分離白細胞法、低滲紅細胞法、全血直提法提取的凍存血RNA質(zhì)量及其反轉(zhuǎn)錄后基因擴增效果

劉欣，彭賀含，唐曉慧，楊四梅，趙商岐，鄭佳，周曉濤

1 新疆醫(yī)科大學研究生院，新疆烏魯木齊830011；2新疆昌吉職業(yè)技術(shù)學院;3 新疆中醫(yī)學院；4新疆軍區(qū)總醫(yī)院；5 新疆醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院

RNA是基因表達過程中非常重要的分子，從細胞或組織中分離出RNA能更好的進行基因功能研究，其分離提取方法也是分子生物學最常用的技術(shù)。在臨床工作中，外周血采集簡單，對患者創(chuàng)傷小，是理想的RNA來源。目前常用的RNA提取方法有試劑盒法、SDS法、TRIzol法[1-3]等，這些方法在外周血RNA提取中得到了廣泛應用。但在實際工作中，患者標本的采集情況非常復雜，許多血液標本在采集后需立即凍存于-80 ℃或-20 ℃環(huán)境中，待完全收集齊后才開展實驗，一些年代較早的臨床標本基本都是以這種方式保存的。由于長期凍存對血液標本成分的影響以及廣泛存在的核糖核酸酶(RNase)，使得從凍存血中提取數(shù)量和質(zhì)量都能滿足研究的RNA變得比較困難。有學者[4]用TRIzol法比較新鮮的馬血和凍存馬血提取RNA的差異，結(jié)果顯示新鮮血液中提取的RNA在濃度和純度均好于凍存血?；诳蒲械膶嶋H需求，特別是一些經(jīng)過多年收集積累的凍存血標本，急需尋找一種有效的凍存血RNA提取方法。有研究[5]利用分離白細胞法從系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者在-80 ℃中凍存1年的全血中提取了數(shù)量和質(zhì)量都能滿足要求的RNA。還有研究[6]利用低滲紅細胞法和全血直提法也從-80 ℃的凍存血中提取到了RNA。2019年6月1日～2020年1月20日，本研究觀察了分離白細胞法、低滲紅細胞法、全血直提法提取的凍存血RNA質(zhì)量及其反轉(zhuǎn)錄后基因擴增效果，現(xiàn)將結(jié)果報告如下。

1 材料與方法

1.1 RNA提取方法及分組 正常全血標本12例份，每例份血量約2.5 mL左右，于-80 ℃條件下凍存半年后，又置于-20 ℃條件下凍存半年。將凍存血標本12例份隨機分為3組，分別采用分離白細胞法、低滲紅細胞法、全血直提法提取RNA，提取出的RNA溶液分別記為A、B、C組。

1.1.1 分離白細胞法提取RNA 血液標本從-20 ℃冰箱取出后放置于室溫環(huán)境，待標本血漿層融化后向其中加入2.5 mL Hanks液，用加樣槍慢慢吹打混勻直至細胞層完全融化；取15 mL離心管，先加入5 mL淋巴細胞分離液待用，再將5 mL血液標本沿離心管壁緩慢地加到淋巴細胞分離液界面，20 ℃條件下2 000 r/min離心20 min；離心后離心管的界面分為3層，棄上層和中間層，向底層沉淀再加入5 mL的Hanks液，輕輕吹打混勻，20 ℃條件下2 000 r/min再離心10 min，棄上清液，留底層。將底層沉淀物轉(zhuǎn)入新的EP管中，加入1 mL TRIzol充分混勻，室溫靜置5 min，加入0.2 mL氯仿，用力振蕩15 s，靜置2 min，4 ℃條件下12 000 r/min離心15 min。離心后樣品分3層，RNA主要在上層水相中。取上清加入0.5 mL異丙醇，將管中液體輕輕混勻，室溫靜置10 min，4 ℃條件下12 000 r/min離心10 min，棄上清，加入1 mL 75%乙醇，輕輕洗滌沉淀，4 ℃條件下7 500 r/min離心5 min，棄上清，晾干，加入20 μL的DEPC水溶解，即為提取的RNA溶液，記為A組。

1.1.2 低滲紅細胞法提取RNA 血液標本從-20 ℃冰箱取出后，直接與DEPC水按照1∶1比例進行稀釋，靜置5 min，然后用加樣槍慢慢吹打混勻，直到標本完全融化，轉(zhuǎn)入新的EP管中，4 ℃條件下12 000 r/min離心10 min，棄上清，留底物。底物中加入1 mL Trizol充分混勻，室溫靜置5 min，加入0.2 mL氯仿，用力振蕩15 s，靜置2 min，4 ℃條件下12 000 r/min離心15 min。離心后樣品分3層，RNA主要在上層水相中。取上清加入0.5 mL異丙醇，將管中液體輕輕混勻，室溫靜置10 min，4 ℃條件下12 000 r/min離心10 min，棄上清，加入1 mL 75%乙醇，輕輕洗滌沉淀，4 ℃條件下7 500 r/min離心5 min，棄上清，晾干，加入20 μL的DEPC水溶解，即為提取的RNA溶液，記為B組。

