外泌體作為溫郁金活性成分姜黃素載體的研究進展

郭月琴，趙祺，2#，袁瑋，姜程曦，3*

（1.溫州大學生命科學研究院，浙江溫州325035；2.大理藥業(yè)股份有限公司，云南大理671000；

3.浙江省生物醫(yī)藥協(xié)同創(chuàng)新中心，浙江溫州325035）

外泌體作為細胞自身分泌的囊泡，是細胞間信息交換的重要載體。外泌體由于其獨特的結構，具有低免疫原性、先天穩(wěn)定性、靶向性、高傳遞效率和血腦屏障（BBB）能力、良好的生物相容性及無病毒載體等優(yōu)點，成為天然的內源性藥物載體，具有廣闊的應用前景[1]，目前已有臨床試驗驗證了外泌體治療疾病的安全性[2]。溫郁金的主要化學成分有揮發(fā)油、姜黃素類、生物堿、多糖等[3]，姜黃素作為中藥溫郁金的活性成分之一，因其廣泛而明確的藥理作用成為現(xiàn)代藥理研究的熱點，但由于姜黃素溶解度差、結構不穩(wěn)定、體內代謝過程快，生物利用度低，嚴重限制了其臨床推廣應用[4]。而利用外泌體這種新型載藥途徑，能更好地將其有效成分遞送至靶細胞。該文就外泌體作為姜黃素載體的最新研究進行綜述，旨在為姜黃素新藥的開發(fā)提供參考。

1 外泌體生物學特性

1.1 生成與組成

外泌體是細胞通過內吞—融合—外排等一系列生物學機制產(chǎn)生，并通過主動分泌作用排出細胞外的囊性小泡，其本質是脂質雙分子層[5]。幾乎所有細胞都能分泌外泌體，并且廣泛存在于人體的各種體液中。外泌體的細胞來源，以及其內部的蛋白質含量決定了其密度。一般來說，外泌體的分子直徑約為25～95 nm。外泌體形態(tài)呈杯型或雙凹碟型，但在人體體液中呈球狀[6]。由于外泌體的微泡結構為其內在的小分子提供了一個安全穩(wěn)定的環(huán)境，同時這些信號小分子利用循環(huán)系統(tǒng)在胞間信號交換發(fā)揮重要作用，這讓外泌體表現(xiàn)出一個成熟、穩(wěn)定的信號傳輸系統(tǒng)[7]。因此，外泌體是理想的細胞間信息傳遞媒介。

外泌體的組成可以通過形態(tài)學和生物化學闡述。形態(tài)學方面，通過電子顯微鏡觀察外泌體持續(xù)不斷地在核內體網(wǎng)狀結構中形成一種小囊泡，即核內體，隨著早期核內體成熟，逐漸變成具有管腔結構的晚期核內體，晚期核內體局部膜內陷芽生狀態(tài)后，隨機吞噬部分細胞質中的成分，形成多囊泡體，通過與漿膜融合，局部內陷以胞外分泌途徑釋放[8]。生物化學方面，現(xiàn)普遍認為外泌體由蛋白質、核酸、脂質分子等構成，其中常見的標記蛋白如：CD9、CD63、CD81、CD82 等；與MVB 形成相關的蛋白如Alix、TSG101 以及胞質熱休克蛋白Hsp70、Hsp90 等[9-10]。外泌體中的核酸[11]包括mRNA、microRNA（miRNA）、其他非編碼RNA 以及DNA 等。

1.2 功能及臨床研究

外泌體的生理學功能多種多樣，由其來源細胞決定。研究發(fā)現(xiàn)，外泌體攜帶有DNA、RNA、蛋白質和脂質等[12]，主要通過“穿梭RNA”[13]和轉運蛋白[14]發(fā)揮重要作用。外泌體含有豐富的生物信息物質，具有在細胞間傳遞生物信息的獨特功能[15]，而經(jīng)由不同細胞分泌的外泌體含有不同的生物學功能。最開始認為外泌體[16]是作為攜帶抗原的載體并將抗原呈遞給T 細胞進而發(fā)揮作用，后來發(fā)現(xiàn)其在細胞間信息交流方面[17]也至關重要。如免疫調節(jié)[18]、增殖分化[19]、細胞遷移[20]、組織損傷修復[21]等。其作用機制主要分為4 個方面[22]：①外泌體作為一種信號物質直接作用于受體細胞；②外泌體將特異性傳染顆?；蚬δ苄缘鞍踪|傳遞給受體細胞；③外泌體通過mRNA、microRNA 等物質進行遺傳信息的呈遞；④外泌體可直接在細胞間進行受體轉移；而此時外泌體進入受體細胞后，通過指導轉錄和翻譯，對蛋白進行修飾和定位，并通過一系列過程進而影響受體細胞的細胞表型及生物功能。

