NDM-1抑制劑研究進(jìn)展

王倩，劉憶霜

·綜述·

NDM-1抑制劑研究進(jìn)展

王倩，劉憶霜

100050 北京，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所國家新藥（微生物）篩選實(shí)驗(yàn)室

抗生素的發(fā)現(xiàn)是人類抵御細(xì)菌感染性疾病的重大突破。然而隨著抗生素的廣泛使用和濫用，細(xì)菌多藥耐藥問題日益嚴(yán)峻，對(duì)人類健康構(gòu)成了巨大的威脅。碳青霉烯類抗生素一度被視為革蘭氏陰性菌感染的“最后一道防線”，但隨著碳青霉烯酶的出現(xiàn)，碳青霉烯耐藥的革蘭氏陰性菌（如大腸桿菌、肺炎克雷伯菌、銅綠假單胞菌和鮑曼不動(dòng)桿菌）在全球范圍內(nèi)快速蔓延，為臨床治療帶來了新的挑戰(zhàn)[1-3]。

新德里金屬-β-內(nèi)酰胺酶-1（New Delhi metallo-β-lactamase-1，NDM-1），屬于 B1 類金屬β-內(nèi)酰胺酶（metallo-β-lactamases，MBLs），自 2008 年首次被報(bào)道以來，NDM-1 因其廣譜耐藥作用（可水解除單環(huán) β-內(nèi)酰胺類以外所有的 β-內(nèi)酰胺類抗生素）、變異體的多樣性（通過不同位置的氨基酸發(fā)生突變進(jìn)化出的新變種已達(dá) 24 個(gè)）、可轉(zhuǎn)移性（編碼基因NDM-1 可通過質(zhì)粒迅速傳播）而備受關(guān)注[2, 4-6]。表達(dá) NDM-1 的菌株可引起尿道感染、肺部感染、敗血癥等多種疾病，但臨床治療結(jié)果顯示，以表達(dá) NDM-1 為特點(diǎn)的“超級(jí)細(xì)菌”僅對(duì)黏菌素、替加環(huán)素、磷霉素等少量抗生素敏感[2, 4, 7]。因此，尋找低毒高效的 NDM-1 抑制劑是研究者們亟待解決的重大科學(xué)問題。

1 NDM-1 的結(jié)構(gòu)及催化機(jī)制

NDM-1 具有典型的 αβ/βα 夾層結(jié)構(gòu)，其活性中心包含兩個(gè)由氫氧根橋接的二價(jià)鋅離子：Zn1（與氨基酸His120、His122、His189配位）和 Zn2（與氨基酸Asp124、Cys208、His250配位）[4]。NDM-1 的催化機(jī)制尚無明確定論，部分學(xué)者認(rèn)為其遵循雙鋅催化機(jī)制，主要假說為：底物通過羰基氧原子與 Zn1 配位、內(nèi)酰胺氮原子與 Zn2 配位來極化內(nèi)酰胺鍵，親核的羥基攻擊底物羰基碳，形成過渡態(tài)復(fù)合體，最終導(dǎo)致 C-N 鍵的斷裂，內(nèi)酰胺氮原子以陰離子的形式被釋放，Zn2 作為超強(qiáng)酸提供質(zhì)子使其穩(wěn)定[8]。

2 NDM-1 抑制劑的研究現(xiàn)狀

目前文獻(xiàn)報(bào)道的 NDM-1 抑制劑高達(dá) 500 多個(gè)[4]，根據(jù)作用機(jī)制可大概分為三類：第一類抑制劑直接作用于 NDM-1 活性部位的鋅離子，如金屬離子螯合劑三（2-吡啶基甲基）胺[tris(2-pyridylmethyl)amine，TPA]衍生物、真菌代謝產(chǎn)物曲霉明A（aspergillomarasmine A，AMA）等，通過螯合或替換鋅離子抑制 NDM-1 的水解活性；第二類抑制劑則通過作用于 NDM-1 的氨基酸殘基，阻礙 NDM-1 與底物結(jié)合，如紫檀芪、厚樸酚等；第三類抑制劑可同時(shí)靶向 NDM-1 活性部位的鋅離子及催化關(guān)鍵氨基酸，發(fā)揮對(duì)NDM-1 的抑制作用，該類抑制劑包括天然植物成分蒽貝素、黃芩苷等。除上述三類抑制劑外，還有部分活性物質(zhì)可通過其他機(jī)制抑制 NDM-1，如肽偶聯(lián)磷酸二酰胺嗎啉低聚物（PPMO）；或作用機(jī)制尚不明確，如 ANT431。

