新型冠狀病毒S蛋白RBD的糖基化及其長度對蛋白疫苗免疫原性的影響

張 婷，王志榮，許雪梅

(中國醫(yī)學科學院基礎(chǔ)醫(yī)學研究所 北京協(xié)和醫(yī)學院基礎(chǔ)學院 生物物理及結(jié)構(gòu)生物學系， 北京 100005)

鑒于目前尚無新型冠狀病毒(severe acute respiratory coronavirus 2, SARS-CoV-2)特效治療藥物，疫苗是控制SARS-CoV-2大流行的關(guān)鍵措施。目前已有多種不同形式的疫苗進入臨床試驗[1]，包括滅活疫苗、病毒載體疫苗、核酸疫苗及蛋白疫苗，其中蛋白疫苗誘發(fā)產(chǎn)生的中和抗體水平較高[2]。迄今上市的采用非傳統(tǒng)技術(shù)生產(chǎn)的疫苗均為蛋白疫苗，如乙肝病毒樣顆粒(virus-like particle, VLP)疫苗、HPV VLP疫苗、帶狀皰疹病毒糖蛋白疫苗及流感蛋白疫苗，該類疫苗安全性好，且在誘發(fā)中和抗體方面具有優(yōu)勢。

SARS-CoV-2為有包膜的正鏈RNA病毒，與SARS-CoV及中東呼吸道綜合征冠狀病毒(Middle East respiratory syndrome coronavirus，MERS-CoV)同屬冠狀病毒β屬，均可誘發(fā)急性呼吸系統(tǒng)綜合征，其中SARS-CoV-2和SARS-CoV的同源性很高[3]。病毒有4種結(jié)構(gòu)蛋白(S、M、N、E)，其中S蛋白是感染入侵的關(guān)鍵蛋白，以三聚體形式分布在包膜表面，其N端含有細胞受體結(jié)合域(receptor binding domain, RBD)，是冠狀病毒疫苗研究的主要靶抗原[4]。RBD與宿主細胞的血管緊張素轉(zhuǎn)化酶2(angiotensin converting enzyme 2, ACE2)結(jié)合后，S蛋白發(fā)生變構(gòu)，啟動病毒感染入侵[5-6]。SARS-CoV-2的S蛋白高度糖基化，其RBD中至少有4個潛在糖基化位點[7]。目前，SARS-CoV-2的S蛋白糖基化水平對其免疫原性的影響尚不清楚。

SARS-CoV的病毒學及疫苗學研究為SARS-CoV-2疫苗的研發(fā)提供了有力的技術(shù)支持。首先，研究發(fā)現(xiàn)，與SARS-CoV一樣，SARS-CoV-2的S蛋白融合前狀態(tài)的維持也有利于RBD依賴的中和抗體的誘發(fā)。目前，進入臨床試驗的以S全長蛋白為基礎(chǔ)的不同形式SARS-CoV-2疫苗均采用可保持融合前狀態(tài)的S蛋白突變體基因(S-2P)[2,8]，即將aa.986-987置換為2個脯氨酸。其次，SARS-CoV的研究發(fā)現(xiàn)，單獨表達RBD片段也可誘發(fā)高滴度的中和抗體和保護反應(yīng)[9-10]，且不受S蛋白融合前狀態(tài)的限制。與全長S蛋白相比，RBD片段的長度適中，易于改造和在多種不同表達體系進行高水平的表達及純化。目前分離了多種RBD依賴的中和單抗[11-12]，其識別表位是構(gòu)象依賴的，表明RBD的中和表位具有一定的空間構(gòu)象，其旁側(cè)序列對表位構(gòu)象的維持可能有一定的影響，目前有關(guān)不同長度RBD的報道較少。

酵母及CHO細胞表達SARS-CoV的RBD(aa.318-536)蛋白的研究目前已有報道[10,13]，尚未見在昆蟲表達體系的報道。昆蟲細胞表達體系具有表達量高、易于懸浮培養(yǎng)、操作簡單、表達蛋白的糖基化與哺乳動物接近等優(yōu)點，特別適于真核來源的蛋白表達。本研究采用三聚體蛋白疫苗的形式，利用桿狀病毒-昆蟲細胞表達體系，表達獲得3種不同的去除N-糖基化殘基的SARS-CoV-2 RBD(aa.331-550)蛋白及糖基化位點正常的2種不同長度的RBD蛋白。結(jié)果顯示，N-糖基化的去除可提高RBD三聚體蛋白在昆蟲細胞中的表達水平，且免疫原性不受影響，長片段的RBD三聚體蛋白的免疫原性比短片段的好。