外泌體作為藥物的載體正在引起越來越多研究者的關注。目前外泌體的臨床研究主要針對miRNA和mRNA 等基因類[23]、多柔比星等抗腫瘤藥物[24]及增強免疫功能的特定蛋白質等[25]藥物。而近年來外泌體作為中藥的載體成為現(xiàn)代藥理研究的熱點。Zhang 等[26]利用乳腺癌耐藥細胞株與負載β-欖香烯的外泌體（50 μmol/L，30 h）共培養(yǎng)，分析發(fā)現(xiàn)負載β-欖香烯的外泌體上調了耐藥細胞中miR-34a 及其靶基因PTEN的表達，并下調耐藥miR-452 和多藥耐藥基因蛋白P-gp 的表達，負載β-欖香烯的外泌體能明顯逆轉乳腺癌的耐藥性。Zhang XY 等[27]研究證明，梓醇能通過外泌體途徑將有效成分運送至神經(jīng)細胞中起到神經(jīng)保護作用。Gao F 等[28]研究利用大鼠MSC 來源外泌體作為補陽還五湯有效成分的載體，在采用線栓法建立大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷模型中進行腹膜注射，發(fā)現(xiàn)能通過調節(jié)相應miRNAs 促進缺血區(qū)腦血管生成，改善缺血癥狀。因此，通過將外泌體和中藥有效成分結合，利用外泌體等更加有效的載藥方式實現(xiàn)對傳統(tǒng)藥物有效成分的精確遞送，對傳統(tǒng)藥物發(fā)揮更好的臨床療效具有深遠的意義。

2 外泌體作為姜黃素載體的作用

姜黃素（curcumin）是中藥溫郁金的活性成分之一，是由一個多酚類化合物，具有β-二酮的庚二烯與2 個鄰甲基化的酚相連組成的對稱分子結構。將外泌體與姜黃素結合，可以使姜黃素的抗腫瘤、抗炎、抗抑郁、神經(jīng)保護及其他藥理作用增強，為研發(fā)新藥提供依據(jù)。

2.1 抗腫瘤

姜黃素的抗腫瘤作用機制已經(jīng)證實是通過調節(jié)miRNA 表達（例如miR-1、miR7、mi-9、mi-34 a、miR181、miR21 和mi-19），抑制腫瘤細胞的增生、擴散，增強機體對細胞的敏感性，提高對腫瘤的殺滅作用[29]。姜黃素結合外泌體在腫瘤中的研究比較深入，可以促進姜黃素的抗腫瘤作用。體內研究中，Aqil F 等[30]研究發(fā)現(xiàn)，大鼠中口服外泌體姜黃素（EXOCUR）在各器官與游離劑之間表現(xiàn)出3～5 倍的高水平，與游離姜黃素相比，EXOCU 對多種癌細胞系（包括乳腺癌、肺癌和宮頸癌）具有增強的抗增殖活性，EXOCUR對宮頸癌異種移植物有明顯的抑制作用（61.0%，P＜0.01）。這些結果表明，外泌體可以發(fā)展為潛在的納米載體，用于傳遞姜黃素，可以顯著提高姜黃素的組織生物利用度問題。體外研究中，Osterman CJ 等[31]研究使用體外胰腺癌細胞株PANC-1 和MIC-PACA-2 的細胞培養(yǎng)模型，姜黃素被結合到從姜黃素處理的胰腺癌細胞中分離的外泌體中，此外，姜黃素通過外泌體遞送到受體胰腺癌細胞，促進胰腺癌細胞毒性，表明姜黃素的抗腫瘤作用通過外泌子載體在胰腺癌細胞中得到增強。Mirzaei H 等[32]用外泌體的靶向作用將不同劑量的姜黃素釋放到癌細胞中，發(fā)現(xiàn)這些外泌體可誘導受體細胞的抗癌特性，減少腫瘤的生長。因此，含有姜黃素的外泌體可以作為癌癥治療的有力工具。Wu H 等[33]用姜黃素預處理的人肺癌細胞產(chǎn)生的外泌體作用于人正常肺上皮細胞，發(fā)現(xiàn)隨著姜黃素的劑量增加，Turf21 的表達也增加，證明了姜黃素通過下調DNMT1，上調TCF21 發(fā)揮其抗癌作用。Zhang HG 等[34]研究表明，姜黃素預處理的腫瘤細胞中分離的腫瘤外泌體具有抑制IL-2 刺激的NK 細胞細胞毒性的作用。