2.1 與鋅離子相互作用的抑制劑

2.1.1 依地酸鈣鈉 依地酸鈣鈉是一種ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA與鈣離子的絡(luò)合物，在臨床上被批準(zhǔn)用于鉛中毒的解毒治療。與 EDTA相比，依地酸鈣鈉的毒性較低[9]。Aoki 等發(fā)現(xiàn)依地酸鈣鈉可降低亞胺培南對(duì)產(chǎn) MBLs（IMP-1/2/7/10 和 VIM-2）的臨床分離菌株的minimum inhibitory concentration，MIC。在后續(xù)研究中，該團(tuán)隊(duì)又證實(shí)了依地酸鈣鈉可以降低亞胺培南和美羅培南對(duì) NDM-1 陽性菌株的 MIC（亞胺培南 MIC ≤ 1 ~ 2 μg/ml；美羅培南MIC ≤1 ~ 4 μg/ml），在 NDM-1 陽性菌株感染的小鼠膿毒癥模型中，依地酸鈣鈉與亞胺培南/西司他丁鈉聯(lián)合使用可降低細(xì)菌數(shù)量[10]。

2.1.2 TPA 衍生物 以傳統(tǒng)的金屬螯合劑為骨架設(shè)計(jì)合成結(jié)構(gòu)修飾物以規(guī)避其體內(nèi)毒性，保留其良好的活性是研究者尋找 NDM-1 抑制劑的重要策略之一。Schnaars等[11]以選擇性鋅螯合劑TPA為骨架合成了一系列衍生物，其中 6 個(gè)衍生物對(duì)美羅培南具有較好的增效作用，且對(duì) HepG2 細(xì)胞具有相對(duì)較低的毒性（IC50> 100 μmol/L）。代表性化合物 15（圖 1）可使美羅培南對(duì)所檢測(cè)的產(chǎn)MBL（VIM-1、NDM-1、VIM-29）臨床分離株的 MIC降低至原來的1/32 ~ 1/256，但對(duì)產(chǎn)絲氨酸 β-內(nèi)酰胺酶（serine β-lactamases，SBLs）的臨床分離株無明顯作用。生化分析結(jié)果顯示，化合物 15 對(duì)純化的 NDM-1 和 VIM-2 均有抑制活性，inact/I分別為 12.5 L/(mmol·min) 和 0.500 L/(mmol·min)。

2.1.3 DPA 衍生物 Chen 等[12]以吡啶-2,6-二甲酸（2,6-dipicolinic acid，DPA）為骨架合成的衍生物 36（圖 1）對(duì) NDM-1 有良好的抑制活性（IC50值降低至 DPA 的1/5：80 ± 2 nmol/L），同時(shí)對(duì) VIM-2 和 IMP-1 的抑制作用也較 DPA 增強(qiáng)。100 mg/L 化合物 36 與亞胺培南聯(lián)合使用可使亞胺培南對(duì)產(chǎn) NDM-1 臨床分離菌株的 MIC 降低至敏感水平，且在此濃度下，化合物 36 對(duì)細(xì)菌細(xì)胞和人源細(xì)胞HEK293 均無明顯損傷作用。化合物 36 對(duì)體內(nèi)其他鋅離子依賴的金屬酶如 HDACs、hCAII 亦無明顯抑制作用，說明化合物 36 具備良好的體內(nèi)安全性。核磁共振氫譜、電子順磁共振光譜和平衡透析實(shí)驗(yàn)等結(jié)果表明，化合物 36 可能通過與 NDM-1 活性部位結(jié)合形成 NDM-1:Zn(II):抑制劑三元復(fù)合體而發(fā)揮抑制作用[12]。

圖 1 與鋅離子相互作用的抑制劑

2.1.4 (S,S)-乙二胺-N,N'-二琥珀酸 (S,S)-乙二胺-N,N'-二琥珀酸[(S,S)-ethylenediamine-N,N'-disuccinic acid，EDDS，圖 1]是由細(xì)菌產(chǎn)生的可生物降解的天然金屬螯合劑，對(duì)多種 MBLs 具有抑制活性，其中對(duì) NDM-1 的作用最佳，IC50值為 0.18 μmol/L，加入外源性鋅離子可逆轉(zhuǎn)該抑制作用[13]。EDDS 與 β-內(nèi)酰胺類抗生素聯(lián)合使用可顯著增強(qiáng)β-內(nèi)酰胺類抗生素對(duì)表達(dá) NDM-1 的大腸桿菌突變株的活性，當(dāng) EDDS 濃度為 32 mg/L 時(shí)，可分別使美羅培南和亞胺培南對(duì) NDM-1 表達(dá)突變株的 MIC 降低至原來的1/8533以下和 1/512。繼而檢測(cè) EDDS 對(duì)多種表達(dá)不同碳青霉烯酶的臨床分離菌株的活性，結(jié)果表明，EDDS 可恢復(fù)亞胺培南對(duì)所有檢測(cè)的 MBLs 陽性株的抗菌活性，而對(duì)于 MBLs 陰性株，EDDS 的加入并不能改變其耐藥性[13]。在產(chǎn)NDM-1 肺炎克雷伯菌感染的體內(nèi)模型中，EDDS 與亞胺培南聯(lián)合用藥可使實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物存活率顯著升高[13]。