1 材料與方法

1.1 材料

293T細胞(本實驗室保存)；Huh-7細胞(中國醫(yī)學科學院基礎(chǔ)醫(yī)學研究所劉力教授惠贈)；草地夜蛾卵巢細胞Sf9、E.coliDH10Bac(Invitrogen公司)；原核表達的RBD蛋白(中國科技大學金騰川教授惠贈)；含G蛋白缺陷骨架的VSV病毒(本實驗室構(gòu)建)；pcDNA3.1-hS質(zhì)粒(本實驗室構(gòu)建)；His標簽抗體(OriGene公司)；HisTrapTM HP預裝柱(GE公司)；氫氧化鋁凝膠佐劑、MPL佐劑(InvivoGen公司)；雌性Balb/c小鼠30只[斯貝福(北京)生物技術(shù)有限公司，合格證號:1103242011001338]。

1.2 方法

1.2.1 RBD融合基因重組穿梭質(zhì)粒Bacmid的構(gòu)建:在SARS-CoV-2 S蛋白序列(GenBank序列號為QHD43416.1)氨基酸319-591位(aa.319-591)或氨基酸331-550位(aa.331-550)的N端融合桿狀病毒包膜糖蛋白gp64的信號肽序列(GenBank序列號為AIU56980.1，aa.1-38)，C端融合T4噬菌體三聚化結(jié)構(gòu)域(PDB序列號為1AVY_A，aa.45-71)，并在下游進一步融合His標簽序列(8個組氨酸)，分別獲得長片段的RBDST融合蛋白及短片段的RBDT融合蛋白。在RBDT的基礎(chǔ)上，刪除N331氨基酸，獲得RBDT-N1融合蛋白；進行N343S突變，獲得RBDT-N2融合蛋白；進行N360A突變，獲得RBDT-N3融合蛋白。根據(jù) Sf9 偏性密碼子對上述RBD蛋白的基因序列進行優(yōu)化，合成獲得的RBD融合基因分別插入 pFastBac1 載體，轉(zhuǎn)化DH10Bac感受態(tài)，PCR鑒定獲得重組Bacmid，提取備用。

1.2.2 RBD蛋白的表達及鑒定:將攜帶RBD融合基因的重組Bacmid轉(zhuǎn)染Sf9細胞，構(gòu)建重組桿狀病毒，感染Sf9細胞后(MOI=0.1)，27 ℃培養(yǎng)約88 h，離心收集培養(yǎng)上清。12% SDS-PAGE及Western blot分析培養(yǎng)上清中的RBD蛋白表達情況。一抗為His標簽抗體，二抗為 HRP標記的羊抗小鼠IgG。

1.2.3 RBD蛋白的純化:表達不同RBD融合蛋白的培養(yǎng)上清在PBS中4 ℃透析24 h，經(jīng)HisTrapTMHP親和層析純化，按GE公司說明書中提供的純化方案純化融合蛋白。

1.2.4 小鼠免疫:4～6周雌性Balb/c小鼠5只/組，RBD融合蛋白抗原10 μg/劑，聯(lián)合50 μg/劑的氫氧化鋁佐劑及5 μg/劑的MPL佐劑，于第 0、3、6周皮下免疫，設(shè)PBS免疫小鼠為對照組，于第5、8周尾靜脈采集血清。

1.2.5 ELISA檢測血清中RBD特異性IgG抗體水平:用PBS將原核表達的RBD蛋白稀釋至1 μg/mL，包被96孔板(100 μL/孔)；使用5% BSA封閉(200 μL/孔)；用PBS倍比稀釋待測血清，加入96孔板，4 ℃孵育過夜；加入HRP標記的羊抗小鼠IgG(1∶3 000)，37 ℃孵育1 h；OPD底物顯色(100 μL/孔)，37 ℃反應(yīng)5 min；2 mol/L硫酸(50 μL/孔)終止反應(yīng)；檢測A490。A490數(shù)值大于0.2且大于陰性對照2倍的最大血清稀釋度視為特異性IgG抗體滴度。

1.2.6 假病毒的制備:制備方法如文獻所述[14]，使用S蛋白表達質(zhì)粒pcDNA3.1-hS轉(zhuǎn)染293T細胞，37 ℃培養(yǎng)24 h后，用含G蛋白缺陷骨架的VSV病毒感染細胞(MOI=4)，37 ℃培養(yǎng)48 h。收集培養(yǎng)上清，檢測假病毒的滴度。

