環(huán)狀RNA在頭頸部腫瘤侵襲轉移中的研究進展*

吳麗媚 張焱 何子蕊 聶詩情 陳文慧

頭頸部腫瘤（head and neck cancer，HNC）是全球高發(fā)腫瘤之一，在全球癌癥常見死亡原因中排名第6位［1］。其包括鼻咽癌、喉癌、下咽癌、食管癌、口咽癌、甲狀腺癌、牙齦癌、腮腺癌等。病理類型包括鱗狀細胞癌、腺癌、腺樣囊性癌、淋巴上皮癌、基底細胞癌、黏液表皮樣癌等，其中以鱗狀細胞癌最常見，占95%［2］。HNC主要的治療措施包括外科手術、放療、化療、靶向治療和免疫治療。然而，HNC深入的解剖位置、狹隘的空間、復雜精細的結構特點導致外科手術的難度大、放療不良反應多。目前在治療上，大多數臨床醫(yī)生比較關注局部控制率和生存率，可能忽略了遠處轉移率與死亡率的密切關系。據統(tǒng)計，HNC患者中死于遠處轉移有15%～20%，而所有HNC患者中實際上發(fā)生腫瘤遠處轉移的病例數是臨床報道的3～4倍［3-4］，可見遠處轉移是影響HNC患者生存率的重要因素之一。

惡性腫瘤的侵襲和轉移是在多種生物因素相互作用下，腫瘤細胞從原發(fā)部位釋放，穿透基底膜，經過淋巴管或血液系統(tǒng)抵達遠處部位［5］。尋找與腫瘤發(fā)生發(fā)展、侵襲轉移有關的關鍵基因，進行針對性的靶向治療是目前熱門的腫瘤治療手段之一，如EGFR、K-RAS、N-RAS、B-RAF、PI3K、TP53、BRCA1、BRCA2 等基因已被證明在腫瘤中發(fā)生突變［6-10］。針對性的靶向藥物已成熟用于臨床并取得一定的成效，如伊馬替尼、索拉非尼、達拉非尼、吉非替尼、奧拉帕利等。除以上基因靶點之外，其他基因產物在腫瘤侵襲轉移過程中發(fā)揮何種效果值得探討。

最開始，人們認為以反向剪接方式形成的單鏈共價閉合的環(huán)狀RNA在生物發(fā)生發(fā)展中只是一種異常剪接的“垃圾”［11］，但隨著高通量RNA 測序技術（RNA-seq）和circRNA（exonic circRNA）特異性生物信息學算法的發(fā)展，人類對部分環(huán)狀RNA 的了解越來越清楚［12］。已有研究報道，多數環(huán)狀RNA 具有不同生物學功能，在基因完整、保守表達的過程中可能發(fā)揮調控作用［12］，部分環(huán)狀RNA 被證明與多種人類疾病的生理和病理過程有關，如阿爾茨海默?。?3］、帕金森病［14］、腫瘤的發(fā)生發(fā)展［15-16］等。環(huán)狀RNA 可通過體液被檢測，如唾液、血液和尿液中低濃度也可被找到［17-19］，其在體液中穩(wěn)定性好，且靈敏度高。液體活檢避免了有創(chuàng)活檢對患者帶來的傷害，具有方便易取且價格低廉等優(yōu)點，更容易讓患者接受。因此，從環(huán)狀RNA 的角度來研究腫瘤侵襲和轉移的機制、挖掘環(huán)狀RNA作為腫瘤的分子靶向治療具有重要的科學價值。本綜述總結目前環(huán)狀RNA在頭頸部惡性腫瘤的侵襲轉移中的研究進展，探尋更多臨床診斷、治療的可行方案。