2.1.5 繞丹寧類化合物 繞丹寧骨架（2-硫代-4-噻唑烷酮）是多種藥用天然產(chǎn)物的重要組成部分。在抗菌藥物研發(fā)中，繞丹寧亦是優(yōu)越的雜環(huán)結(jié)構(gòu)，其衍生物具有很強(qiáng)的抗菌活性[14]。其中，代表性化合物 ML302 被報(bào)道為 VIM-2 和 IMP-1 的雙重抑制劑，并可增強(qiáng)亞胺培南對(duì)產(chǎn) VIM-2/IMP-1/NDM-1 臨床分離菌株的活性[15]。Brem等[16]通過 ML302 與 VIM-2 共結(jié)晶分析發(fā)現(xiàn)，ML302 可能通過水解產(chǎn)生硫烯酸鹽產(chǎn)物 ML302F（圖 1），ML302F 螯合 VIM-2 活性部位的兩個(gè)鋅離子從而抑制 VIM-2 的活性。進(jìn)一步的生物活性檢測(cè)結(jié)果顯示，ML302F 對(duì) MBLs（NDM-1、VIM-2 和 BcII 等）具有廣譜抑制活性，IC50<（1.76 ± 0.51）μmol/L[16]。

然而在 Xiang 等[17]的研究中，由繞丹寧類衍生物水解得到的硫烯酸鹽類化合物 3a（圖1）僅能抑制 VIM-2 和 L1 的活性，對(duì) NDM-1 和 ImiS 并無抑制作用。同時(shí)發(fā)現(xiàn)二芳基取代的繞丹寧衍生物 2h-m（圖 1）對(duì) MBLs（NDM-1、VIM-2、ImiS 和 L1）具有廣譜抑制活性，IC50< 16 μmol/L，與頭孢唑啉或亞胺培南聯(lián)合使用可增強(qiáng)產(chǎn) MBLs 重組工程菌對(duì) β-內(nèi)酰胺類抗生素的敏感性。分子對(duì)接結(jié)果表明，化合物 2l 通過硝基（NDM-1、CphA 和 L1）或羧基（VIM-2）與酶活性部位的鋅離子配位結(jié)合，通過N-苯基與酶形成疏水相互作用。

2.1.6 二硫代氨基甲酸鹽衍生物 Ge 等[18]以二硫代氨基甲酸鹽為骨架設(shè)計(jì)合成的衍生物 DC1、DC8、DC10（圖 1）對(duì)進(jìn)行檢測(cè)的 5 種 MBLs（NDM-1、VIM-2、IMP-1、ImiS 和 L1）具備廣譜抑制活性，其中針對(duì) NDM-1 的 IC50值分別為 0.38、0.53 和 1.52 μmol/L。DC1 與頭孢唑啉聯(lián)合使用可提高重組 NDM-1 表達(dá)工程菌株對(duì)頭孢唑啉的敏感性，當(dāng) DC1 的濃度為 64 μg/ml 時(shí)，可使頭孢唑啉的 MIC 降低至原來的 1/16[18]。分子對(duì)接結(jié)果顯示，DC1 通過羥基和羰基與 NDM-1 活性部位的 Zn2+形成配位鍵而發(fā)揮可逆性抑制作用。

Wang 等[19]合成的二硫代氨基甲酸鹽衍生物 4a/4b（圖 1）和 Zhang 等[20]合成的 1,4,7-三氮雜環(huán)壬烷-1,4,7-三乙酸（1,4,7-triazacyclononane-1,4,7-triacetic acid，NOTA）二硫代氨基甲酸鹽衍生物 5（圖 1）也可顯著提高產(chǎn) NDM-1 臨床分離菌株對(duì)美羅培南的敏感性。鋅離子回補(bǔ)實(shí)驗(yàn)表明，上述化合物對(duì) NDM-1 的抑制作用與對(duì)鋅離子的影響有關(guān)。

2.1.7 AMA AMA（圖 1）作為一種真菌來源的天然產(chǎn)物，可以快速不可逆地抑制 NDM-1 的催化活性，IC50值為（4.0 ±1.0）μmol/L，同時(shí)對(duì) VIM-2 也有抑制作用，IC50值為（9.6 ± 2.4）μmol/L[21]。AMA 可以恢復(fù) NDM/VIM 陽性臨床分離菌株（腸桿菌、不動(dòng)桿菌和假單胞菌）對(duì)美羅培南的敏感性[21]。在產(chǎn) NDM-1 的肺炎克雷伯菌感染的小鼠模型中，AMA 與美羅培南聯(lián)合使用可使小鼠肝臟及脾臟的細(xì)菌負(fù)荷降低，存活率明顯升高[21]。鋅離子回補(bǔ)實(shí)驗(yàn)和質(zhì)譜分析結(jié)果提示，AMA 可能通過去除 NDM-1 活性中心的 Zn2+發(fā)揮抑制活性[21]。

