超臨界流體色譜在藥物分析中的研究進(jìn)展

朱琳

(山西衛(wèi)生健康職業(yè)學(xué)院，山西 晉中 030619)

超臨界流體色譜(supercritical fluid chromatography,SFC)是以超臨界流體(如二氧化碳)為流動相，以吸附劑(如硅膠)吸附或鍵合到載體(如毛細(xì)管壁)上的高聚物為固定相的一種高效色譜技術(shù)[1]。SFC的分離機(jī)制與其他吸附、分配色譜相同，即基于化合物在流動相和固定相上的吸附或分配系數(shù)不同而使混合物分離[2]。

超臨界流體是一類具有液相類似的密度和溶解性能，同時(shí)擁有氣相類似的低黏度和高擴(kuò)散等性質(zhì)的物質(zhì)。在實(shí)際應(yīng)用中，超臨界流體可以避免氣相色譜(gas chromatography,GC)的高溫，用于分析熱不穩(wěn)定和高沸點(diǎn)化合物，也可像高效液相色譜(high performance liquid chromatography,HPLC)一樣分析非揮發(fā)性和高分子化合物，且具有比HPLC更快的分析速度和條件，又不需要使用大量的有機(jī)溶劑[3-4]。常用做超臨界流體的有二氧化碳(CO2)、氨、乙烷、乙烯和氯仿等。CO2的臨界溫度和壓力分別為31 ℃和74 MPa，臨界條件容易達(dá)到，同時(shí)CO2的化學(xué)惰性、無毒無害和容易制備，使其成為SFC中最常用的流動相。但是由于CO2極性較小，所以在分析大極性化合物時(shí)，需要在流動相添加甲醇等改性劑。此外，從2012年開始，新型的商品化超臨界流體色譜系統(tǒng)——超高效合相色譜(ultra performance convergence chromatography，UPC2)在世界范圍得到廣泛應(yīng)用與快速發(fā)展，UPC2是新一代融合了超高效液相色譜(ultra high performance liquid chromatography,UPLC)技術(shù)的超臨界流體色譜，在保留SFC技術(shù)特點(diǎn)的同時(shí)提高了系統(tǒng)的耐壓性，促進(jìn)了樣品的高通量分析[5]。同時(shí)，UPC2可以直接進(jìn)樣有機(jī)提取物[6]，簡化了分析時(shí)的樣品處理過程，UPC2也可以聯(lián)用多種檢測器，實(shí)現(xiàn)在線色譜技術(shù)[7]。自此，SFC技術(shù)在藥物分析領(lǐng)域受到了極大的關(guān)注和廣泛的應(yīng)用。本研究中，通過查閱大量文獻(xiàn)，擬從SFC在手性藥物、天然產(chǎn)物、藥物代謝和雜質(zhì)檢測等方面的應(yīng)用進(jìn)展做簡要概述，以期對科研工作者提供幫助。

1 SFC在手性藥物分離分析中的應(yīng)用

手性對映體廣泛存在于自然界中，據(jù)統(tǒng)計(jì)，現(xiàn)有上市藥物中，50%都存在手性對映體[8]。同一對手性藥物，二者呈現(xiàn)出的藥理作用、毒副作用、藥動學(xué)特征是可能完全不同的。因此進(jìn)行手性藥物的拆分，對藥物的質(zhì)量控制及藥效評價(jià)具有重要的意義[9]。SFC在分離手性藥物方面做出了突出貢獻(xiàn)。SFC常用的分離方法有直接分離法和間接分離法。直接分離法又分為手性固定相法和手性流動相添加劑法，前者通過手性固定相營造光學(xué)環(huán)境、提供手性中心來分離對映體，后者通過固定相吸附手性添加劑從而形成非對映異構(gòu)體復(fù)合物；間接分離法是通過藥物外消旋體與手性衍生化試劑反應(yīng)來引入另一個(gè)手性中心，形成非對映異構(gòu)體復(fù)合物。手性固定相分為正相、反相和多模式固定相，常用正相固定相有Pirkle固定相、氨基酸及π-酸、π-堿類，反相固定相有環(huán)糊精類、大環(huán)抗生素類，多模式固定相有多糖類、螺旋型手性聚合物類[10]。

