外泌體作為溫郁金活性成分姜黃素載體的研究進(jìn)展

郭月琴，趙祺，2#，袁瑋，姜程曦，3*

（1.溫州大學(xué)生命科學(xué)研究院，浙江溫州325035；2.大理藥業(yè)股份有限公司，云南大理671000；

3.浙江省生物醫(yī)藥協(xié)同創(chuàng)新中心，浙江溫州325035）

外泌體作為細(xì)胞自身分泌的囊泡，是細(xì)胞間信息交換的重要載體。外泌體由于其獨(dú)特的結(jié)構(gòu)，具有低免疫原性、先天穩(wěn)定性、靶向性、高傳遞效率和血腦屏障（BBB）能力、良好的生物相容性及無病毒載體等優(yōu)點(diǎn)，成為天然的內(nèi)源性藥物載體，具有廣闊的應(yīng)用前景[1]，目前已有臨床試驗(yàn)驗(yàn)證了外泌體治療疾病的安全性[2]。溫郁金的主要化學(xué)成分有揮發(fā)油、姜黃素類、生物堿、多糖等[3]，姜黃素作為中藥溫郁金的活性成分之一，因其廣泛而明確的藥理作用成為現(xiàn)代藥理研究的熱點(diǎn)，但由于姜黃素溶解度差、結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定、體內(nèi)代謝過程快，生物利用度低，嚴(yán)重限制了其臨床推廣應(yīng)用[4]。而利用外泌體這種新型載藥途徑，能更好地將其有效成分遞送至靶細(xì)胞。該文就外泌體作為姜黃素載體的最新研究進(jìn)行綜述，旨在為姜黃素新藥的開發(fā)提供參考。

1 外泌體生物學(xué)特性

1.1 生成與組成

外泌體是細(xì)胞通過內(nèi)吞—融合—外排等一系列生物學(xué)機(jī)制產(chǎn)生，并通過主動(dòng)分泌作用排出細(xì)胞外的囊性小泡，其本質(zhì)是脂質(zhì)雙分子層[5]。幾乎所有細(xì)胞都能分泌外泌體，并且廣泛存在于人體的各種體液中。外泌體的細(xì)胞來源，以及其內(nèi)部的蛋白質(zhì)含量決定了其密度。一般來說，外泌體的分子直徑約為25～95 nm。外泌體形態(tài)呈杯型或雙凹碟型，但在人體體液中呈球狀[6]。由于外泌體的微泡結(jié)構(gòu)為其內(nèi)在的小分子提供了一個(gè)安全穩(wěn)定的環(huán)境，同時(shí)這些信號(hào)小分子利用循環(huán)系統(tǒng)在胞間信號(hào)交換發(fā)揮重要作用，這讓外泌體表現(xiàn)出一個(gè)成熟、穩(wěn)定的信號(hào)傳輸系統(tǒng)[7]。因此，外泌體是理想的細(xì)胞間信息傳遞媒介。

外泌體的組成可以通過形態(tài)學(xué)和生物化學(xué)闡述。形態(tài)學(xué)方面，通過電子顯微鏡觀察外泌體持續(xù)不斷地在核內(nèi)體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)中形成一種小囊泡，即核內(nèi)體，隨著早期核內(nèi)體成熟，逐漸變成具有管腔結(jié)構(gòu)的晚期核內(nèi)體，晚期核內(nèi)體局部膜內(nèi)陷芽生狀態(tài)后，隨機(jī)吞噬部分細(xì)胞質(zhì)中的成分，形成多囊泡體，通過與漿膜融合，局部?jī)?nèi)陷以胞外分泌途徑釋放[8]。生物化學(xué)方面，現(xiàn)普遍認(rèn)為外泌體由蛋白質(zhì)、核酸、脂質(zhì)分子等構(gòu)成，其中常見的標(biāo)記蛋白如：CD9、CD63、CD81、CD82 等；與MVB 形成相關(guān)的蛋白如Alix、TSG101 以及胞質(zhì)熱休克蛋白Hsp70、Hsp90 等[9-10]。外泌體中的核酸[11]包括mRNA、microRNA（miRNA）、其他非編碼RNA 以及DNA 等。