1 環(huán)狀RNA的產生和生物功能

環(huán)狀RNA與傳統(tǒng)的線性RNA不同，是共價封閉的從頭至尾閉合成環(huán)的反向剪接形成［12-20］，來自上游和下游區(qū)域的序列以相反的方向連接在一起，沒有5′-3′極性、5′帽和3′聚腺苷酸尾，所以比線性RNA更穩(wěn)定，不容易被RNA外切酶或RNaseR（核糖核酸酶R）降解［20］。環(huán)狀RNA的表達具有組織和階段特異性［12］，并且可以被靶細胞攝取，在體液中可找到其表達［17-19］。3種環(huán)狀RNA（圖1）［21-22］由Pre-mRNA（premessenger RNA，前信使RNA）通過不同的循環(huán)機制產生，ecircRNA和EIciRNA均可由依賴剪接體的套索驅動環(huán)化、內含子配對驅動環(huán)化、RNA結合蛋白（RNA-binding proteins，RBPs）誘導驅動環(huán)化得到，ciRNA由內含子配對驅動環(huán)化形成。環(huán)狀RNA在形成過程中特定序列是保守的，暗示其在生物的生存發(fā)展中具有生物學意義，一旦發(fā)生異常，可能導致機體發(fā)生一定的改變，這一生物學特征為其生物學功能提供保證。

圖1 3種環(huán)狀RNA

1.1 作為競爭的內源性RNA或微核糖核酸（microRNA，miRNA）海綿

研究表明，EcircRNA 可以與miRNA 上的特異靶點結合，通過充當miRNA 海綿來調節(jié)miRNA 的活性。miRNA 作為基因表達的重要轉錄后調節(jié)因子，可以直接通過堿基互補配對結合靶向mRNA（messenger RNA，信使核糖核酸）的非編碼區(qū)。因此環(huán)狀RNA可通過充當miRNA海綿而增加或降低下游基因的表達，在不同腫瘤中發(fā)揮抑癌或致癌的作用（表1）。CIRS-7/CDR1as 是第1 個被報道抑制miR-7 活性的miRNA海綿。Hansen等［23］通過一系列實驗證明CIRS-7（miR-7 的環(huán)狀RNA 海綿）含有70 多個miRNA靶位點，且CIRS-7中的miR-7位點能夠促進特定的miR-7-AGO2（Argonaute2 蛋白）相互作用，從而抑制miR-7活性，導致miR-7的靶基因水平增加。同一個環(huán)狀RNA 可以作為不同的miRNA 的海綿，發(fā)揮抑癌或致癌的作用。circ-HIPK3是miR-124的海綿，抑制miR-124的活性，上調miR-124靶基因Aquaporin3的水通道蛋白3（aquaporins 3，AQP3）的表達，從而促進肝癌細胞的增殖、遷移［28］。而circ-HIPK3 除了作為miR-124 海綿發(fā)揮致癌作用之外，還可以作為miR-558海綿，下調膀胱癌細胞中乙酰肝素酶（heparitinase，HPSE）的表達，抑制膀胱癌細胞的遷移、侵襲［29］。但是，并非所有的環(huán)狀RNA 對miRNA 的調控都是通過“miRNA海綿”這一經典功能來調控miRNA的穩(wěn)定性的。雄激素受體（androgen receptor，AR）通過在轉錄水平上調節(jié)其宿主基因（HIAT1）的表達來抑制circ-HIAT1 的表達，而circ-HIAT1 的下調導致miR-195-5p/29a-3p/29c-3p 表達下調，使cdc42 表達增加，從而增強腎透明細胞癌細胞的遷移和侵襲［30］。circ-HIAT1 提高了miR-195-5p/29a-3p/29c-3p 的穩(wěn)定性，起到“miRNAs reservoir”的作用。目前環(huán)狀RNA 通過作為miRNA 海綿，在基因表達調控中發(fā)揮關鍵作用，這一發(fā)現得到廣泛認可和證實，為以環(huán)狀RNA和（或）miRNA作為切入點進行腫瘤的臨床診斷及靶點治療提供有效的科學依據。

