消乳散結(jié)膠囊灌胃對小鼠漿細胞性乳腺炎的治療作用及其機制

劉洋，孫玉石，湯小江，何建軍

西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院，陜西西安710061

漿細胞性乳腺炎是一種慢性非感染性的乳腺炎癥，多發(fā)于30-40歲的非哺乳期或絕經(jīng)前期婦女[1]。漿細胞性乳腺炎病理特征為乳腺導(dǎo)管周圍有大量漿細胞、淋巴細胞及少量中性粒細胞、多核巨細胞浸潤，尤以漿細胞浸潤為主[2]。漿細胞是由B淋巴細胞分化而來，并且漿細胞沒有進一步增殖分化的能力，IL-6對漿細胞的分化和生存都有重要作用，它能通過IL-6/JAK2/STAT3通路使B細胞向漿細胞分化，還能誘導(dǎo)抗凋亡蛋白Bcl-2的產(chǎn)生從而抑制漿細胞凋亡。我們前期研究[3,4]結(jié)果表明，IL-6/JAK2/STAT3通路在漿細胞性乳腺炎發(fā)病過程中扮演重要作用。另外，我們在慢性乳腺炎的基礎(chǔ)上給予IL-6激活I(lǐng)L-6/JAK2/STAT3通路成功建立小鼠漿細胞性乳腺炎模型[4]，這為我們在動物體內(nèi)探索漿細胞性乳腺炎的有效治療藥物提供了可能。

現(xiàn)階段漿細胞性乳腺炎的治療主要是手術(shù)治療，但術(shù)后很容易復(fù)發(fā)，這使得需要反復(fù)多次的手術(shù)，甚至有些患者最后不得不切除整個乳房[5]。另據(jù)國內(nèi)外報道，漿細胞性乳腺炎發(fā)病率近年呈上升趨勢，約占乳腺良性疾病的4%～5%[6]。但目前臨床上沒有明確有效地治療此癥的藥物。消乳散結(jié)膠囊是臨床上常見藥，其不良反應(yīng)較小，被廣泛用于治療乳腺增生癥。但是,目前沒有研究報道消乳散結(jié)膠囊是否對漿細胞性乳腺炎有治療價值。2019年1月10日～2019年12月21日，本研究觀察了消乳散結(jié)膠囊灌胃對漿細胞性乳腺炎小鼠的治療作用，并探討其機制。

1 材料與方法

1.1 小鼠、試劑與儀器 6～8周齡、體質(zhì)量18～20 g的Balb/c雌性小鼠購自西安交通大學(xué)實驗動物中心并飼養(yǎng)于該中心。消乳散結(jié)膠囊購自山東步長神州制藥有限公司。VCX-130超聲波細胞粉粹機購自美國Sonics公司，光學(xué)顯微鏡購自日本Olympus公司，低溫高速離心機購自德國Eppendorf公司。兔抗小鼠p-JAK2Y1007/1008單克隆抗體、兔抗小鼠CD138單克隆抗體購自英國Abcam公司；兔抗小鼠p-STAT3Y705單克隆抗體購自美國Cell Signaling公司；兔抗小鼠Bcl-2多克隆抗體美國Bio-World公司；IL-6 ELISA試劑盒購自美國RayBiotech公司；完全弗氏佐劑購自美國Sigma公司；重組小鼠IL-6購自美國PeproTech公司。