1.2 功能及臨床研究

外泌體的生理學(xué)功能多種多樣，由其來源細(xì)胞決定。研究發(fā)現(xiàn)，外泌體攜帶有DNA、RNA、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)等[12]，主要通過“穿梭RNA”[13]和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白[14]發(fā)揮重要作用。外泌體含有豐富的生物信息物質(zhì)，具有在細(xì)胞間傳遞生物信息的獨(dú)特功能[15]，而經(jīng)由不同細(xì)胞分泌的外泌體含有不同的生物學(xué)功能。最開始認(rèn)為外泌體[16]是作為攜帶抗原的載體并將抗原呈遞給T 細(xì)胞進(jìn)而發(fā)揮作用，后來發(fā)現(xiàn)其在細(xì)胞間信息交流方面[17]也至關(guān)重要。如免疫調(diào)節(jié)[18]、增殖分化[19]、細(xì)胞遷移[20]、組織損傷修復(fù)[21]等。其作用機(jī)制主要分為4 個(gè)方面[22]：①外泌體作為一種信號(hào)物質(zhì)直接作用于受體細(xì)胞；②外泌體將特異性傳染顆?；蚬δ苄缘鞍踪|(zhì)傳遞給受體細(xì)胞；③外泌體通過mRNA、microRNA 等物質(zhì)進(jìn)行遺傳信息的呈遞；④外泌體可直接在細(xì)胞間進(jìn)行受體轉(zhuǎn)移；而此時(shí)外泌體進(jìn)入受體細(xì)胞后，通過指導(dǎo)轉(zhuǎn)錄和翻譯，對(duì)蛋白進(jìn)行修飾和定位，并通過一系列過程進(jìn)而影響受體細(xì)胞的細(xì)胞表型及生物功能。

外泌體作為藥物的載體正在引起越來越多研究者的關(guān)注。目前外泌體的臨床研究主要針對(duì)miRNA和mRNA 等基因類[23]、多柔比星等抗腫瘤藥物[24]及增強(qiáng)免疫功能的特定蛋白質(zhì)等[25]藥物。而近年來外泌體作為中藥的載體成為現(xiàn)代藥理研究的熱點(diǎn)。Zhang 等[26]利用乳腺癌耐藥細(xì)胞株與負(fù)載β-欖香烯的外泌體（50 μmol/L，30 h）共培養(yǎng)，分析發(fā)現(xiàn)負(fù)載β-欖香烯的外泌體上調(diào)了耐藥細(xì)胞中miR-34a 及其靶基因PTEN的表達(dá)，并下調(diào)耐藥miR-452 和多藥耐藥基因蛋白P-gp 的表達(dá)，負(fù)載β-欖香烯的外泌體能明顯逆轉(zhuǎn)乳腺癌的耐藥性。Zhang XY 等[27]研究證明，梓醇能通過外泌體途徑將有效成分運(yùn)送至神經(jīng)細(xì)胞中起到神經(jīng)保護(hù)作用。Gao F 等[28]研究利用大鼠MSC 來源外泌體作為補(bǔ)陽(yáng)還五湯有效成分的載體，在采用線栓法建立大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷模型中進(jìn)行腹膜注射，發(fā)現(xiàn)能通過調(diào)節(jié)相應(yīng)miRNAs 促進(jìn)缺血區(qū)腦血管生成，改善缺血癥狀。因此，通過將外泌體和中藥有效成分結(jié)合，利用外泌體等更加有效的載藥方式實(shí)現(xiàn)對(duì)傳統(tǒng)藥物有效成分的精確遞送，對(duì)傳統(tǒng)藥物發(fā)揮更好的臨床療效具有深遠(yuǎn)的意義。