表1 環(huán)狀RNA在不同腫瘤中充當miRNA海綿的功能

1.2 蛋白質翻譯

大多數環(huán)狀RNA由編碼區(qū)的外顯子組成，且大多數定位于細胞質，由此猜測環(huán)狀RNA有翻譯蛋白質的功能。由于環(huán)狀RNA缺乏帽依賴性翻譯所需要的元件—5′m7G帽和3′多聚A尾，故環(huán)狀RNA不能通過傳統(tǒng)線性RNA的帽依賴性翻譯模式來進行蛋白質的翻譯。但是，環(huán)狀RNA可以依賴內部核糖體進入位點（internal ribosome entry site，IRES）來結合核糖體［42］，或者在5′非翻譯區(qū)（untranslated region，UTR）進行N6-甲基腺苷（N6-methyladenosine，m6A）修飾之后［43］，啟動蛋白質的翻譯。有研究證明，即使沒有任何IRES序列、5′帽或3′多聚A尾結構，環(huán)狀RNA也可以通過滾環(huán)擴增（rolling circle amplification，RCA）機制有效地翻譯［44］。由此，可概括出環(huán)狀RNA進行翻譯所需要的元件為開放閱讀框（open reading frame，ORF）、IRES或帶有m6A序列。目前得到充分證實的可以作為蛋白質模板的環(huán)狀RNA有5個，分別是circ-SHPRH［42］、circ-PINT［45］、circ-FBXW7［46］、circ-Mbl［47］、circ-ZNF609［48］。circ-SHPRH［SNF2組蛋白連接物—PDH環(huán)解旋酶（PDH ring helicase，SHPRH）基因］使用與宿主基因重疊的遺傳密碼翻譯出的一種新的蛋白質—SHPRH-146aa。SHPRH-146aa可以保護SHPRH免受泛素蛋白酶體的降解。穩(wěn)定的SHPRH可通過泛素化增殖細胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）作為E3連接酶來抑制細胞增殖，從而發(fā)揮抑癌作用。因此，SHPRH-146aa降低人膠質母細胞瘤細胞在體內外的惡性行為和致瘤性［42］。circ-PINT RNA的翻譯產物PINT87aa通過與聚合酶Ⅱ相關因子1同源復合物（polymerase-associated factor 1，PAF1）結合，增加PAF1復合體與靶啟動子的親和力，從而阻止了CPEB1、SOX-2和MYC102等癌基因的表達，發(fā)揮抑癌作用［45］。circ-FBXW7編碼的蛋白質FBXW7-185aa在膠質母細胞瘤中上調，通過競爭性與泛素化酶28（ubiquitinspecific proteins 28，USP28）結合，拮抗USP28誘導的c-Myc基因的穩(wěn)定，從而抑制癌細胞的增殖，發(fā)揮抑癌作用［46］。另外，circ-Mbl和circ-ZNF609分別被Pamudurti等［47］、Legnini等［48］證明能以不依賴帽子結構的方式翻譯成蛋白質。環(huán)狀RNA的翻譯產物是否與宿主線性RNA的蛋白質產物調節(jié)相同的生物過程，有待進一步證實。這一生物學功能挑戰(zhàn)了以往人們認為只有mRNA才具有翻譯功能的權威，為分子生物學領域開拓一個新的研究方向。