1.2.7 假病毒中和實驗:如文獻所述[14]，使用DMEM完全培養(yǎng)基稀釋假病毒，將稀釋后的假病毒與倍比稀釋的待測血清等體積混合，4 ℃孵育1 h，然后加入預先鋪好的Huh-7細胞中(2×104個/100 μL/孔，MOI=0.05)。37 ℃孵育24 h，使用流式細胞儀檢測各孔細胞的感染抑制率。感染抑制率=(1-待測血清樣品中的熒光細胞百分數(shù)/陰性對照樣品中的熒光細胞百分數(shù))×100%。感染抑制率大于50%的最高稀釋倍數(shù)即為中和抗體滴度。

1.3 統(tǒng)計學分析

使用Graphpad軟件分析實驗數(shù)據(jù)并作圖，ELISA抗體及中和抗體水平以平均滴度(GMT)±SD表示。

2 結(jié)果

2.1 RBD蛋白的表達鑒定

取等體積(60 μL)相同表達條件的各種RBD蛋白的表達上清進行12% SDS-PAGE及Western blot分析。結(jié)果顯示，5種RBD蛋白均可在Sf9細胞中分泌表達，其中RBDST的分子質(zhì)量約40 ku(圖1，泳道1)，其余4種RBD蛋白的分子質(zhì)量約37 ku(圖1，泳道2-5)，上述5種RBD蛋白的表觀分子質(zhì)量均大于理論值，提示RBD蛋白在昆蟲細胞中表達時發(fā)生了糖基化。值得注意的是，3種去糖基化的蛋白RBDT-N1、RBDT-N2及RBDT-N3的表達水平均高于RBDT(圖1，泳道2-5)，提示糖基化的去除可提高RBD蛋白在昆蟲細胞中的表達水平。

1.RBDST; 2.RBDT; 3.RBDT-N1; 4.RBDT-N2;5.RBDT-N3; 6.control medium圖1 Western blot分析Sf9表達上清中的RBD蛋白Fig 1 Western blot analysis of RBD proteins in the culture media of Sf9 cells

2.2 去糖基化的RBD蛋白免疫血清RBD特異性IgG水平分析

為明確去糖基化對RBD蛋白免疫活性的影響，本研究比較了RBDT與3種去糖基化蛋白RBDT-N1、RBDT-N2及RBDT-N3誘發(fā)的RBD特異性IgG水平。結(jié)果顯示，2次免疫后各組的RBD特異性IgG滴度在320～560，3次免疫后各組的特異性IgG滴度在6 400～11 200，組間均無統(tǒng)計學差異(圖2)。PBS對照組未檢測到RBD特異性IgG。

圖2 糖基化不同的RBD蛋白誘發(fā)的血清特異性IgG抗體水平分析Fig 2 Analysis of RBD-specific IgG titers induced by RBD proteins with different glycosylation

2.3 不同長度的RBD蛋白免疫血清RBD特異性IgG水平分析

為明確片段長度對RBD蛋白免疫活性的影響，本研究比較了較短的RBDT與較長的RBDST誘發(fā)的RBD特異性IgG抗體水平。結(jié)果顯示，2次免疫及3次免疫后，RBDST誘發(fā)的特異性IgG滴度分別為880和33 280，均顯著高于RBDT免疫組(P<0.05，P<0.01)(圖3)。

*P<0.05,**P<0.01 compared with RBDT group圖3 不同長度的RBD蛋白誘發(fā)的血清特異性IgG抗體水平分析Fig 3 Analysis of RBD-specific IgG titers induced by RBD proteins with different length

2.4 RBD蛋白免疫血清中和抗體水平分析

本研究采用VSV骨架的SARS-CoV-2假病毒檢測各組RBD蛋白3次免疫后的血清中和抗體水平。結(jié)果顯示，RBDST誘發(fā)的中和抗體滴度最高，顯著高于RBDT(P<0.01)及3種去糖基化的RBD蛋白(P<0.001)誘發(fā)的中和抗體(圖4)。

*P<0.01,**P<0.001 compared with RBDST group圖4 RBD蛋白誘發(fā)的SARS-CoV-2假病毒中和抗體分析Fig 4 Analysis of SARS-CoV-2 pseudovirus neutralization titers induced by RBD