2 外泌體作為姜黃素載體的作用

姜黃素（curcumin）是中藥溫郁金的活性成分之一，是由一個(gè)多酚類化合物，具有β-二酮的庚二烯與2 個(gè)鄰甲基化的酚相連組成的對(duì)稱分子結(jié)構(gòu)。將外泌體與姜黃素結(jié)合，可以使姜黃素的抗腫瘤、抗炎、抗抑郁、神經(jīng)保護(hù)及其他藥理作用增強(qiáng)，為研發(fā)新藥提供依據(jù)。

2.1 抗腫瘤

姜黃素的抗腫瘤作用機(jī)制已經(jīng)證實(shí)是通過調(diào)節(jié)miRNA 表達(dá)（例如miR-1、miR7、mi-9、mi-34 a、miR181、miR21 和mi-19），抑制腫瘤細(xì)胞的增生、擴(kuò)散，增強(qiáng)機(jī)體對(duì)細(xì)胞的敏感性，提高對(duì)腫瘤的殺滅作用[29]。姜黃素結(jié)合外泌體在腫瘤中的研究比較深入，可以促進(jìn)姜黃素的抗腫瘤作用。體內(nèi)研究中，Aqil F 等[30]研究發(fā)現(xiàn)，大鼠中口服外泌體姜黃素（EXOCUR）在各器官與游離劑之間表現(xiàn)出3～5 倍的高水平，與游離姜黃素相比，EXOCU 對(duì)多種癌細(xì)胞系（包括乳腺癌、肺癌和宮頸癌）具有增強(qiáng)的抗增殖活性，EXOCUR對(duì)宮頸癌異種移植物有明顯的抑制作用（61.0%，P＜0.01）。這些結(jié)果表明，外泌體可以發(fā)展為潛在的納米載體，用于傳遞姜黃素，可以顯著提高姜黃素的組織生物利用度問題。體外研究中，Osterman CJ 等[31]研究使用體外胰腺癌細(xì)胞株P(guān)ANC-1 和MIC-PACA-2 的細(xì)胞培養(yǎng)模型，姜黃素被結(jié)合到從姜黃素處理的胰腺癌細(xì)胞中分離的外泌體中，此外，姜黃素通過外泌體遞送到受體胰腺癌細(xì)胞，促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞毒性，表明姜黃素的抗腫瘤作用通過外泌子載體在胰腺癌細(xì)胞中得到增強(qiáng)。Mirzaei H 等[32]用外泌體的靶向作用將不同劑量的姜黃素釋放到癌細(xì)胞中，發(fā)現(xiàn)這些外泌體可誘導(dǎo)受體細(xì)胞的抗癌特性，減少腫瘤的生長(zhǎng)。因此，含有姜黃素的外泌體可以作為癌癥治療的有力工具。Wu H 等[33]用姜黃素預(yù)處理的人肺癌細(xì)胞產(chǎn)生的外泌體作用于人正常肺上皮細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)隨著姜黃素的劑量增加，Turf21 的表達(dá)也增加，證明了姜黃素通過下調(diào)DNMT1，上調(diào)TCF21 發(fā)揮其抗癌作用。Zhang HG 等[34]研究表明，姜黃素預(yù)處理的腫瘤細(xì)胞中分離的腫瘤外泌體具有抑制IL-2 刺激的NK 細(xì)胞細(xì)胞毒性的作用。

外泌體作為姜黃素載體的體內(nèi)研究和體外研究表明，外泌體可以作為姜黃素載體，姜黃素通過外泌體遞送到受體胰腺癌、肺癌和宮頸癌等腫瘤細(xì)胞，促進(jìn)癌細(xì)胞毒性，減少腫瘤的生長(zhǎng)。外泌體與姜黃素的結(jié)合比游離姜黃素的抗腫瘤作用提高了3～5 倍，提高了姜黃素的生物利用度，為開發(fā)新型抗腫瘤藥提供數(shù)據(jù)支撐。