1.3 環(huán)狀RNA-蛋白質相互作用

有些環(huán)狀RNA 中存在蛋白結合序列，環(huán)狀RNA與蛋白質之間發(fā)生相互作用，二者之間相互作用的具體機制未被充分報道，但是通過RNA pull down 實驗、RNA 免疫沉淀實驗、環(huán)狀RNA 測序、激光共聚焦顯微鏡分析環(huán)狀RNA 和蛋白質的共定位等實驗方法［49-50］可以得到證實。環(huán)狀RNA 既可以在細胞質中，也可以在細胞核中與蛋白質結合。報道得最多是ecircRNA，如circ-FOXO3［49］、circ-Amotl1［50］，ciRNA和ElciRNA 的報道相對較少。circ-FOXO3 可以與細胞周期素依賴性激酶2（cyclin-dependent kinase 2，CDK2）和P21 蛋白結合形成circ-FOXO3-CDK2-P21復合物。CDK2屬于細胞周期蛋白依賴性激酶家族，是細胞G1 期向S 期轉變的必需物質，該復合物消耗了CDK2，阻止細胞由G1 期進入S 期。環(huán)狀RNA 可以作為蛋白轉運體，促使功能蛋白從細胞質轉運到細胞核中，也可以作為功能蛋白的“儲存庫”，抑制這些蛋白的生物功能。如circ-Amotl1 可以與PDK1 和AKT1、STAT3和c-Myc結合，并促進其從細胞質和細胞核發(fā)生轉移［50］。Ashwal-Fluss 等［51］發(fā)現MBL 蛋白與circ-Mbl 存在相互作用，MBL 基因中內含子、外顯子的環(huán)化率依賴于MBL 蛋白水平，且當MBL 蛋白質表達升高，可通過促進circ-Mbl的產生來減少其自身mRNA的產生，而過量的MBL蛋白可被circ-Mbl結合吸收。環(huán)狀RNA與蛋白質的相互作用作為一個新的科學視角，可進一步應用到腫瘤的診斷與治療中。

1.4 調節(jié)選擇性剪接或轉錄

環(huán)狀RNA 有調節(jié)母本基因的轉錄調控，并且與經典的線性剪接有競爭關系。ciRNA沒有外顯子，故無法如ecircRNA作為miRNA海綿而進行基因表達的轉錄調控。但是ciRNA 可以通過調節(jié)RNA 聚合酶（RNA PolⅡ），以順式作用的方式調節(jié)宿主轉錄活性，從而增強母本基因的表達［52］。circ-Mbl來自剪接因子MBL，其本身具有MBL 結合位點且能與MBL 特異地結合，MBL 水平的調節(jié)顯著影響circ-Mbl 的形成，circ-Mbl與MBL的premRNA存在剪接競爭［51］。

2 環(huán)狀RNA與HNC的侵襲轉移

腫瘤的侵襲轉移涉及復雜的分子機制，早前已有大量針對LncRNA 和microRNAs（miRNAs）在HNC侵襲轉移中的調控網絡的研究。近年來，隨著環(huán)狀RNA相關研究技術的逐漸成熟，環(huán)狀RNA在HNC中的研究成為新的熱點，對環(huán)狀RNA 在HNC 侵襲轉移中的機制的研究越來越多。