1.2 漿細胞性乳腺炎小鼠模型制備、分組及消乳散結(jié)膠囊給予方法 取未污染的人體正常乳腺組織，與生理鹽水以1∶3比例加入消毒的混勻機導(dǎo)管內(nèi)，以中等速度混勻5 min(溫度3～4 ℃)，在超聲波細胞粉粹機中粉碎，然后儲存于標(biāo)本盒內(nèi)；標(biāo)本與同等體積的完全弗氏佐劑用注射器在4 ℃下重復(fù)混勻20 min，即制成混勻液。6～8周齡性成熟的雌性Balb/c小鼠用0.3%的水合氯醛腹腔注射麻醉小鼠，75%酒精消毒皮膚，在右側(cè)第4對乳腺腺葉處皮下注射混勻液0.05 mL，觀察3周，建立慢性乳腺炎模型，1周后在腫塊周圍皮下注射1 μg/mL小鼠重組IL-6蛋白0.05 mL，1周后漿細胞性乳腺炎小鼠模型造模完成[4]。將30只造模成功的小鼠隨機分成消乳散結(jié)中劑量組、消乳散結(jié)高劑量組、生理鹽水組，每組10只，消乳散結(jié)中劑量組、消乳散結(jié)高劑量組分別以50 mg/kg、100 mg/kg消乳散結(jié)膠囊灌胃，生理鹽水組給予等量生理鹽水灌胃，每日一次，連續(xù)治療28 d后用于實驗。

1.3 各組小鼠乳腺組織病理觀察 取各組小鼠，用0.3%的水合氯醛腹腔注射麻醉，取乳腺腫塊標(biāo)本，切取部分組織用10%甲醛固定48 h，脫水、包埋、切片、脫蠟后，用伊紅-蘇木素染液染色，透明封固，最后中性樹膠封片，于Olympus BX51顯微鏡下觀察。

1.4 各組小鼠乳腺組織中CD138陽性漿細胞比例測算 取各組小鼠，用0.3%的水合氯醛腹腔注射麻醉，取乳腺腫塊標(biāo)本，切取部分組織用10%甲醛固定48 h，將石蠟切片脫蠟水化，3%的H2O2室溫孵育20 min，將切片浸入10 mmol/L檸檬酸緩沖液(pH 6.0)，煮沸后進行抗原修復(fù)，滴加稀釋后的相應(yīng)一抗(CD138抗體1∶500)，4℃過夜，滴加二抗室溫下孵育，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，鹽酸酒精分化，氨水返藍，中性樹膠封固，晾干后鏡下觀察CD138陽性漿細胞數(shù)量，計算小鼠乳腺組織中CD138陽性漿細胞比例。CD138陽性漿細胞比例=CD138陽性漿細胞數(shù)量/鏡下細胞總數(shù)×100%。

1.5 各組小鼠乳腺組織勻漿液中IL-6檢測 采用ELISA法。取各組小鼠，用0.3%的水合氯醛腹腔注射麻醉，取乳腺腫塊標(biāo)本，液氮速凍后，壓碎成直徑小于2 mm的碎片，稱重，按照重量∶體積=1∶7的比例用PBS重懸組織碎片，并于4 ℃渦旋震蕩2 h，5 000 r/min離心3 min，收集上清至新EP管即為組織勻漿液，按照RayBiotech公司Mouse IL-6 ELISA試劑盒說明書步驟檢測小鼠乳腺組織勻漿液中IL-6。

1.6 各組小鼠乳腺組織中p-JAK2Y1007/1008、p-STAT3Y705染色陽性細胞比例測算 取各組小鼠，用0.3%的水合氯醛腹腔注射麻醉，取乳腺腫塊標(biāo)本，切取部分組織用10%甲醛固定48 h，將石蠟切片脫蠟水化，3%的H2O2室溫孵育20 min，將切片浸入1 mmol/L的Tris/EDTA抗原修復(fù)液(pH 9.0)煮沸后進行抗原修復(fù)，滴加稀釋后的相應(yīng)一抗(p-JAK2Y1007/1008抗體1∶200，p-STAT3Y705抗體1∶200)，4 ℃過夜，滴加二抗室溫下孵育，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，鹽酸酒精分化，氨水返藍，中性樹膠封固，晾干后鏡下觀察p-JAK2Y1007/1008、p-STAT3Y705染色陽性細胞數(shù)量，計算小鼠乳腺組織中p-JAK2Y1007/1008、p-STAT3Y705染色陽性細胞比例。p-JAK2Y1007/1008陽性漿細胞比例=p-JAK2Y1007/1008陽性漿細胞數(shù)量/鏡下細胞總數(shù)×100%。p-STAT3Y705陽性漿細胞比例=p-STAT3Y705陽性漿細胞數(shù)量/鏡下細胞總數(shù)×100%。