2.2 抗炎

姜黃素的抗炎作用機(jī)制是通過抑制MAPK /NFκB 信號(hào)通路，減少炎性介質(zhì)產(chǎn)生、下調(diào)COX-2 脂肪氧化酶活性[35]，進(jìn)而減少炎癥細(xì)胞因子釋放等多種途徑發(fā)揮顯著的抗炎效應(yīng)。體外研究中，Vashisht M等[36]通過建立水牛顆粒細(xì)胞炎癥模型，發(fā)現(xiàn)姜黃素（20 μμm）誘導(dǎo)水牛顆粒細(xì)胞釋放的外泌體，增加促炎性細(xì)胞因子基因（IL-1β、TNF-α、IL-6）的表達(dá)，抑制CYP19A1基因的表達(dá)和雌二醇的產(chǎn)生，減輕LPS 介導(dǎo)的炎癥，表明外泌體外泌體負(fù)載的姜黃素可以從基因?qū)用嬉种蒲装Y。Aqil F 等[30]研究發(fā)現(xiàn)，外泌體姜黃素在人肺和乳腺癌細(xì)胞中可以活化NF-κB，具有顯著的抗炎活性。Zhang HG 等[37]表明了外泌體具有目標(biāo)特異性，姜黃素活性的提高是通過外泌體將姜黃素引導(dǎo)到炎性細(xì)胞與治療性的，證實(shí)了由外泌體遞送的姜黃素在血液中更穩(wěn)定和更高度集中。因此，使用外來體作為藥物載體的特異性為許多炎癥相關(guān)疾病的治療創(chuàng)造了機(jī)會(huì)。Huang NP 等[38]在短暫性大腦中動(dòng)脈閉塞（MCAO） 小鼠模型中，工程化C（RGDYK）結(jié)合的外泌體（cRGD Exo）靶向缺血腦損傷區(qū)域。當(dāng)姜黃素被加載到外泌體上時(shí)，發(fā)現(xiàn)在病變區(qū)域中炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡具有強(qiáng)烈的抑制作用，結(jié)果表明基于外泌體的缺血性腦靶向遞送載體，為功能化外泌體的快速和大規(guī)模生產(chǎn)提供了策略。

在外泌體載體的結(jié)合下，體外研究表明姜黃素通過外泌體的靶向性，使姜黃素在血液中更穩(wěn)定和更高度集中，其抗炎活性更顯著。而關(guān)于外泌體作為姜黃素載體的體內(nèi)研究有待完善，以提供外泌體負(fù)載的姜黃素抗炎作用的數(shù)據(jù)支撐。

2.3 抗抑郁

姜黃素的抗抑郁作用可能與甘油磷脂代謝、亞油酸代謝、戊糖和葡糖醛酸酯和醚脂代謝有關(guān)[39]，但今后仍需進(jìn)一步探索。Canfrán-Duque A 等[40-41]用抗精神病藥物或安慰劑和DII 標(biāo)記的低密度脂蛋白治療HepG2 肝癌細(xì)胞18 h，然后浸潤(rùn)在姜黃素中。2 h后，分別收集細(xì)胞和培養(yǎng)基，并用于生化分析、電鏡和免疫細(xì)胞化學(xué)，通過超速離心法從培養(yǎng)基中分離出外泌體。研究發(fā)現(xiàn)，姜黃素可以刺激外泌體釋放，除去積累在溶酶體小室內(nèi)的膽固醇，減輕膽固醇、鞘磷脂和鞘糖脂的積累，減少因藥物不良反應(yīng)造成的細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)沉積，維持細(xì)胞內(nèi)膽固醇平衡，有助于最小化抗精神病藥物治療的不良代謝影響，表明外泌體可能會(huì)有利于姜黃素的抗精神病作用。

關(guān)于外泌體作為姜黃素載體的抗抑郁作用研究尚屬空白，不過已經(jīng)證實(shí)姜黃素可以刺激外泌體釋放，減輕膽固醇、鞘磷脂和鞘糖脂的積累，有助于最小化抗精神病藥物治療的不良代謝影響，表明外泌體可能會(huì)有利于姜黃素的抗精神病作用，為以后外泌體作為姜黃素載體的抗抑郁作用研究提供佐證。

