食源血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制肽研究進展

王琳琳，陳立，李建科

（陜西師范大學(xué)食品工程與營養(yǎng)科學(xué)學(xué)院，陜西西安 710119）

高血壓是常見的心血管疾病，嚴重危害人類健康。發(fā)病人群年齡分布廣泛，據(jù)世界衛(wèi)生組織報道，全球1/3的成年人患有高血壓[1]。我國第五次高血壓調(diào)查顯示：中國成人高血壓患病率為23.2%，患病人數(shù)達2.45 億[2]?；疾÷孰S年齡增加而升高，男性高于女性[3]。腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)（renin-angiotensin system，RAS）在高血壓疾病的形成及發(fā)展中扮演著關(guān)鍵性的角色[4-5]。RAS 是升壓系統(tǒng)，腎素使血管緊張素原釋放出血管緊張素Ι（Ang Ι），在ACE 作用下轉(zhuǎn)化為血管緊張素II（Ang II），使血管強烈收縮，血管壓力增大，與腎小球細胞上的AT1 受體相互作用而驅(qū)動醛固酮的合成和分泌，刺激去甲腎上腺素釋放和Na+重吸收，使血壓升高。緩激肽在激肽原酶的作用下產(chǎn)生舒緩激肽（BK），進而釋放血管舒張因子，對抗Ang II，使血壓下降[6]。ACE 能夠降解BK 使其失活，從而使機體血壓升高。RAS 和激肽釋放酶-激肽系統(tǒng)（kallikrein-kinin system，KKS）在血壓調(diào)節(jié)中相互拮抗，只有平衡協(xié)調(diào)才能維持正常血壓。高血壓為常見病，患者人數(shù)眾多且需終身服藥。

ACE 抑制肽又稱為降壓肽，是一類能夠抑制血管緊張素轉(zhuǎn)化酶活性的多肽。目前化學(xué)合成的ACE 抑制劑類藥物臨床效果并不理想，且有一定的副作用。食源性蛋白獲得的ACE 抑制肽可以降低血壓，而且更加安全，近年來已有較多研究人員在食品原料中提取出ACE 抑制肽，通過體外體內(nèi)試驗證明其具有抑制活性，進一步研究能夠推進臨床應(yīng)用，造福高血壓患者。目前只有少數(shù)發(fā)酵來源的ACE 抑制肽商業(yè)化使用。ACE 抑制肽沒有固定結(jié)構(gòu)，通過不同來源ACE 抑制肽的制備可以進一步探究肽的結(jié)構(gòu)與活性之間的關(guān)系，促進降壓肽的開發(fā)并取代化學(xué)合成抑制劑。鑒于此，本研究分析了ACE 抑制肽的降壓機制和構(gòu)效關(guān)系，總結(jié)了ACE 抑制肽的制備方法及來源，探討了其未來的研究方向，旨在助力食源ACE抑制肽的研究與開發(fā)，助力高血壓等重大心血管疾病的預(yù)防和特殊人群的健康改善。

1 ACE 抑制肽降壓機理

ACE 在人體血壓調(diào)節(jié)系統(tǒng)中發(fā)揮著重要的作用，ACE 抑制肽可以通過抑制ACE 活性，使Ang II 濃度降低，從而起到降血壓的作用。ACE 抑制肽是對ACE 活性區(qū)域親和力較強的競爭性抑制劑，對ACE 的親和力比Ang Ι 和舒緩激肽要強，而且不易從ACE 結(jié)合區(qū)釋放，從而阻礙Ang II 的生成和緩激肽的水解，起到降血壓的作用。當前最有效的降血壓藥物是琉甲丙脯氣酸（商品名卡托普利），它是一種非肽類血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑（ACEI），主要作用于RAS，雖然臨床降壓效果好，但是藥效時間不長，停藥后血壓易反彈，并伴有咳嗽、味覺功能紊亂、皮疫及腎功能損害等副作用[7]。食源性ACE 抑制肽具有天然、安全、無副作用的優(yōu)點，因此在醫(yī)藥、食品等領(lǐng)域備受青睞。