2.1 環(huán)狀RNA與鼻咽癌

目前對于環(huán)狀RNA 在鼻咽癌中的細胞增殖、侵襲、轉移機制研究方向主要是“環(huán)狀RNA 海綿miRNA，上調下游靶基因”途徑。Zhang等［52］的研究發(fā)現，circ-ZNF609 可以與microRNA-150-5p 相互作用來促進鼻咽癌的生長和轉移。該研究circ-ZNF609 和Sp1 在鼻咽癌組織中的表達水平明顯高于正常鼻咽上皮組織，而microRNA-150-5p 在鼻咽癌組織中的表達明顯降低，且circ-ZNF609 與Sp1 競爭性與microRNA-150-5p 結合。雙變量分析顯示，circ-ZNF609 與Sp1 呈正相關，而與microRNA-150-5p 呈負相關，已知Sp1是一種致癌基因，Sp1的高表達與腫瘤的轉移及不良預后有關［53-54］。而Sp1是microRNA-150-5p 的靶基因，可被后者降解。由此可知circ-ZNF609通過競爭性海綿microRNA-150-5p，降低Sp1的降解，從而增強鼻咽癌細胞的增殖及轉移能力，circ-ZNF609 在鼻咽癌中發(fā)揮致癌作用［55］。類似地，Zhong等［32］發(fā)現circ-CDR1as在鼻咽癌組織和細胞系中高表達，且circ-CDR1as的高表達與鼻咽癌臨床分期相關、高生存率相關。內源性抑癌基因miR-7-5p是鼻咽癌CDR1as 的靶基因，E2F 轉錄因子3（E2F3）是鼻咽癌細胞miR-7-5p的靶基因，E2F3來自E2F轉錄因子家族，其可以通過加速葡萄糖代謝來促進腫瘤細胞的生長，E2F3 參與調節(jié)細胞增殖和細胞周期。因此，circ-CDR1 通過競爭性結合而抑制miR-7-5p，上調E2F3在鼻咽癌中的表達，從而促進腫瘤細胞的增殖。circ-HIPK3 具有miR-4288 結合位點，circ-HIPK3 通過海綿功能抑制miR-4288 的表達水平，從而增強ELF3的表達，促進鼻咽癌細胞的惡性發(fā)展［33］。EBV編碼的circ-RPMS1可通過海綿多個miRNA 來促進鼻咽癌細胞的上皮-間質轉化，從而促進腫瘤的侵襲轉移［55］。除此之外，還有研究者證明，Rho相關激酶1（Rho associated kinase 1，ROCK1）是一種蛋白絲氨酸/蘇氨酸激酶，參與細胞運動、腫瘤轉移和上皮-間充質轉化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）等多種生物學過程［56］，鼻咽癌組織中高表達的circRNA-LARP4 抑制ROCK1 的表達，從而抑制鼻咽癌細胞的增殖和侵襲［57］。

2.2 環(huán)狀RNA與喉癌

目前報道的關于環(huán)狀RNA在喉癌的侵襲轉移中的作用的研究見表2。研究證實，Hsa_circ_0042666在喉癌組織中可通過充當miRNA海綿，與miR223競爭性結合，降低靶基因TGFBR3在喉鱗狀細胞癌組織中的表達，而TGFBR3基因具有抑制喉鱗狀細胞體外侵襲的能力，故喉鱗癌組織中Has_circ_0042666的下調通過miR223/TGFBR3軸使靶基因的表達上調，發(fā)揮抑癌作用［58］。Lu等［67］通過對喉癌樣本進行測序分析表明，與正常喉組織相比，喉鱗狀細胞癌組織中29個環(huán)狀RNA表達上調，19個環(huán)狀RNA表達下調，其還預測了幾個與癌癥相關的miRNAs的相互作用，并且京都基因與基因組百科全書（Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）分析表明，PPAR、Axon導向、Wnt和細胞周期信號通路是LSCC過程中的關鍵信號通路。環(huán)狀RNA是否與其他信號通路相互作用或是否以其他生物學功能在喉癌的侵襲轉移中發(fā)揮關鍵作用，值得進一步深入研究證明。

表2 與喉癌侵襲轉移有關的環(huán)狀RNA

2.3 環(huán)狀RNA與食管癌

越來越多的證據表明，環(huán)狀RNA 在食管癌的侵襲、轉移中起到重要作用。作為擁有70 多個miRNA結合位點的環(huán)狀RNA，cirs-7在食管癌中通過海綿不同的miRNA 來促進腫瘤細胞的惡性行為。CIRS-7通過海綿miR-876-5p 來增強MAGE-A 家族的表達［34］，通過調節(jié)海綿miR-7 來增強HOXB13 介導的NF-κB/p65 通路［35］，通過調節(jié)miR-7/KLF4 軸和激活NF-κB/p65 信號來促進發(fā)食管鱗癌細胞的遷移和侵襲［36］。另外，circ-VRK1 作為miR-624-3p 的分子海綿，可改善PTEN的表達，而降低PI3K/AKT 信號通路的活性來抑制食管鱗癌的進展［37］。除了以“海綿miRNA”的方式之外，circ-GSK3β可以直接抑制其親本蛋白GSK3β 的生物發(fā)生，從而抑制Wnt/β-catenin介導通路來促進食管鱗癌細胞的轉移［15］。Zhang等［68］以實驗證明，敲除circ-Smad7可以促進食管癌細胞的增殖和遷移，而高表達的circ-Smad7則起到了相反的作用，但該研究未對circ-SMAD7 對食管鱗癌的確切作用機制闡述，需要進一步的實驗來探索。