外泌體作為姜黃素載體的體內研究和體外研究表明，外泌體可以作為姜黃素載體，姜黃素通過外泌體遞送到受體胰腺癌、肺癌和宮頸癌等腫瘤細胞，促進癌細胞毒性，減少腫瘤的生長。外泌體與姜黃素的結合比游離姜黃素的抗腫瘤作用提高了3～5 倍，提高了姜黃素的生物利用度，為開發(fā)新型抗腫瘤藥提供數(shù)據(jù)支撐。

2.2 抗炎

姜黃素的抗炎作用機制是通過抑制MAPK /NFκB 信號通路，減少炎性介質產(chǎn)生、下調COX-2 脂肪氧化酶活性[35]，進而減少炎癥細胞因子釋放等多種途徑發(fā)揮顯著的抗炎效應。體外研究中，Vashisht M等[36]通過建立水牛顆粒細胞炎癥模型，發(fā)現(xiàn)姜黃素（20 μμm）誘導水牛顆粒細胞釋放的外泌體，增加促炎性細胞因子基因（IL-1β、TNF-α、IL-6）的表達，抑制CYP19A1基因的表達和雌二醇的產(chǎn)生，減輕LPS 介導的炎癥，表明外泌體外泌體負載的姜黃素可以從基因層面抑制炎癥。Aqil F 等[30]研究發(fā)現(xiàn)，外泌體姜黃素在人肺和乳腺癌細胞中可以活化NF-κB，具有顯著的抗炎活性。Zhang HG 等[37]表明了外泌體具有目標特異性，姜黃素活性的提高是通過外泌體將姜黃素引導到炎性細胞與治療性的，證實了由外泌體遞送的姜黃素在血液中更穩(wěn)定和更高度集中。因此，使用外來體作為藥物載體的特異性為許多炎癥相關疾病的治療創(chuàng)造了機會。Huang NP 等[38]在短暫性大腦中動脈閉塞（MCAO） 小鼠模型中，工程化C（RGDYK）結合的外泌體（cRGD Exo）靶向缺血腦損傷區(qū)域。當姜黃素被加載到外泌體上時，發(fā)現(xiàn)在病變區(qū)域中炎癥反應和細胞凋亡具有強烈的抑制作用，結果表明基于外泌體的缺血性腦靶向遞送載體，為功能化外泌體的快速和大規(guī)模生產(chǎn)提供了策略。

在外泌體載體的結合下，體外研究表明姜黃素通過外泌體的靶向性，使姜黃素在血液中更穩(wěn)定和更高度集中，其抗炎活性更顯著。而關于外泌體作為姜黃素載體的體內研究有待完善，以提供外泌體負載的姜黃素抗炎作用的數(shù)據(jù)支撐。

2.3 抗抑郁

姜黃素的抗抑郁作用可能與甘油磷脂代謝、亞油酸代謝、戊糖和葡糖醛酸酯和醚脂代謝有關[39]，但今后仍需進一步探索。Canfrán-Duque A 等[40-41]用抗精神病藥物或安慰劑和DII 標記的低密度脂蛋白治療HepG2 肝癌細胞18 h，然后浸潤在姜黃素中。2 h后，分別收集細胞和培養(yǎng)基，并用于生化分析、電鏡和免疫細胞化學，通過超速離心法從培養(yǎng)基中分離出外泌體。研究發(fā)現(xiàn)，姜黃素可以刺激外泌體釋放，除去積累在溶酶體小室內的膽固醇，減輕膽固醇、鞘磷脂和鞘糖脂的積累，減少因藥物不良反應造成的細胞內脂質沉積，維持細胞內膽固醇平衡，有助于最小化抗精神病藥物治療的不良代謝影響，表明外泌體可能會有利于姜黃素的抗精神病作用。