2 ACE抑制肽的構(gòu)效關(guān)系

ACE 是一種二肽基羧基肽酶，根據(jù)分子量大小可分為體細胞ACE（sACE）和睪丸ACE（tACE）。sACE 由兩個同源結(jié)構(gòu)域組成，每個同源結(jié)構(gòu)域均含有Zn2+結(jié)合模體HEXXH（H 代表組氨酸、E 代表谷氨酸，X 代表任意氨基酸殘基）催化活性位點，只有C 端結(jié)構(gòu)域在調(diào)節(jié)血壓方面起作用，tACE 結(jié)構(gòu)與sACE 相似[8]。不同抑制肽的結(jié)構(gòu)會導(dǎo)致不同的ACE 抑制類型，可分為競爭性抑制和非競爭性抑制。競爭性抑制機理為ACE 抑制肽C 端氨基酸能與Ang 和緩激肽進行競爭，同底物爭奪ACE 結(jié)合位點，從而起到降壓作用。大多數(shù)ACE 抑制肽屬于競爭性抑制，ACE 抑制肽的C 端氨基酸是與ACE 活性部位結(jié)合的關(guān)鍵，當抑制肽的C 端氨基酸為疏水性氨基酸時，其ACE 抑制活性較高[9]。非競爭性抑制劑可直接與ACE 作用位點相結(jié)合，形成酶-抑制劑復(fù)合物，從而導(dǎo)致ACE 結(jié)構(gòu)改變，抑制其活性。ACE 抑制肽的活性與其自身結(jié)構(gòu)有關(guān)，C 端3 個氨基酸的序列為Phe-Glu-Pro 時，ACE 抑制活性最強。ACE 抑制劑的抑制活性還與立體構(gòu)象及氨基酸的疏水性有關(guān)。但是這些結(jié)論沒有全面考慮肽的構(gòu)象、與其他物質(zhì)的相互作用等影響因素，許多ACE 抑制肽并不符合這些研究結(jié)果，因此，抑制肽ACE 與之間確切的構(gòu)效關(guān)系模型至今仍未建立。

3 ACE 抑制肽的制備方法

食源性抑制肽的制備過程條件溫和，制備原料來源廣泛，因此可通過酶解、發(fā)酵或重組基因工程菌株等技術(shù)從動植物中制備ACE 抑制肽。

3.1 酶解法

酶解法是制備ACE 抑制肽最常用的方法，主要是通過蛋白酶水解原料蛋白質(zhì)獲得具有ACE 抑制活性的片段。這種方法具有專一性強、效率高、反應(yīng)條件溫和、反應(yīng)進程易控制和產(chǎn)品安全性高等優(yōu)點。缺點是需要對蛋白質(zhì)原料進行篩選，鑒別具有降血壓活性的多肽結(jié)構(gòu)；而且會形成苦味肽，影響水解產(chǎn)物的應(yīng)用。制備ACE 抑制肽需要采用合適的酶，目前常用的蛋白酶主要有植物蛋白酶（如木瓜蛋白酶等）、動物蛋白酶（如胰蛋白酶、胃蛋白酶等）、商業(yè)酶（如堿性蛋白酶、中性蛋白酶等）。酶解法主要包括單一酶解法和復(fù)合酶解法，制備ACE 抑制肽采用復(fù)合酶解法居多。Zhang 等[10]采用堿性蛋白酶和銅綠假單胞菌蛋白酶酶解小麥面筋，通過純化鑒定出兩個在羧基端含色氨酸的降壓肽：SAGGYIW 和APATPSFW，IC50值分別為0.002、0.036 mg/mL。Lee 等[11]分別采用堿性蛋白酶和木瓜蛋白酶水解牛肉肌原纖維蛋白，發(fā)現(xiàn)通過堿性蛋白酶（AK3K）消化獲得的<3 kg/mol 肽顯示出最高的ACE 抑制活性（74.29%）。體內(nèi)試驗表明該抑制肽對大鼠自發(fā)性高血壓具有明顯的降壓效果，經(jīng)分析鑒定表明其具有Leu-Ile-Val-Gly-Ile-Ile-Arg-Cys-Val 序列。