2.4 神經(jīng)保護(hù)

姜黃素已發(fā)現(xiàn)在許多神經(jīng)系統(tǒng)疾病中起保護(hù)作用，然而，其在創(chuàng)傷性腦損傷（TBI）中的作用和潛在的分子機(jī)制尚不完全清楚，可能通過激活Nrf2 通路，增加抗氧化酶活性，從而減輕腦損傷[42]。體外研究中，Chaturvedi P 等[43]將同型半胱氨酸治療的內(nèi)皮細(xì)胞用作血腦屏障破壞的模型，利用外泌體負(fù)載的姜黃素檢查其減輕內(nèi)皮細(xì)胞破壞的潛力。研究發(fā)現(xiàn)，負(fù)載姜黃素的外泌體通過減少氧化應(yīng)激和減輕受損的連接蛋白介導(dǎo)的緊密連接，從而改善小鼠腦內(nèi)皮細(xì)胞同型半胱氨酸的神經(jīng)毒性，調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞的滲透性。Chaturvedi P 等[44]用胚胎干細(xì)胞外泌體負(fù)載的姜黃素可以減少炎癥，減輕星形膠質(zhì)細(xì)胞和GFAPN-甲基-D-天門冬氨酸受體表達(dá)，有助于小鼠缺血再灌注損傷后的神經(jīng)血管修復(fù)。

在外泌體載體的結(jié)合下，體外研究表明姜黃素通過減少氧化應(yīng)激和減輕受損的連接蛋白介導(dǎo)的緊密連接，從而降低同型半胱氨酸的神經(jīng)毒性。而關(guān)于外泌體作為姜黃素載體的體內(nèi)研究有待完善，分子機(jī)制也尚不完全清楚，還需要深入進(jìn)行姜黃素與外泌體結(jié)合的神經(jīng)保護(hù)作用相關(guān)研究，以提供外泌體負(fù)載的姜黃素抗炎作用的數(shù)據(jù)支撐。

2.5 其他作用

研究發(fā)現(xiàn)，利用外泌體作為姜黃素的藥物載體，姜黃素在體內(nèi)的濃度、藥物穩(wěn)定性隨之增加，提高了藥物療效并且沒有明顯的不良反應(yīng)[45]。Vashisht M 等[46]在體外研究中，利用腸道Caco-2 細(xì)胞模型模擬人體消化過程，研究了游離姜黃素和外泌體負(fù)載的姜黃素在PBS 緩沖液和體外消化過程中的穩(wěn)定性，發(fā)現(xiàn)牛奶外泌體負(fù)載的姜黃素相較于游離姜黃素在PBS中具有更高的穩(wěn)定性，持續(xù)苛刻的消化過程，并且可以跨越腸屏障。簡(jiǎn)而言之，姜黃素包合到外泌體中提高了其穩(wěn)定性、溶解度和生物利用度。

3 展望

在中醫(yī)藥發(fā)展大勢(shì)下，通過天然產(chǎn)物開發(fā)新藥是中醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)走向世界的趨勢(shì)。姜黃素具有的抗腫瘤、抗抑郁、抗炎、神經(jīng)保護(hù)等作用非常具有臨床價(jià)值，但由于其生物利用度低，限制了其臨床應(yīng)用。通過外泌體作為姜黃素的載體，可以提高抗腫瘤、抗抑郁、抗炎、神經(jīng)保護(hù)等藥理作用，并顯著提高姜黃素的抗腫瘤作用。因此，未來可以嘗試研發(fā)外泌體作為姜黃素載體的藥物作為新型抗腫瘤藥物。關(guān)于姜黃素與外泌體結(jié)合的抗抑郁研究尚屬空白，抗抑郁和神經(jīng)保護(hù)分子作用機(jī)制尚不清楚，這是今后仍需深入研究的著力點(diǎn)。