1.7 各組小鼠乳腺組織中Bcl-2組化評分測算 取各組小鼠，用0.3%的水合氯醛腹腔注射麻醉，取乳腺腫塊標(biāo)本，切取部分組織用10%甲醛固定48 h，將石蠟切片脫蠟水化，3%的H2O2室溫孵育20 min，將切片浸入10 mmol/L檸檬酸緩沖液(pH 6.0)，煮沸后進行抗原修復(fù)，滴加稀釋后的相應(yīng)一抗(Bcl-2抗體1∶100)，4℃過夜，滴加二抗室溫下孵育，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，鹽酸酒精分化，氨水返藍，中性樹膠封固，晾干后鏡下觀察并進行組化評分：每張切片在40×10倍光鏡下隨機選取炎癥區(qū)內(nèi)5個不重疊的視野，依據(jù)陽性細胞百分比(無陽性細胞記0分、陽性細胞比≤25%為1分、26%～50%為2分、51%～75%為3分、>75%為4分)與染色強度(無表達為0分、淡黃為1分、棕黃為2分、棕褐為3分)分別計分，兩項得分相乘為該視野的評分，最后求5個視野的平均值即為最終評分[3]。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠乳腺組織病理變化 治療結(jié)束后，各組小鼠乳腺組織都可見腺泡結(jié)構(gòu)紊亂，腺泡周圍有大量的炎癥細胞，尤以漿細胞、淋巴細胞為主，還包括中性粒細胞，其中消乳散結(jié)高劑量組較生理鹽水組炎性細胞包括漿細胞、淋巴細胞數(shù)量更少(圖1)。

圖1 各組小鼠乳腺組織HE染色(400×)

2.2 各組小鼠乳腺組織中CD138陽性漿細胞比例比較 消乳散結(jié)高劑量組小鼠乳腺組織中CD138陽性漿細胞比例為11.30%±2.79%，消乳散結(jié)中劑量組為18.4%±3.37%，生理鹽水組為21.80%±4.71%，其中消乳散結(jié)高劑量組小鼠乳腺組織中CD138陽性漿細胞比例與生理鹽水組相比，P<0.05。

2.3 各組小鼠乳腺組織勻漿液中IL-6表達水平比較 消乳散結(jié)高劑量組小鼠乳腺組織勻漿液中IL-6表達水平為(385.99±24.06)pg/mL，消乳散結(jié)中劑量組為(404.17±21.72)pg/mL，生理鹽水組為(425.86±33.92)pg/mL，其中消乳散結(jié)高劑量組小鼠乳腺組織勻漿液中IL-6表達水平與生理鹽水組相比，P<0.05。

2.4 各組小鼠乳腺組織中p-JAK2Y1007/1008、p-STAT3Y705染色陽性細胞比例比較 消乳散結(jié)高劑量組小鼠乳腺組織中p-JAK2Y1007/1008、p-STAT3Y705染色陽性細胞比例分別為6.80%±2.53%、8.4%±2.72%，消乳散結(jié)中劑量組為13.2%±6.58%、14.2%±4.39%，生理鹽水組為16.30%±4.72%、17%±2.94%，其中消乳散結(jié)高劑量組小鼠乳腺組織中p-JAK2Y1007/1008、p-STAT3Y705染色陽性細胞比例與生理鹽水組相比，P均<0.05。

2.5 各組小鼠乳腺組織中Bcl-2組化評分比較 消乳散結(jié)高劑量組小鼠乳腺組織中Bcl-2組化評分為(2.7±1.49)分，消乳散結(jié)中劑量組為(3.5±1.51)分，生理鹽水組為(4.8±1.87)分，其中消乳散結(jié)高劑量組小鼠乳腺組織中Bcl-2組化評分與生理鹽水組相比，P<0.05。