2.4 環(huán)狀RNA與甲狀腺癌

遠處轉移同樣是甲狀腺癌（papillary thyroid cancer，PTC）治療效果欠佳的原因之一。與鼻咽癌、喉癌、食管癌類似，環(huán)狀RNA 可通過“海綿RNA”影響PTC 的 發(fā)生 發(fā) 展。研 究 證明［38］，circ-ICTH 海 綿miR22-3p 使細胞核中β-catenin 的E3 連接酶（E3 ligase of nuclear β-catenin，CBL）的表達增多，CBL抑制了Wnt/β-catenin 通路的激活，從而減緩PTC 的進展。類似地，circ-NEK6 以激活circ-NEK6/mir-370-3p/Wnt 信號通路來抑制PTC 的發(fā)展［39］，circ-ZFR 通過調節(jié)miR-1261/C8orf4 軸在PTC 中發(fā)揮致癌作用［40］，Has_circ_0004458 通過抑制miR-885-5p/Rac1軸來參與PTC的進展［41］。

2.5 環(huán)狀RNA與其他HNC

目前，環(huán)狀RNA在其他HNC，如咽癌、口咽癌、牙齦癌、腮腺癌等中的研究遠不如前面的幾個腫瘤，可能與其發(fā)生率低有關，但對于環(huán)狀RNA在其發(fā)生、侵襲中的作用不容忽視。

3 結語

隨著環(huán)狀RNA的生物學特征和生物學功能逐漸被證實，環(huán)狀RNA 在疾病診斷及治療等方面的潛力日漸獲得重視。環(huán)狀RNA因其高穩(wěn)定性和組織特異性，優(yōu)越性明顯高于miRNA和lncRNA。環(huán)狀RNA已被證明在各種腫瘤細胞的增殖、凋亡、侵襲、轉移中發(fā)揮重要作用，具備作為生物標志物和治療靶點的能力。對環(huán)狀RNA的深入了解和充分利用將會在臨床大放異彩。本綜述總結了環(huán)狀RNA 生物特征、生物學功能、以及目前環(huán)狀RNA 在HNC 的細胞增殖、侵襲、轉移中的主要研究方向。環(huán)狀RNA 在HNC 的侵襲、轉移機制中的研究相對單調，主要以“環(huán)狀RNA海綿miRNA，上調下游靶基因”途徑為主?？v觀環(huán)狀RNA在其他腫瘤的研究方向、方法，我們可以借鑒、學習，從而深入發(fā)掘環(huán)狀RNA 的蛋白質翻譯、調節(jié)選擇性剪接或轉錄、與蛋白質相互作用等生物學功能在HNC的惡性行為中更多的可能性。環(huán)狀RNA可以從血液、尿液、唾液等方便易取的標本中獲得。繼續(xù)深入探索環(huán)狀RNA與腫瘤侵襲轉移的“親密”關系，把從血液、尿液、唾液等體液中檢測環(huán)狀RNA 的表達量作為腫瘤患者規(guī)范治療后的定期復查指標，能較大程度上增加復查的精確性、減輕患者的醫(yī)療費用、提高患者的依從性。環(huán)狀RNA 在腫瘤的診治中蘊含巨大的潛力，準確把握其在腫瘤中的關鍵靶點作用，積極深入探索并應用到臨床上。