3.2 發(fā)酵法

發(fā)酵法是利用微生物體內(nèi)酶解反應(yīng)釋放多肽片段，然后從發(fā)酵液中提取具有ACE 抑制活性的多肽。發(fā)酵法具有蛋白水解活性強、無需分離純化、成本低等優(yōu)點，但反應(yīng)進程不易控制。發(fā)酵法可通過改變發(fā)酵條件獲得高ACE 抑制活性的多肽，發(fā)酵菌種多采用乳酸菌。Sathya 等[12]采用嗜酸乳桿菌（MTCC 10307）、植物乳桿菌（NCDC 379）、干酪乳桿菌（NCDC 017）、保加利亞乳桿菌（NCDC 253）、副干酪乳桿菌亞種（NCDC 022）、鼠李糖乳桿菌（MTCC 8712）和瑞士乳桿菌（NCDC 192）七種不同的乳酸菌發(fā)酵山羊奶，結(jié)果在NCDC 379 發(fā)酵的牛奶中觀察到最高的ACE 抑制活性，分子量為1.4 kg/mol。李響等[13]選擇5 株乳酸菌、3 株霉菌和1 株枯草芽孢桿菌為出發(fā)菌種發(fā)酵大豆分離蛋白，結(jié)果發(fā)現(xiàn)乳酸菌中具有強ACE抑制活性的菌株為保加利亞乳桿菌，ACE 抑制率和肽含量分別為57.93%和3.27 mg/mL。

3.3 DNA 重組法

DNA 重組法是利用基因工程手段發(fā)酵制備ACE 抑制肽，將高ACE 抑制肽抑制活性的基因轉(zhuǎn)移至表達載體，使多肽基因以串聯(lián)多聚體形式表達獲得大量的ACE抑制肽。這種方法具有產(chǎn)量高、成本低等優(yōu)點，但目前還沒有實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)。臧祥玉[14]采用基因工程法結(jié)合高密度發(fā)酵技術(shù)制備多種ACE 抑制肽和抗氧化肽的復(fù)合肽產(chǎn)品，構(gòu)建基因工程菌多聚體BPP-1 使其正確表達。BPP-1 經(jīng)體外模擬消化后，其酶解寡肽顯示了極強的ACE 抑制活性（IC50=0.004 mg/mL），體內(nèi)檢測發(fā)現(xiàn)其具有較強的降血壓效應(yīng)。

4 ACE 抑制肽的來源

食物中富含蛋白質(zhì)，通過分解可獲得許多具有生理功能的生物活性肽。目前從乳源、植物源、動物源、海洋生物源、發(fā)酵來源等多種途徑制備出ACE 抑制肽，隨著研究的深入有望開發(fā)出功能性食品。

4.1 乳源ACE 抑制肽

乳制品富含蛋白質(zhì)，是ACE 抑制肽的重要來源之一。乳源ACE 抑制肽是當前研究最廣泛和最深入的活性肽。酪蛋白和乳清蛋白含有多種生物活性序列，通過酶解條件優(yōu)化可以制備多種ACE 抑制肽。在制備過程中酶解條件和肽的分子量是重要的影響因素。近年來許多學(xué)者陸續(xù)在乳源食品中獲得ACE 抑制肽。Guo 等[15]用藻酸鈉固定的瑞士乳桿菌LB 10 蛋白酶水解乳清蛋白，并對跨Caco-2 細胞單層轉(zhuǎn)運的能力進行了測試，得到ACE 抑制肽二肽和三肽KA、EN、DIS、EVD、LF、AIV 和VFK，其IC50值分別為1.24±0.01、1.43±0.04、1.59±0.27、1.32±0.05、1.60±0.39、2.66±0.02、1.76±0.09 mmol/L。Jiang 等[16]使用AS1.398中性蛋白酶水解牛奶酪蛋白，獲得新型的ACE 抑制肽RYPSYG 和DERF。Chen 等[17]采用復(fù)合酶水解羊乳酪蛋白，獲得高活性的ACE 抑制肽組分。馬瑩[18]采用胃蛋白酶和胰蛋白酶雙酶水解乳清蛋白制備ACE 抑制肽，經(jīng)過純化篩選發(fā)現(xiàn)只有LIVTQTMK 有ACE 抑制活性，其IC50值為248.1 μg/mL。目前乳源ACE 抑制肽的研究處在臨床研究和少量應(yīng)用階段。Crippa 等[19]通過隨機、雙盲安慰劑對照試驗研究了半脂奶酪Grana Padano 產(chǎn)生的ACE抑制肽對30 名輕中度高血壓患者的降壓作用，結(jié)果表明與Grana Padano 奶酪進行膳食整合的所有患者血壓均顯著降低，24 h（相對于安慰劑）收縮壓平均下降3.5 mmHg，舒張壓下降2.4 mmHg。目前已有許多包含乳源降壓肽的保健品投入應(yīng)用，例如Calpis[20]、Evolu[21]發(fā)酵乳（包含VPP和IPP）、Festivo 奶酪[22]（包含RPKHPI、RPKHPIK、RPKHPIKHQ）。