2.1.8 鉍制劑和銅制劑 抗幽門螺桿菌藥物膠體次枸櫞酸鉍（colloidal bismuth subcitrate，CBS）及相關(guān)鉍制劑能夠不可逆地抑制 B1 類 MBLs（NDM-1、VIM-2 和 IMP-4）的催化活性，X 射線晶體衍射分析表明其機(jī)制為 Bi3+替換活性中心的兩個(gè) Zn2+，導(dǎo)致鋅離子輔因子的釋放[22]。在體外活性檢測(cè)中，CBS 及其他鉍制劑（Bi(NAC)3、Bi(NIT)3和Bi(PCM)2）與美羅培南聯(lián)合使用均可恢復(fù)美羅培南對(duì) NDM-1 陽性臨床分離菌株的抗菌活性，其中以 Bi(NAC)3的作用最為顯著[22]。此外，CBS 與美羅培南聯(lián)合用藥可顯著提高 NDM-1 陽性大腸桿菌感染小鼠的存活率，這說明 CBS 在體內(nèi)也可發(fā)揮對(duì) NDM-1 的抑制作用[22]。除 Bi3+以外，Cu2+也被報(bào)道具有 NDM-1 抑制活性，并可能影響 NDM-1的合成、成熟或穩(wěn)定，其與抗真菌劑吡啶硫酮的配位復(fù)合物有望成為臨床應(yīng)用碳青霉烯類抗生素的佐劑[23]。

2.1.9 苯并異噻唑酮 苯并異噻唑酮是新近報(bào)道的可作為 NDM-1 共價(jià)不可逆抑制劑的骨架結(jié)構(gòu)，體內(nèi)及體外實(shí)驗(yàn)表明，基于此結(jié)構(gòu)合成的化合物 1g（圖 1）對(duì) NDM-1 有顯著的抑制活性（體外 IC50值為 0.16 μmol/L，體內(nèi) IC50值為 35.1 μmol/L）[24]。化合物 1g 與頭孢唑啉聯(lián)合給藥，可恢復(fù)頭孢唑啉對(duì)重組 NDM-1 表達(dá)工程菌的抗菌活性，當(dāng)化合物 1g 的濃度為 16 μg/ml 時(shí)，可使頭孢唑啉的 MIC 降低至原來的 1/256。平衡透析實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，化合物 1g 可能通過移除 NDM-1 活性部位的一個(gè) Zn2+而抑制 NDM-1 的活性。

2.1.10 Thanatin Thanatin 是昆蟲經(jīng)誘導(dǎo)產(chǎn)生的一種抗菌肽，由 21 個(gè)氨基酸組成，在Cys11和 Cys18之間形成二硫鍵[25]。Ma 等[25]報(bào)道thanatin 通過競(jìng)爭(zhēng)性替換 NDM-1 陽性菌外膜的二價(jià)陽離子，導(dǎo)致脂多糖釋放，從而破壞細(xì)菌外膜，發(fā)揮抗菌活性，當(dāng)thanatin 劑量為 6 mg/kg時(shí)，可使產(chǎn)NDM-1 的大腸桿菌 XJ141026 感染的膿毒癥小鼠存活率達(dá)到 100%，并顯著降低血液、肝臟、脾臟及肺的細(xì)菌負(fù)荷。此外，thanatin 還可以通過替換 NDM-1 活性中心的鋅離子抑制 NDM-1 的催化活性[IC50值為（3.21? ± 0.78）?μmol/L，i 值為（2.84 ± 0.33）μmol/L]，逆轉(zhuǎn) NDM-1 陽性表達(dá)菌株對(duì)碳青霉烯類抗生素的抗性。在產(chǎn) NDM-1 的大腸桿菌 XJ141026 感染的小鼠膿毒癥模型中，0.1 mg/kg thanatin 與美羅培南聯(lián)合使用即可顯著提高實(shí)驗(yàn)組小鼠的存活率，降低肝臟及脾臟的細(xì)菌負(fù)荷[25]。