3 討論

桿狀病毒-昆蟲細胞表達體系具有表達水平高、安全性好、易于操作等優(yōu)點。目前利用該體系生產(chǎn)獲批上市的疫苗有HPV VLP疫苗、甲狀腺癌治療性蛋白疫苗及賽諾菲巴斯德的四價流感蛋白疫苗。研究發(fā)現(xiàn)，Sf9昆蟲細胞表達的SARS-CoV RBD蛋白(aa.318-510)誘發(fā)的中和抗體滴度顯著高于原核表達的[15]。本研究采用昆蟲細胞表達體系對RBD(aa.331-550)的不同糖基化敲除突變體及兩種不同長度的RBD蛋白進行表達，分析其免疫原性。結(jié)果顯示，分別去除N331、N343和N360糖基化均可提高蛋白在昆蟲細胞中的表達水平而不影響其免疫原性。SARS-CoV-2 RBD(aa.319-545)蛋白糖基化位點分析的結(jié)果[16]顯示，N331、N343位點位于RBD受體結(jié)合基序結(jié)構(gòu)的基部，即這2個位點不參與結(jié)合ACE2。本研究的3個糖基化位點中，N331和N343為典型的糖基化位點基序(NXT/Y)[7,17]，N360為尚未確認的潛在糖基化位點。本研究獲得的3個去糖基化的突變體免疫原性沒有改變，可能是由于這些位點不在與ACE2結(jié)合的基序中。但采用SARS-CoV-2假病毒變異株的體外分析顯示，N331突變增加了突變株對康復者血清的敏感性[18]，因此N331突變株的抗原性值得深入研究；另外，酵母表達的去糖基化的SARS-CoV RBD蛋白分析[13]顯示，去除N331同源的糖基化位點后，其表達水平顯著降低，免疫血清的中和抗體水平(假病毒中和抗體水平不變，真病毒中和抗體水平顯著提高)有待于進一步分析，而另2個突變體(N343、N360同源位點去糖基化)的表達極低，沒有深入研究，這可能是采用的實驗評價方法或表達體系不同造成的。本研究還發(fā)現(xiàn)，RBD長片段(aa.319-591)的免疫原性較短片段(aa.331-550)的高。結(jié)構(gòu)分析顯示，SARS-CoV-2 S蛋白的RBD區(qū)為aa.319-541區(qū)域，其中aa.437-508區(qū)域為受體結(jié)合基序(receptor binding motif，RBM)。在SARS-CoV的前期研究中發(fā)現(xiàn)，包含RBM的不同長度的RBD片段均可誘發(fā)中和抗體，目前SARS-CoV報道的RBD蛋白有2種長度，即193個氨基酸(aa.318-510)[9,13]和219個氨基酸(aa.318-536)[10,13]。最近又報道了兩種不同長度的RBD蛋白疫苗，分別是長度為227個氨基酸的SARS-CoV-2 RBD (aa.319-545)蛋白疫苗[16]，及長度為223個氨基酸的RBD(aa.319-541)單鏈二聚體的蛋白疫苗[19]。本課題組目前正在進一步比較這些不同長度RBD蛋白的免疫原性，同時進行去糖基化長片段RBD的研究。

理想的疫苗需同時誘發(fā)體液及細胞免疫反應(yīng)，體液免疫的評價主要檢測保護性抗體?？祻驼哐寮癝蛋白依賴的中和抗體的被動免疫試驗證明，中和抗體在阻斷病毒感染中起重要作用[20-22]。目前新冠疫苗研發(fā)免疫活性的指標主要是對抗體水平進行分析，因此本研究重點分析三聚體蛋白誘發(fā)的特異性IgG及中和抗體水平。結(jié)果顯示，RBD三聚體誘發(fā)的IgG抗體最高可達104，中和抗體水平較IgG抗體低1個數(shù)量級。有文獻報道的SARS-CoV-2疫苗的ELISA抗體滴度較高(可達105)，但其與假病毒中和抗體滴度的比值也很高(100:1)[16,19]，有些文獻報道的ELISA滴度相對較低，但其與假病毒中和抗體的滴度比值較低(約10∶1)[2]，這主要是不同研究采用的試驗體系不同造成的，影響因素主要包括假病毒體系的不同(假病毒的骨架、S蛋白的密度)、分析用細胞系的不同等。因此，目前SARS-CoV-2疫苗的臨床研究中經(jīng)常用康復者血清的中和抗體滴度作為參照。在本研究基礎(chǔ)上，本課題組將深入系統(tǒng)地優(yōu)化RBD蛋白的結(jié)構(gòu)及組成方式，進一步篩選產(chǎn)量高、免疫原性強的蛋白疫苗，屆時將全面分析疫苗誘發(fā)的細胞免疫、體液免疫及體內(nèi)保護活性。

總之，本研究發(fā)現(xiàn)，SARS-CoV-2 RBD去糖基化修飾可提高其在昆蟲細胞中的表達水平，同時又不影響其免疫原性；較長片段的RBD蛋白疫苗(aa.319-591)免疫活性優(yōu)于短片段的RBD蛋白疫苗。研究結(jié)果不僅可用于蛋白疫苗的研究，也可用于基于RBD蛋白抗原的病毒載體疫苗及核酸疫苗。