3 討論

漿細胞性乳腺炎是一種好發(fā)于中青年女性的慢性非細菌性乳腺炎癥，其發(fā)病率近年呈上升趨勢[6]。漿細胞性乳腺炎臨床上主要依靠手術(shù)治療[7]，但是術(shù)后容易復(fù)發(fā)，也容易形成乳管瘺，經(jīng)久不愈，需要反復(fù)多次的手術(shù)，形成很多的傷疤，甚至有些患者最后不得不切除整個乳房，對患者的身體和精神帶來極大的傷害。盡管部分患者抗結(jié)核治療有一定效果，但是抗結(jié)核藥不良反應(yīng)明顯[8]。目前臨床缺乏有效地治療此病的藥物。本研究首次探索臨床上常用的消乳散結(jié)膠囊對小鼠漿細胞性乳腺炎的治療作用，我們發(fā)現(xiàn)高劑量消乳散結(jié)膠囊組炎癥程度有明顯的改善、漿細胞數(shù)量都有明顯的減少。

漿細胞性乳腺炎最主要的特征是導(dǎo)管周圍有大量的漿細胞聚集[9]，本研究發(fā)現(xiàn)消乳散結(jié)膠囊高劑量組CD138陽性漿細胞明顯減少，提示消乳散結(jié)膠囊可能對漿細胞性乳腺炎小鼠有一定的治療作用。漿細胞是重要的免疫細胞，它由B淋巴細胞分化發(fā)育而來，漿細胞正常情況下壽命較短[10-11]。IL-6是一種多功能的細胞因子，在B淋巴細胞中，IL-6能通過IL-6/JAK2/STAT3通路激活STAT3[12]，STAT3激活后可以誘導(dǎo)XBP-1的表達，進而促使B淋巴細胞向漿細胞分化[13]。有研究[14]發(fā)現(xiàn)，XBP-1參與控制IL-6的生成，在漿細胞大量產(chǎn)生的過程中也產(chǎn)生大量的IL-6。IL-6也是維持漿細胞和淋巴細胞生存的最重要的細胞因子[14-15]。我們的前期實驗[3-4]已經(jīng)證明，IL-6/JAK2/STAT3通路在漿細胞性乳腺炎發(fā)病過程中扮演重要的作用。在本研究中，ELISA結(jié)果顯示消乳散結(jié)膠囊高劑量組小鼠乳腺組織勻漿液中IL-6明顯減少，免疫組化結(jié)果也顯示消乳散結(jié)膠囊高劑量組小鼠乳腺組織中p-JAK2Y1007/1008、p-STAT3Y705表達明顯減少，這些結(jié)果都表明高劑量消乳散結(jié)膠囊對漿細胞性乳腺炎小鼠模型中的IL-6/JAK2/STAT3通路有一定程度的抑制作用。

Bcl-2是IL-6/JAK2/STAT3通路的靶基因[15]。在前期實驗中我們發(fā)現(xiàn)，漿細胞性乳腺炎小鼠模型和漿細胞性乳腺炎患者乳腺組織中的漿細胞上都有大量的抗凋亡蛋白Bcl-2的表達，這種抗凋亡能力增強的漿細胞在很多疾病中扮演重要作用[16]。在本研究中我們發(fā)現(xiàn)，消乳散結(jié)高劑量組中Bcl-2的表達顯著的下降，這說明高劑量的消乳散結(jié)膠囊能通過抑制IL-6/JAK2/STAT3通路的活性，減少Bcl-2的表達，進一步減少組織中的漿細胞，最終抑制病情的進展。

綜上，高劑量的消乳散結(jié)膠囊(100 mg/kg)對小鼠漿細胞性乳腺炎有一定的治療作用，高劑量的消乳散結(jié)膠囊可能通過抑制IL-6/JAK2/STAT3通路的活性，減少組織中IL-6的產(chǎn)生，減少漿細胞的產(chǎn)生并抑制其抗凋亡的作用，減少組織中漿細胞的聚集，從而抑制漿細胞性乳腺炎的進展，最終達到治療的效果，這為消乳散結(jié)膠囊的臨床應(yīng)用于治療漿細胞性乳腺炎提供了一定的理論支持，不過還需要進一步的臨床試驗去驗證。