2.2 與氨基酸殘基相互作用的抑制劑

2.2.1 紫檀芪 紫檀芪（圖 2）是一種最初從紫檀中分離出的酚類化合物，在傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中被用于糖尿病的治療[26]。在近期報(bào)道中，Liu 等[27]通過體外和體內(nèi)活性檢測(cè)揭示了紫檀芪作為 NDM-1 抑制劑的潛能。紫檀芪可以劑量依賴性地抑制 NDM-1 的活性（IC50值為 15.37 μg/ml），并可恢復(fù)美羅培南對(duì) NDM-1 陽性表達(dá)菌株的抗菌效果。在小鼠大腿感染（NDM-1 陽性菌）實(shí)驗(yàn)中，紫檀芪與美羅培南聯(lián)合給藥組小鼠大腿的細(xì)菌負(fù)荷顯著降低；在小鼠肺炎模型（NDM-1 陽性菌感染）實(shí)驗(yàn)中，紫檀芪與美羅培南聯(lián)合給藥可使實(shí)驗(yàn)小鼠的存活率顯著升高[27]。分子動(dòng)態(tài)模擬結(jié)果提示，紫檀芪與 NDM-1 的氨基酸殘基 Trp93和 Asp124形成較強(qiáng)的相互作用，從而占據(jù) NDM-1 的催化口袋，阻礙 NDM-1 與底物結(jié)合，降低 NDM-1 的催化性能。

2.2.2 厚樸酚 厚樸酚（圖 2）是從木蘭樹皮中分離得到的天然產(chǎn)物，可通過與 NDM-1催化口袋的氨基酸殘基形成氫鍵或疏水相互作用阻礙酶與底物的結(jié)合，降低 NDM-1 的催化活性（IC50值為 6.47 μg/ml）[28]。厚樸酚可以恢復(fù)美羅培南對(duì)產(chǎn) NDM-1 的大腸桿菌 ZC-YN3 的抗菌活性，并在聯(lián)合用藥3 h 時(shí)達(dá)到完全殺菌的效果。分子對(duì)接結(jié)果顯示，厚樸酚可與 NDM-1 的氨基酸 Ser217形成氫鍵，并與 Val73、Lys211、Leu218、Gly219和 His250等氨基酸殘基相互作用[28]。

2.2.3 3-溴丙酮酸 小分子化合物 3-溴丙酮酸（圖 2）對(duì) B1 類和 B2 類 MBLs 有潛在抑制活性，尤其以對(duì)NDM-1 的作用最為顯著（IC50值為 2.57 μmol/L），并且在三株不同 NDM-1 陽性表達(dá)的臨床分離菌株中，3-溴丙酮酸可不同程度地降低頭孢噻肟、美羅培南等 5 種 β-內(nèi)酰胺類藥物的 MIC[29]。鑒于 3-溴丙酮酸的類似物丙酮酸對(duì) NDM-1 并無抑制活性，且活性測(cè)試表明 3-溴丙酮酸可能靶向MBLs 活性中心的半胱氨酸殘基，研究者推斷，3-溴丙酮酸可能通過親電性亞甲基與 NDM-1 活性部位的半胱氨酸硫醇形成共價(jià)結(jié)合以實(shí)現(xiàn)對(duì) NDM-1 的可逆性抑制[29]。該推斷在接下來的硫醇化合物競(jìng)爭(zhēng)實(shí)驗(yàn)中得到了初步證實(shí)，硫醇化合物（如二硫蘇糖醇、半胱氨酸）與 3-溴丙酮酸同時(shí)使用可以恢復(fù) NDM-1 的催化活性。

圖 2 與氨基酸殘基相互作用的抑制劑

2.2.4 1,4,7-三氮雜環(huán)壬烷 1,4,7-三氮雜環(huán)壬烷（1,4,7-triazacyclononane，TACN，圖 2）是歸屬于 NOTA和 1,4,7,10-四氮雜環(huán)十二烷-1,4,7,10-四乙酸（1,4,7,10- tetraazacyclododecane-1,4,7,10-tetraacetic acid，DOTA）系列的環(huán)狀化合物。Somboro 等[30]發(fā)現(xiàn)，TACN 可恢復(fù)美羅培南對(duì)產(chǎn) B1 類 MBLs 的臨床分離菌株的抗菌活性，但對(duì)產(chǎn) SBLs 的菌株無明顯作用。酶活性實(shí)驗(yàn)提示 TACN 對(duì) NDM-1 的抑制作用呈濃度依賴性和時(shí)間依賴性，通過計(jì)算機(jī)模擬技術(shù)進(jìn)一步分析 TACN 與 NDM-1 之間的相互作用，結(jié)果表明，TACN 可能通過氫鍵（His250和 Asp124）和疏水相互作用（His122、Asn220和 Trp93）與 NDM-1 結(jié)合從而抑制其催化活性[30]。