謝依棋等[11]分別采用超臨界流體色譜法和高效液相色譜法分離腎上腺素對映異構(gòu)體，建立并比較了兩種腎上腺素異構(gòu)體的分離方法，結(jié)果顯示：兩種方法均可應(yīng)用于腎上腺素對映異構(gòu)體的拆分及定量，但是在保證最佳分離效果的前提下，兩種對映體在SFC法中保留時(shí)間明顯比HPLC法短，表明SFC法分析效率更高；從定量結(jié)果來看，SFC法峰形更好，定量更準(zhǔn)確。同時(shí)，SFC系統(tǒng)分析方法高效節(jié)能，綠色環(huán)保。賀建峰等[12]以Enantio Pak AD和Enantio Pak IC多糖手性固定柱為載體，采用超臨界流體色譜技術(shù)對尼莫地平、氨氯地平、非洛地平和阿折地平等手性藥物進(jìn)行了手性分離。探究了不同的溫度和堿性添加劑對手性分離的影響。Miao等[13]考察了6種手性三唑類殺菌藥的實(shí)現(xiàn)分離分析的色譜條件，利用Thar SD-ASFC-2 色譜系統(tǒng)，探討不同手性色譜柱、改性劑種類及比例和背壓對試驗(yàn)的影響。作者對比了Chiralcel OD-H柱、Sino-Chiral OJ柱和Chiralpak IB柱3種色譜柱，結(jié)果表明Chiralcel OD-H柱相比于另外兩個(gè)柱子有更好的分離效果，主要原因可能是Chiralcel OD-H柱能與殺菌藥形成氫鍵作用力；作者也對比了甲醇、乙醇、異丙醇3種改性劑的優(yōu)劣，不同藥物加入的最佳改性劑以及比例都不同，但相同的是如果不加任何改性劑，3種柱對于所有的殺菌藥分離時(shí)間都超過了60 min，而加入改性劑可將時(shí)間縮短20 min以上，這可能與待測物的極性較大有關(guān)。

除了手性化學(xué)藥以外，越來越多的中藥成分也被發(fā)現(xiàn)存在手性異構(gòu)，加上中藥本身成分復(fù)雜，進(jìn)一步增加了分離分析的難度。目前主要采用色譜法來進(jìn)行分離分析。劉佩等[14]建立一種新的丹參素冰片酯和丹參素異丙酯的合成方法并運(yùn)用SFC技術(shù)對其進(jìn)行手性化合物分離，分離效果好，光學(xué)純度高，促進(jìn)了手性丹參素酯類衍生物的工業(yè)化生產(chǎn)，為手性中藥的分離提供了新思路。王波等[15]運(yùn)用超高效合相色譜探究分離芳樟醇對映體的最佳條件，考察了改性劑、動態(tài)背壓、溫度、進(jìn)樣量的影響，試驗(yàn)顯示：乙腈相比于甲醇對芳樟醇分離效果好，峰形尖銳；當(dāng)背壓在1 500～2 000 psi范圍變化，1 650 psi時(shí)的分離度最高，原因可能是由于壓力提高，CO2的密度升高，溶劑化能力變差；當(dāng)溫度在30～50 ℃變化，30 ℃的分離度最高；進(jìn)樣量對超高效合相色譜的分離效果影響較大，當(dāng)進(jìn)樣量為10 μL時(shí)，已經(jīng)完全無法分離，而進(jìn)樣量為3 μL分離效果較好。最后，作者綜合各項(xiàng)影響因素優(yōu)化形成一個(gè)較好的色譜條件，實(shí)現(xiàn)了對芳樟醇對映體的有效分離。該法與HPLC、GC相比，具有效率高、重現(xiàn)性好的優(yōu)點(diǎn)，并且操作簡單。

2 SFC在天然產(chǎn)物分離分析中的應(yīng)用

天然產(chǎn)物中的脂肪酸甘油酯、黃酮類、生物堿類等活性成分是藥物與先導(dǎo)化合物的重要來源，這類成分在生物體內(nèi)含量差異大，且分離過程中受諸多因素的限制，如：耗時(shí)長，效率低，費(fèi)溶劑等，因此周期短、效率高、綠色環(huán)保的分離技術(shù)引起越來越多的人的關(guān)注[16-17]。