1.1.3 全血直提法提取RNA 血液標本從-20 ℃冰箱取出后，直接加入1 mL TRIzol于凍存管中，出現(xiàn)白色絮狀物后，靜置10 min，用加樣器吹打混勻，此時底部的血細胞會聚集成膠黏的團塊狀，黏附在加樣槍上，較難混勻。先將加樣槍深入底部沿著一個方向轉(zhuǎn)10-15下，保證凍存管底部沒有細胞沉淀，然后加樣槍再來回上下運動2～3 min，充分混勻后，將細胞裂解液移至EP管中，4 ℃條件下16 000 r/min離心1 min，吸出管底絮狀沉淀，直接加入0.2 mL氯仿，用力振蕩15 s，靜置2 min，4 ℃條件下12 000 r/min離心15 min。離心后樣品分3層，RNA主要在上層水相中。取上清加入0.5 mL異丙醇，將管中液體輕輕混勻，室溫靜置10 min，4 ℃條件下12 000 r/min離心10 min，棄上清，加入1 mL 75%乙醇，輕輕洗滌沉淀，4 ℃條件下7 500 r/min離心5 min，棄上清，晾干，加入20 μL的DEPC水溶解，即為提取的RNA溶液，記為C組。

1.2 各組RNA濃度、RNA純度觀察 打開NANODROP 1000分光光度計取樣臂，先用2 μL DEPC水校準歸零，再吸取2 μL各組RNA溶液放置在測量基座的表面接收光纖的末端上，檢測各組RNA濃度、RNA在230、260、280 nm處的吸光度值，計算OD(A260/A280)值、OD(A260/A230)值，以OD(A260/A280)值、OD(A260/A230)值表示RNA純度。

1.3 各組RNA完整性觀察 稱取0.4 g瓊脂糖加入燒瓶，加入1×TBE溶液20 mL搖勻，微波爐煮沸溶解30 s、3次，待瓊脂糖溶膠稍冷卻，加入3滴溴化乙錠(EB)，輕輕混勻，配成2%瓊脂糖凝膠。取合適孔徑點樣梳垂直放入膠板一端，再將凝膠輕輕倒入，防止產(chǎn)生氣泡，待凝膠凝固后，取出點樣梳。電泳槽中加入1×TBE電泳緩沖液，膠板放入電泳槽中，點樣孔靠近負極。取4 μL各組RNA溶液與1 μL溴酚藍Loading Buffer在塑料薄膜上混勻，依次加入上樣孔，電泳設定電壓110 V，電流200 mA，時間40 min，當指示劑跑過膠板的2/3時，用凝膠成像系統(tǒng)采集圖像，觀察電泳條帶情況。

1.4 各組RNA反轉(zhuǎn)錄后基因擴增效果觀察 ①采用PCR法。取各組RNA溶液1 μg，加入1 μL Random、1 μL 10 nmdNTP和DEPC ddH2O配成10 μL體系，65 ℃孵育5 min，置于冰上孵育1 min，再加入2 μL 10×RT buffer、4 μL 25 μm MgCl2、2 μL 0.1 MDTT、0.5 μL RNase Out、0.5 μL SSⅢRT、1 μL ddH2O，配成20 μL反應體系，利用PCR儀反轉(zhuǎn)錄得到cDNA。反轉(zhuǎn)錄條件：25 ℃ 10 min，50 ℃ 50 min，85 ℃ 5 min，4 ℃ 終止。將20 μL cDNA產(chǎn)物用ddH2O稀釋至100 μL分裝保存待用。在25 μL PCR反應體系里，分別加入cDNA 2 μL，上下引物(10 μm/L)各1 μL，2×Taq PCR Master Mix 12.5 μL，再加入RNase-free water至25 μL，以94 ℃、4 min預變性；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，擴增35個循環(huán)，72 ℃延伸8 min，4 ℃ 終止。反應結(jié)束后，取5 μL反應產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，觀察RNA反轉(zhuǎn)錄后的擴增產(chǎn)物電泳條帶情況。②采用qPCR法。取各組RNA溶液，反轉(zhuǎn)錄成cDNA后，進行qPCR反應。qPCR反應體系20 μL：cDNA 2 μL，上下引物各0.8 μL，2×SYBR Green PCR Master Mix 10 μL，RNase-free water 至20 μL。qPCR反應條件：95 ℃ 2 min，95 ℃ 2 s，60 ℃ 10 s，擴增40個循環(huán)，最后在65～95 ℃條件下制備溶解曲線，計算循環(huán)閾值(Ct值)。Ct值是每個反應管內(nèi)的熒光信號到達設定閾值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)，Ct值越小，表示RNA反轉(zhuǎn)錄后基因擴增效果越好。

2 結(jié)果

2.1 各組RNA濃度、RNA純度比較 各組RNA濃度、OD(A260/A280)值、OD(A260/A230)值比較見表1。由表1可知，A組RNA濃度、OD(A260/A280)值、OD(A260/A230)值均高于B、C組(P均<0.05)，且B組和C組OD(A260/A230)值均<2，說明B組和C組RNA提取過程中受到鹽溶液污染或者有裂解液殘留，純度不好。