2.2.5 對(duì)氯汞苯甲酸和硝普鹽 對(duì)氯汞苯甲酸（p-chloromercuribenzoic acide，p-CMB，圖 2）和硝普鹽是 Thomas 等[31]基于高通量篩選模型從 LOPAC 化合物庫中篩選得到的兩個(gè)潛在 NDM-1 抑制劑，兩者均為硫醇修飾化合物。質(zhì)譜分析結(jié)果顯示，p-CMB 與 NDM-1 的共價(jià)結(jié)合與氨基酸 Cys208相關(guān)。然而，當(dāng)研究者將 Asp 替代 NDM-1 活性部位的 Cys208，突變型 NDM-1 幾乎保持了完全的酶活性，但卻喪失了對(duì) p-CMB 的反應(yīng)性，這提示我們針對(duì) NDM-1 中的 Cys 殘基進(jìn)行藥物設(shè)計(jì)的策略可能存在局限性[31]。

2.3 同時(shí)作用于鋅離子和氨基酸殘基的抑制劑

2.3.1 雙環(huán)硼酸鹽 雙環(huán)硼酸鹽作為潛在廣譜 β-內(nèi)酰胺酶抑制劑被多次報(bào)道，其作用機(jī)制為模擬 β-內(nèi)酰胺酶催化過程中的陰離子高能四面體中間體，抑制 SBLs/MBLs 的活性，在該過程中，硼酸鹽可能優(yōu)先以 sp2 雜化形式（硼原子）與 SBLs/MBLs 結(jié)合，以 sp3 形式（硼原子）形成穩(wěn)定的酶-抑制劑復(fù)合物[32-35]。雙環(huán)硼酸鹽的代表性化合物 VNRX-5133（taniborbactam，圖 3）與第四代頭孢菌素——頭孢吡肟的聯(lián)合用藥方案目前正處于 III 期臨床試驗(yàn)階段[35]。Liu 等[35]在最近的研究中指出，VNRX-5133 對(duì)所檢測(cè)的 SBLs（如 KPC-2、AmpC、OXA-1/48）及 MBLs（NDM-1 和 VIM-2）均有較好的抑制活性。當(dāng) VNRX-5133 與頭孢吡肟聯(lián)合用藥時(shí)，VNRX-5133 可顯著提高頭孢吡肟對(duì)產(chǎn) SBLs/MBLs 革蘭氏陰性耐藥株的抗菌活性[35]。在中性粒細(xì)胞缺乏的小鼠肺部感染模型（產(chǎn) CTX-M-14 的肺炎克雷伯菌）和小鼠泌尿道上行感染模型（產(chǎn) CTX-M-15 的大腸桿菌）中，VNRX-5133 與頭孢吡肟聯(lián)合使用可分別降低肺部組織和腎內(nèi)的活菌數(shù)[35]。

2.3.2 卡托普利及其衍生物 卡托普利作為已上市的降血壓藥物，可通過巰基與 NDM-1 催化口袋的兩個(gè)鋅離子配位結(jié)合，通過羧基與 Asn220形成氫鍵，抑制 NDM-1 的活性（D-卡托普利，圖 3，IC50值為 7.9 μmol/L；L-卡托普利，圖 3，IC50值為 202.0 μmol/L）[36-38]。Li 等[39]在卡托普利結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上進(jìn)行設(shè)計(jì)優(yōu)化，合成的 3-巰基-2-甲基丙酸的芐酰胺衍生物化合物 22（圖 3）展現(xiàn)出對(duì) NDM-1 較好的抑制作用，IC50值為 1.0 μmol/L。Meng 等[40]合成的衍生物 14m（圖 3）也可顯著抑制 NDM-1 的催化活性，IC50值為 0.12 μmol/L，與美羅培南聯(lián)合使用可顯著增強(qiáng) NDM-1 陽性臨床分離菌株對(duì)美羅培南的敏感性。

2.3.3 蒽貝素 蒽貝素（圖 3）是從白花酸藤果中分離出的苯醌衍生物，Ning 等[41]首次報(bào)道了蒽貝素對(duì) NDM-1 的抑制活性，IC50值為（2.1 ± 0.2）μmol/L，i 值為（0.19 ± 0.02）μmol/L。分子動(dòng)力學(xué)研究表明，蒽貝素以其醌基部分與 NDM-1 結(jié)合，脂肪烴鏈部分則滯留在 NDM-1 催化口袋以外，蒽貝素與氨基酸殘基 Cys208和 Asp124形成的兩個(gè)氫鍵可能是其與 NDM-1 特異性識(shí)別與結(jié)合的分子基礎(chǔ)，此外，苯醌上的羥基可直接與 NDM-1 活性部位的 Zn2+配位結(jié)合[41]。蒽貝素可恢復(fù)多種 β-內(nèi)酰胺類抗生素對(duì)產(chǎn) NDM-1 的肺炎克雷伯菌 BAA-2146 的抗菌活性，當(dāng)蒽貝素的濃度為 32 μg/ml 時(shí)，可分別使美羅培南、比阿培南和亞胺培南的 MIC 降低至原來的 1/512、1/128 和 1/256。

2.3.4 黃芩苷 黃芩苷（圖3）是從黃芩中提取的主要活性成分，對(duì) NDM-1 有良好的抑制作用[IC50值為（3.89 ± 1.1）μmol/L][42]。分子對(duì)接結(jié)果顯示，黃芩苷可通過羧基直接作用于 NDM-1 活性部位的 Zn2+，并可與酶多處氨基酸殘基（Glu152、Gln123、Met67、Trp93和 Phe70）形成氫鍵[42]。進(jìn)一步活性測(cè)試表明，黃芩苷可恢復(fù) NDM-1 重組工程菌對(duì)頭孢呋辛及氨芐青霉素的敏感性，當(dāng)黃芩苷濃度為64 μg/ml 時(shí)，可使兩者的 MIC 降低至原來的 1/16。

圖 3 同時(shí)作用于鋅離子和氨基酸殘基的抑制劑

2.3.5 三唑硫代乙酰胺類化合物 Zhang 等[43]在 2014 年報(bào)道二芳基取代的唑基硫代乙酰胺衍生物（圖 3）對(duì) NDM-1有抑制作用（i < 7 μmol/L），其三唑基團(tuán)可與 NDM-1 活性中心的鋅離子配位結(jié)合。2016 年該團(tuán)隊(duì)以三唑硫代乙酰胺為骨架合成的 24 個(gè)三唑硫代乙酰胺類化合物均對(duì) NDM-1 有抑制活性，IC50值為 0.15 ~ 1.90 μmol/L[44]。分子對(duì)接結(jié)果表明，其代表性化合物 4d 和 6c 的三唑環(huán)可與 NDM-1 活性部位的 Zn1 和 Zn2 直接作用，酰胺鍵可與氨基酸 Lys211（Lys224）相互作用，以此形成與 NDM-1 的穩(wěn)定結(jié)合[44]。該團(tuán)隊(duì)在 2019 年再次發(fā)表研究，揭示了鹵代三唑硫代乙酰胺作為 MBLs 抑制劑的潛能，其中氯代化合物 1、2、3 對(duì) NDM-1 有抑制作用，IC50值低于0.96 μmol/L[45]。

2.3.6 ZINC84525623 ZINC84525623（圖 3）是 Rehman 等[46]利用高通量虛擬篩選技術(shù)在 ZINC 庫中發(fā)現(xiàn)的潛在 NDM-1 抑制劑，其通過與氨基酸Gln123、Asp124、Lys211和 Asn220形成氫鍵，與 Zn2 和 Asp124形成靜電作用，與 His250等氨基酸殘基形成疏水相互作用而與 NDM-1 酶活性中心穩(wěn)定結(jié)合。在 IC50檢測(cè)實(shí)驗(yàn)中，ZINC84525623 展現(xiàn)出略低于 D-卡托普利的抑制活性，可使 NDM-1 的催化效能（cat/m）降低至原來的 1/3.13 ~ 1/7.37[46]。

2.4 抑制 NDM-1 表達(dá)的抑制劑

不同于以往 NDM-1 抑制劑的篩選和設(shè)計(jì)理念，Sully 等[47]構(gòu)建靶向 NDM-1 mRNA 的肽偶聯(lián)磷酸二酰胺嗎啉低聚物（peptide-conjugated phosphorodiamidate morpholino oligomer，PPMO），從基因水平干預(yù) NDM-1 的表達(dá)。體外活性檢測(cè)結(jié)果表明，NDM-1 PPMO 可抑制NDM-1 的表達(dá)，繼而恢復(fù) NDM-1 陽性菌株對(duì)碳青霉烯類藥物的敏感性。在表達(dá)NDM-1 的大腸桿菌 CVB-1 感染的小鼠膿毒癥模型中，PPMO 與美羅培南聯(lián)合使用可顯著提高感染小鼠的生存率，降低血液和脾臟中的細(xì)菌負(fù)荷，緩解炎癥反應(yīng)[47]。

2.5 機(jī)制尚不明確的抑制劑

2.5.1 植物葉片提取物 Chandar 等[48]通過對(duì) 240 種藥用植物葉片的乙醇提取物進(jìn)行篩選，得到來自石榴、大麻槿、酸角等 6 種植物的提取物對(duì) NDM-1 具有體外抑制活性，IC50值在 0.50 ~ 1.2 ng/μl 之間。除對(duì) NDM-1 有抑制活性外，這 6 種化合物還可通過破壞細(xì)菌細(xì)胞壁的完整性來發(fā)揮抗菌作用。當(dāng)分別與黏菌素、美羅培南和四環(huán)素聯(lián)合給藥時(shí)，6 種化合物均發(fā)揮協(xié)同抗菌作用，（fractional inhibitory concentration index，為 0.09 ~ 0.375[48]。然而，上述提取物的抗菌活性是否為多種化合物的組合或源于某單個(gè)高效化合物仍需進(jìn)一步確證。

2.5.2 ANT431 ANT431（圖4）是基于苗頭化合物吡啶-2-羧酸進(jìn)行設(shè)計(jì)修飾所得到的MBLs 特異性抑制劑[49]。ANT431 可競(jìng)爭(zhēng)性抑制 NDM-1 和 VIM-2 的活性，i 值分別為0.29 和 0.195 μmol/L[49]。當(dāng) ANT431 濃度為 30 μg/ml 時(shí)，可顯著提高美羅培南對(duì)重組 NDM-1/VIM-2 表達(dá)工程菌的活性，并可使美羅培南對(duì) 79% 所檢測(cè)的 NDM-1 陽性臨床分離菌株的 MIC 降低至藥敏水平：2 μg/ml。在產(chǎn) NDM-1 的臨床分離大腸桿菌IR3 感染的小鼠大腿感染模型中，ANT431 與美羅培南聯(lián)合用藥可顯著降低感染大腿的細(xì)菌負(fù)荷。與體內(nèi)其他金屬酶如 ACE 相比，ANT431 對(duì) MBLs 具有良好的選擇性，且藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)良好，顯示出較高的成藥潛能[49]。遺憾的是，研究者并未詳細(xì)闡述 ANT431 發(fā)揮 NDM-1 抑制活性的分子機(jī)制，其具體作用方式有待進(jìn)一步探討。

ANT431

3 展望

近年來，NDM-1 及其變異體在包括中國在內(nèi)的眾多國家迅速擴(kuò)散，這不僅歸因于其在不同菌種間的高頻轉(zhuǎn)移，也與旅行、衛(wèi)生等人為因素息息相關(guān)[50]。盡管在過去的幾年中，研究者圍繞 NDM-1 的結(jié)構(gòu)特征、生物學(xué)功能和作用機(jī)制展開了一系列研究，但至今沒有可用于臨床的 NDM-1 特效抑制劑，攜帶 NDM-1 的臨床相關(guān)細(xì)菌儼然已成為治療感染性疾病的巨大威脅[4]。

隨著由 NDM-1 導(dǎo)致的細(xì)菌耐藥問題日益嚴(yán)峻，積極尋找高效抑制劑輔助 β-內(nèi)酰胺類抗生素治療成為對(duì)抗產(chǎn) NDM-1 耐藥細(xì)菌的重要策略[50]。然而，縱觀 NDM-1 抑制劑的研發(fā)歷程，研究者頻頻受挫，其中，催化機(jī)制不清是阻礙抑制劑研發(fā)的重要因素。NDM-1 的活性位點(diǎn)位于一個(gè)由柔性環(huán)（L3 和 L10）限定的寬而淺的槽中，促使酶具備與廣泛底物結(jié)合的特征，然而，NDM-1 與不同底物的具體結(jié)合模式不甚相同，結(jié)合位點(diǎn)具有可塑性，為抑制劑靶向目標(biāo)的確立增加了難度[4, 51]。

目前，既能螯合 NDM-1 活性部位的鋅離子，又能與結(jié)合位點(diǎn)的氨基酸殘基形成氫鍵和（或）鹽橋的分子被認(rèn)為是最具潛力的 NDM-1 抑制劑[4]。盡管螯合 NDM-1 活性部位的鋅離子常常被作為篩選和設(shè)計(jì) NDM-1 抑制劑的重要策略，但由于依賴鋅離子的酶在人體內(nèi)廣泛存在，基于此策略得到的化合物的“脫靶效應(yīng)”仍需慎重考量和規(guī)避；同時(shí)，NDM-1 的突變正趨向于增強(qiáng)體內(nèi)鋅離子親和力，提高對(duì)鋅離子缺乏的耐受，為未來抑制劑的研發(fā)擲出了新的難題[52]。雙環(huán)硼酸鹽類化合物 VNRX-5133 與頭孢吡肟的聯(lián)合用藥方案已進(jìn)入 III 期臨床試驗(yàn)階段，這為科研工作者們提供了新的思路，即通過模擬 β-內(nèi)酰胺類抗生素水解過程中的四面體中間體有望實(shí)現(xiàn)對(duì) SBLs 和 MBLs 的雙重抑制。

隨著生物學(xué)、藥物化學(xué)等多學(xué)科知識(shí)與技術(shù)的發(fā)展，NDM-1 與底物的作用模式及規(guī)律有望得到更精確、更完善的闡述，從而助力 NDM-1 抑制劑的研發(fā)，緩解“超級(jí)細(xì)菌”的耐藥現(xiàn)狀。

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國家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（81872913）；國家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃（863 計(jì)劃）（2015AA 020911）

劉憶霜，Email：liuys@imb.pumc.edu.cn

2020-04-03

10.3969/j.issn.1673-713X.2020.06.009