關于外泌體作為姜黃素載體的抗抑郁作用研究尚屬空白，不過已經(jīng)證實姜黃素可以刺激外泌體釋放，減輕膽固醇、鞘磷脂和鞘糖脂的積累，有助于最小化抗精神病藥物治療的不良代謝影響，表明外泌體可能會有利于姜黃素的抗精神病作用，為以后外泌體作為姜黃素載體的抗抑郁作用研究提供佐證。

2.4 神經(jīng)保護

姜黃素已發(fā)現(xiàn)在許多神經(jīng)系統(tǒng)疾病中起保護作用，然而，其在創(chuàng)傷性腦損傷（TBI）中的作用和潛在的分子機制尚不完全清楚，可能通過激活Nrf2 通路，增加抗氧化酶活性，從而減輕腦損傷[42]。體外研究中，Chaturvedi P 等[43]將同型半胱氨酸治療的內皮細胞用作血腦屏障破壞的模型，利用外泌體負載的姜黃素檢查其減輕內皮細胞破壞的潛力。研究發(fā)現(xiàn)，負載姜黃素的外泌體通過減少氧化應激和減輕受損的連接蛋白介導的緊密連接，從而改善小鼠腦內皮細胞同型半胱氨酸的神經(jīng)毒性，調節(jié)內皮細胞的滲透性。Chaturvedi P 等[44]用胚胎干細胞外泌體負載的姜黃素可以減少炎癥，減輕星形膠質細胞和GFAPN-甲基-D-天門冬氨酸受體表達，有助于小鼠缺血再灌注損傷后的神經(jīng)血管修復。

在外泌體載體的結合下，體外研究表明姜黃素通過減少氧化應激和減輕受損的連接蛋白介導的緊密連接，從而降低同型半胱氨酸的神經(jīng)毒性。而關于外泌體作為姜黃素載體的體內研究有待完善，分子機制也尚不完全清楚，還需要深入進行姜黃素與外泌體結合的神經(jīng)保護作用相關研究，以提供外泌體負載的姜黃素抗炎作用的數(shù)據(jù)支撐。

2.5 其他作用

研究發(fā)現(xiàn)，利用外泌體作為姜黃素的藥物載體，姜黃素在體內的濃度、藥物穩(wěn)定性隨之增加，提高了藥物療效并且沒有明顯的不良反應[45]。Vashisht M 等[46]在體外研究中，利用腸道Caco-2 細胞模型模擬人體消化過程，研究了游離姜黃素和外泌體負載的姜黃素在PBS 緩沖液和體外消化過程中的穩(wěn)定性，發(fā)現(xiàn)牛奶外泌體負載的姜黃素相較于游離姜黃素在PBS中具有更高的穩(wěn)定性，持續(xù)苛刻的消化過程，并且可以跨越腸屏障。簡而言之，姜黃素包合到外泌體中提高了其穩(wěn)定性、溶解度和生物利用度。

3 展望

在中醫(yī)藥發(fā)展大勢下，通過天然產(chǎn)物開發(fā)新藥是中醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)走向世界的趨勢。姜黃素具有的抗腫瘤、抗抑郁、抗炎、神經(jīng)保護等作用非常具有臨床價值，但由于其生物利用度低，限制了其臨床應用。通過外泌體作為姜黃素的載體，可以提高抗腫瘤、抗抑郁、抗炎、神經(jīng)保護等藥理作用，并顯著提高姜黃素的抗腫瘤作用。因此，未來可以嘗試研發(fā)外泌體作為姜黃素載體的藥物作為新型抗腫瘤藥物。關于姜黃素與外泌體結合的抗抑郁研究尚屬空白，抗抑郁和神經(jīng)保護分子作用機制尚不清楚，這是今后仍需深入研究的著力點。