表1 各組總RNA濃度、OD(A260/A280)值、OD(A260/A230)值比較

2.2 各組RNA完整性比較 各組RNA瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果見圖1。由圖1可知，A組沒有出現(xiàn)任何條帶，B組條帶嚴重彌散，C組有條帶存在，說明C組RNA完整性較好。

圖1 各組RNA瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果

2.3 各組RNA反轉(zhuǎn)錄后基因擴增效果比較 ①PCR實驗結(jié)果顯示，A、B、C組RNA均能在反轉(zhuǎn)錄成cDNA后，用于基因擴增，其中C組得到的擴增產(chǎn)物條帶最為明亮，說明C組RNA反轉(zhuǎn)錄后基因擴增效果較好，見圖2。②qPCR實驗結(jié)果顯示，A、B、C組Ct值分別為28.27±1.01、27.49±0.22、24.20±0.25，其中C組Ct值與A、B組相比，P均<0.05，說明C組RNA反轉(zhuǎn)錄后基因擴增效果較好。

3 討論

本研究通過檢索文獻[7-9]，找到了三種從凍存血中提取RNA的方法：分離白細胞法、低滲紅細胞法及全血直提法。其中，分離白細胞法通過淋巴細胞分離液對室溫融化的凍存血進行分離，在底層物質(zhì)中加入TRIzol后進行RNA的提取。低滲紅細胞法是在血液標本凍存的狀態(tài)下，直接加入DEPC水，利用DEPC水去除RNA酶，同時通過低滲的方法將紅細胞全部破壞，最后利用TRIzol進行抽提。全血直提法則是將TRIzol直接加入凍存血中進行RNA抽提。這些方法的共同之處，都是為了避免RNA酶的干擾。

圖2 各組RNA反轉(zhuǎn)錄后PCR擴增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果

A260是RNA的吸收峰，A280是蛋白質(zhì)的吸收峰，A230是其他碳源物質(zhì)的吸收峰，因此可以根據(jù)OD(A260/A280)值和OD(A260/A230)值來判斷RNA純度。若OD(A260/A280)值在1.8-2.1之間，則提取的RNA純度較理想；若OD(A260/A280)值<1.8，則存在蛋白質(zhì)污染；若OD(A260/A280)值>2.2，說明RNA已降解成單核苷酸。OD(A260/A230)值一般要大于2.0，比值較小，說明有裂解液的殘留或鹽溶液的污染，提取的RNA純度不好。在對RNA濃度檢測的結(jié)果中，可以看出A組提取的RNA純度跟濃度都是最好的，其OD(A260/A280)值為1.89±0.18，OD(A260/A230)值為2.94±2.42，濃度為(424.13±102.24)ng/μL。B組提取的RNA中，OD(A260/A230)值為0.79±0.23，推測有裂解液殘留或鹽溶液污染；C組提取的RNA中，OD(A260/A280)值為1.77±0.07，有蛋白質(zhì)污染。

但在對RNA完整性檢測的瓊脂糖電泳中，可以看到A組無條帶，可能是由于提取的RNA已經(jīng)降解，呈片段化，堿基暴露，所以雖然可以檢測出RNA濃度，但降解后的片段太小，EB染色無法顯示條帶。B組條帶嚴重彌散，可能存在RNA降解、DNA污染或外源性RNase污染。C組的結(jié)果相對較好，但也存在RNA降解。

為了進一步驗證RNA反轉(zhuǎn)錄后基因擴增效果，以等量RNA反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板，利用PCR擴增β-actin，三種方法均在110 bp處出現(xiàn)了特異性條帶，但C組的條帶更為明亮，說明C組RNA反轉(zhuǎn)錄后基因擴增效果較好。在qPCR實驗中，Ct值又被稱為循環(huán)閾值，其與模板起始拷貝數(shù)存在負相關(guān)的線性關(guān)系，即起始拷貝數(shù)越多，Ct值越低。C組的Ct值明顯低于其他兩種方法，進一步也說明其RNA反轉(zhuǎn)錄后基因擴增效果較好。

綜上所述，本研究通過分離白細胞法、低滲紅細胞法、全血直提法三種方法對凍存血RNA進行提取，檢測3種方法所得的RNA濃度、RNA純度、RNA完整性，后將各組RNA反轉(zhuǎn)錄制備cDNA進行PCR和qPCR擴增β-actin內(nèi)參基因，觀察三種方法提取的RNA反轉(zhuǎn)錄后基因擴增效果，結(jié)果顯示全血直提法在凍存血中提取的RNA完整性高，其反轉(zhuǎn)錄后基因擴增效果較好。但是，全血直提法在標本的前處理過程中較為麻煩，凍存血中直接加入TRIzol后，吹打混勻過程中血細胞聚集成膠黏的團塊狀，黏附在容器壁上，需要用槍頭裹挾著膠黏的團塊在容器壁上反復旋轉(zhuǎn)保證血液全部溶解，但容器壁上仍舊會有少量血細胞殘留，影響RNA的提出量。