2.1 脂肪酸和甘油酯 動植物油酯具有較高的營養(yǎng)價(jià)值、抗氧化能力及生物活性。由于其極性較小、組成復(fù)雜，目前常用的分析方法為先衍生化處理使轉(zhuǎn)化為脂肪酸甲酯，再采用GC/GC-MS進(jìn)行分析。但這會給分析工作帶來兩個(gè)方面的問題，其一是衍生化前處理程序煩瑣，增加了工作量；其二是衍生化處理破壞了甘油酯的初始組成，使分析的結(jié)果只能反映脂肪酸的種類，不能真實(shí)反映脂肪酸甘油酯的具體成鍵位置。超高效合相色譜技術(shù)的應(yīng)用可以很好地解決這一問題。林春華等[18]使用超高效合相色譜實(shí)現(xiàn)了快速分離分析食用植物油中的棕櫚酸、硬脂酸、油酸、亞油酸、亞麻酸等5種常見的脂肪酸，并對其進(jìn)行含量測定，此法不需要衍生化，更加方便快捷，為食品營養(yǎng)質(zhì)量鑒定和安全提供方法。Tu等[19]運(yùn)用超臨界流體色譜-四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，實(shí)現(xiàn)了對牛奶和羊奶中復(fù)雜的甘油酯成分的分離分析。作者采用Acquity UPC2BEG2-EP色譜柱，甲醇∶乙腈∶甲酸=50∶50∶0.1作為改性劑進(jìn)行梯度洗脫，柱溫50 ℃，背壓11 MPa，流速1.0 mL·min-1，進(jìn)樣量1 μL，該方法能在25 min內(nèi)分離出16種甘油二酯以及55種甘油三酯，并且找出了羊奶與牛奶成分之間的主要差異，發(fā)現(xiàn)了不同脂肪酸在甘油上的占據(jù)位置的規(guī)律。朱文星等[20]建立了超高效合相色譜串聯(lián)四級桿飛行時(shí)間質(zhì)譜快速測定中/長鏈結(jié)構(gòu)甘油三酯中甘油三酯組成的分析方法，并對其成分進(jìn)行了結(jié)構(gòu)確認(rèn)。

2.2 生物堿 對于生物堿的色譜分析，目前以薄層色譜法(TLC)，HPLC法和高速逆流色譜(HSCCC)法為主。TCL法分離效率不高，多用于該類化合物的鑒別實(shí)驗(yàn)上。HPLC是該類化合物最常用的色譜分析方法，除此以外，高速逆流色譜也可用于分析和制備復(fù)雜體系中的生物堿[21]。但是這些方法均存在分離效率不高和分析時(shí)間過長等問題，因此需要發(fā)展一種新的快速高效分析生物堿的方法。李振宇等[22]建立了采用SFC快速分離分析吳茱萸中吲哚類生物堿和雷公藤中倍半萜類生物堿的方法。通過考察不同色譜柱、進(jìn)樣量、柱溫、背壓、改性劑對峰形和出峰時(shí)間的影響，最終實(shí)現(xiàn)在15 min對吳茱萸中吲哚類生物堿的分離分析，通過與UHPLC的分析結(jié)果比較，證明兩者有很好的正交性，表明SFC串聯(lián)LC二維方法具有一定的應(yīng)用前景，可用于天然產(chǎn)物的分離分析。除此之外，作者還成功分離了雷公藤中倍半萜類生物堿復(fù)雜樣品，最佳色譜條件為Waters Acquity UPC2BEH 2-EP色譜柱、2%甲醇改性劑、柱溫45 ℃、背壓2 000 psi、進(jìn)樣量1 μL、流速1.0 mL·min-1，在10 min完成了復(fù)雜樣品的分離。

2.3 黃酮類 研究表明，約有20%的中草藥中含有黃酮類化合物，大多數(shù)黃酮類化合物具有多種生理功能和藥用價(jià)值，對疾病防治以及人體健康維護(hù)都有積極意義。黃酮類化合物主要的分離方法有柱層析法、離心薄層層析法、紙層析法[23]等。而這些方法存在提取效率低、分離過程麻煩、提取劑毒性大等缺點(diