPK/mTOR是該過程誘導(dǎo)自噬激活的主要通路，心肌能量不足時，AMP/ATP上升，糖原合成酶激酶-3β(glycogen synthase kinase 3β，GSK-3β)也被激活，兩者可直接激活結(jié)節(jié)性硬化復(fù)合物1/2(tuberous sclerosis complex 1/2，TSC1/2)，抑制下游mTOR蛋白的表達(dá)。此外，還有其他機(jī)制參與抑制mTOR：①心肌能量不足及缺氧可分別激活p38調(diào)節(jié)活化蛋白激酶(p38-regulated/activated kinase，PRAK)、B淋巴細(xì)胞瘤-2基因/腺病毒E1B相互作用蛋白3(Bcl-2/adenovirus E1B 19-kD protein-interacting protein 3，BNIP3)，導(dǎo)致Rheb(腦中富含的Ras同源蛋白)失去結(jié)合GTP的能力，阻斷mTOR的激活[30]； ②心肌缺氧誘導(dǎo)產(chǎn)生的缺氧誘導(dǎo)因子α(hypoxia inducible factor-1α，HIF-α)激活發(fā)育及DNA損傷調(diào)節(jié)基因1(regulated in DNA damage and development 1，REDD1)后通過TSC1/2間接抑制mTOR[20](圖1)。

3.2 mTOR在再灌注階段的作用及機(jī)制 Shi等[5]發(fā)現(xiàn)，再灌注階段心肌細(xì)胞自噬水平明顯升高，其原因與Beclin 1的激活有關(guān)，而與AMPK/mTOR無關(guān)。具體機(jī)制如下：①該過程產(chǎn)生大量的活性氧(reactive oxygen species，ROS)通過ROS-JNK信號通路干擾Beclin 1/Bcl-2的相互作用，使Beclin 1從Bcl-2中游離出來，從而促進(jìn)自噬的發(fā)生[31]；②該過程的Ca2+超載促使鈣調(diào)素依賴性蛋白激酶Ⅱ(calcium/calmodulin-dependent protein kinase Ⅱ，CaMKⅡ)在Ser90位點直接磷酸化Beclin 1，促進(jìn)K63連接的Beclin 1泛素化并激活自噬[32]。以上機(jī)制最終使心肌細(xì)胞發(fā)生過度自噬，導(dǎo)致細(xì)胞死亡。此時，mTOR因血流恢復(fù)及炎性因子被激活，在一定程度上可抑制過度自噬，抵抗心肌I/R損傷。一方面，心肌血流恢復(fù)后，PI3K/AKT信號通路在激素、生長因子等的刺激下被激活，PRAS40對mTOR的抑制作用解除，同時還能抑制TSC1/2間接激活mTOR，最終抑制自噬過程。另一方面，大量ROS可觸發(fā)炎癥反應(yīng)，通過IKKβ/NF-κB信號通路抑制TSC1/2，最終導(dǎo)致mTOR被激活，從而抑制自噬[33](圖1)。Zeng等[28]發(fā)現(xiàn)，在心肌I/R階段，與對照組相比，西紅花苷處理可明顯減少心肌細(xì)胞凋亡，電鏡下心肌細(xì)胞自噬小體的數(shù)量明顯減少，其機(jī)制與AKT/mTOR信號通路激活有關(guān)。

4 基于mTOR的相關(guān)信號通路與心肌I/R損傷

mTOR作為自噬的重要調(diào)控因子，越來越多的證據(jù)表明，多種藥物可作用于mTOR相關(guān)信號通路，調(diào)控不恰當(dāng)?shù)淖允伤?，從而改善心肌I/R損傷，mTOR可能是治療心肌I/R損傷的潛在靶點。