4.2 植物源ACE 抑制肽

植物來源的ACE 抑制肽無毒副作用，且表現(xiàn)出良好的降血壓效果。植物源食品是ACE 抑制肽的重要來源，但如何從種類繁多的植物中獲得高ACE 抑制活性并具有開發(fā)價值的降壓肽仍需繼續(xù)研究。周劍敏等[23]用Alcalase堿性蛋白酶水解高粱堿溶蛋白，獲得ACE 抑制肽活性達到75.98%，在體外經(jīng)胃腸道消化酶酶解后依然保持良好的抑制活性。王珂[24]采用超聲預(yù)處理輔助酶解玉米胚芽蛋白，發(fā)現(xiàn)梯度稀釋補料酶膜耦合模式獲得的多肽比等濃度補料酶膜耦合模式IC50值低11.70%，動物實驗結(jié)果表明該抑制肽降壓效果顯著。趙元暉等[25]對海地瓜蛋白水解物進行分離純化，得到強活性ACE 抑制肽MEGAQEAQGD，其IC50值為15.9 μmol/L，動物實驗結(jié)果表明該抑制肽對大鼠自發(fā)性高血壓具有明顯的降壓效果。Cao 等[26]利用胰蛋白酶對龍須菜進行酶解，對酶解產(chǎn)物進行分離純化后得到四肽QVEY，其IC50值為474.56 μmol/L。

4.3 發(fā)酵來源ACE 抑制肽

發(fā)酵制備ACE 抑制肽是一種綠色加工技術(shù)，發(fā)酵條件溫和，過程可控，中間產(chǎn)物少。發(fā)酵制備ACE 抑制肽需要分離篩選高效安全的生產(chǎn)菌株，并對培養(yǎng)條件進行優(yōu)化以提高ACE 抑制肽產(chǎn)率，然后進行分離純化獲得高ACE 抑制活性的多肽。日本學(xué)者在發(fā)酵乳制品制備ACE抑制肽方面的研究較為深入。1995 年Nakamura 等[27]以L.helveticus CP790 和Saccharomyces cerevisiae 混合發(fā)酵制得酸乳Calpis，長期喂予原發(fā)性高血壓大鼠（SHR）后發(fā)現(xiàn)其能夠抑制血壓上升，并首次從酸奶中分離純化得到兩條ACE 抑制肽；Yamamoto 等[28]研究發(fā)現(xiàn)用L.helveticus CP790 發(fā)酵的酸奶產(chǎn)品，經(jīng)過動物試驗發(fā)現(xiàn)其具有極強降血壓作用，并證實了這種抑制血壓上升的肽是由L.helveticus CP790 的胞外蛋白酶水解生成的。Chen 等[29]以植物乳桿菌L69 發(fā)酵羊乳酪蛋白，利用響應(yīng)面法優(yōu)化發(fā)酵條件，通過超濾純化得到的發(fā)酵產(chǎn)物對ACE 抑制活性達91.62%。體內(nèi)試驗發(fā)現(xiàn)發(fā)酵的山羊奶能夠在胃腸道中成功存活，并保持較高的抑制活性。Xia 等[30]從植物乳桿菌發(fā)酵產(chǎn)生的乳清蛋白中純化出IC50值為1.26 mg/mL 的ACE 抑制肽，經(jīng)過動物試驗發(fā)現(xiàn)其具有很強的降壓作用，通過液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析表明其具有Gly-Ala 的氨基酸序列。Chen 等[31]以納豆芽孢桿菌發(fā)酵菲律賓蛤仔獲得ACE 抑制肽，將發(fā)酵產(chǎn)物純化分離，得到具有高ACE 抑制活性的新型肽（IC50為8.16 μmol/L），并鑒定出其氨基酸序列為Val-Ile-Ser-Asp-Glu-Asp-Gly-Val-Thr-His（VISDEDGVTH），體外體內(nèi)實驗表明該肽具有顯著的降壓作用，可作為降壓功能性食品的有益成分。