4.1 PI3K/AKT/mTOR信號通路與心肌I/R損傷 PI3K/AKT/mTOR是一種調(diào)控自噬的經(jīng)典信號通路，與心血管疾病密切相關(guān)。Lin等[34]研究證實，促紅細(xì)胞生成素衍生肽即螺旋B表面肽(helix B surface peptide，HBSP)可通過激活PI3K/AKT/mTOR信號通路減輕心肌I/R誘導(dǎo)的過度自噬及細(xì)胞凋亡。Zhang等[35]發(fā)現(xiàn)，遠(yuǎn)程缺血后處理在體內(nèi)及體外均有對抗心肌I/R損傷的心臟保護(hù)作用，其機(jī)制與PI3K/mTOR信號通路上調(diào)乙醛脫氫酶2(ALDH2)的表達(dá)有關(guān)。此外，多項研究表明，多種藥物均可通過作用于PI3K/AKT/mTOR信號通路而抑制細(xì)胞過度自噬，在一定程度上減輕心肌I/R損傷(表1)。

圖1 mTOR對心肌缺血再灌注損傷的作用機(jī)制Fig.1 Mechanism of mTOR in myocardial ischemia-reperfusion injury

4.2 AMPK/mTOR信號通路與心肌I/R損傷AMPK是mTOR的上游抑制因子，對能量不足尤為敏感。Fu等[6]的研究表明，與對照組相比，天麻素預(yù)處理可通過增加自噬通量(p62蛋白水平下降、LC3Ⅱ蛋白水平增高)減輕小鼠心肌I/R損傷，其機(jī)制與p-AMPK升高及p-mTOR降低有關(guān)；加入AMPK特異性抑制劑后小鼠心肌自噬水平降低，心功能惡化，表現(xiàn)為左室射血分?jǐn)?shù)(left ventricular ejection fraction，LVEF)、左室短軸縮短分?jǐn)?shù)(left ventricular fraction shortening，LVFS)均明顯下降。Yang等[7]發(fā)現(xiàn)，一種分泌型脂肪因子絲氨酸蛋白酶抑制劑(vaspin)可依賴AMPK/mTOR的激活而上調(diào)自噬通量，抑制心肌細(xì)胞凋亡，而使用氯喹抑制自噬通量后則降低了vaspin的保護(hù)作用。此外，一項臨床研究證實，對PCI術(shù)后患者予以黃連素治療后，血漿C反應(yīng)蛋白(CRP)、TNF-α及IL-6水平較對照組均明顯降低，考慮與AMPK/mTOR激活有關(guān)[36]。綜上，AMPK/mTOR信號通路激活可提高細(xì)胞自噬水平，從而改善心肌I/R損傷。

表1 mTOR與心肌I/R損傷的相關(guān)研究Tab.1 Related researches on mTOR and myocardial I/R injury

4.3 其他mTOR信號通路與心肌I/R損傷 除PI3K/AKT/mTOR及AMPK/mTOR兩條重要信號通路外，還存在其他mTOR通路與心肌I/R損傷有關(guān)。Zhang等[17]發(fā)現(xiàn)，右美托咪定可減輕大鼠I/R后的心肌細(xì)胞凋亡、氧化應(yīng)激及炎性反應(yīng)，其機(jī)制與SIRT1/mTOR信號通路激活有關(guān)。Li等[46]研究證實，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞衍生的條件培養(yǎng)基可通過激活Notch2/mTOR信號通路降低H9C2細(xì)胞缺氧/復(fù)氧后的自噬水平，增強(qiáng)H9C2細(xì)胞活力，并減少ROS的產(chǎn)生。

5 總結(jié)與展望

目前臨床上對于PCI術(shù)后血流再灌注引起的心肌I/R損傷并無特效藥物，主要是對其機(jī)制進(jìn)行干預(yù)。自噬調(diào)控因子mTOR在改善心肌I/R損傷中發(fā)揮重要作用。心肌缺血階段，AMPK/mTOR通路的激活可增強(qiáng)自噬，促進(jìn)心肌細(xì)胞存活；而再灌注階段，PI3K/AKT/mTOR通路的激活可通過抑制過度自噬而減少心肌細(xì)胞死亡。因此，PCI術(shù)后使用藥物或其他方式激活mTOR可能是預(yù)防及治療心肌I/R 損傷的策略之一。此外，基于mTOR在心肌缺血階段的作用機(jī)制，對于僅合并輕度心肌缺血暫無PCI手術(shù)指征的大部分臨床患者，是否可通過抑制mTOR途徑減少缺血對心肌細(xì)胞的損傷尚需進(jìn)一步探討。