4.4 動物源ACE 抑制肽

動物的組織器官富含蛋白質(zhì)，研究人員從中提取出具有ACE 抑制活性的多肽。動物源ACE 抑制肽和植物源ACE 抑制肽的制備方式類似，主要通過酶解方式獲得，但是有研究表明動植物蛋白經(jīng)體外消化后蛋白肽的ACE 活性抑制率不同[32]。從動物源食品中獲得的ACE 抑制肽仍需在體外和體內(nèi)進一步驗證。鄧惠玲等[33]以豬血為原料制備血紅蛋白，用胃蛋白酶進行酶解得到ACE 抑制肽GGLP。Mirdhayati 等[34]酶解卡康山羊肉，得到具有Phe-Gln-Pro-Ser 序列的新型肽（IC50值為27.0 μmol/L），發(fā)現(xiàn)該肽在體內(nèi)和體外均能有效抑制ACE。

海洋生物蛋白是食源性ACE 抑制肽的重要原料來源。海洋生物及其加工副產(chǎn)物中含有豐富的生物蛋白，可以制備ACE 抑制肽，進行高值化利用。ACE 抑制肽的制備多采用酶解法，單一酶類獲取的多肽多數(shù)活性不高，一般使用復(fù)合酶進行酶解，酶解產(chǎn)物需要進一步分離純化，以獲得高活性的海洋多肽。華鑫等[35]利用復(fù)合蛋白酶對刺參體壁進行酶解制備ACE 抑制肽，經(jīng)動物實驗表明它對雄性SHR 有良好的降壓效果。Ghassem 等[36]對鯉魚肌原纖維蛋白用蛋白酶K 和嗜熱菌蛋白酶進行水解，發(fā)現(xiàn)嗜熱菌蛋白酶的水解產(chǎn)物ACE 抑制活性最大，純化的水解產(chǎn)物中分離出兩個強抑制肽VPAAPPK 和NGTWFEPP。

5 展望

高血壓作為世界范圍內(nèi)最常見的重大慢性病之一，是心血管疾病的“無聲殺手”。食源性ACE 抑制肽可以有效預(yù)防緩解高血壓，并且制備原料廣泛，可以從食物加工邊角料和廢棄物中獲取，具有良好的再利用價值。目前的食源ACE 抑制肽研究多集中在制備和結(jié)構(gòu)分析上，鮮少涉及到降壓機制。代謝組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)和全基因組學(xué)技術(shù)的興起有助于我們更深入地研究食源ACE 抑制肽在體內(nèi)的降壓機制，為人類健康發(fā)展提供有效依據(jù)。同時，目前臨床應(yīng)用的ACE 抑制肽較少，需要進一步研究其臨床功效、在人體內(nèi)的生物利用度和組織親和力等。相信這些問題在不久的將來都會得到解決，并實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)。

隨著ACE 抑制肽在世界范圍內(nèi)的廣泛關(guān)注，動植物源ACE 抑制肽資源豐富但作用機制不清，研發(fā)富含ACE抑制肽的功能性食品將成為未來食品科學(xué)領(lǐng)域和食品加工行業(yè)的重點和難點。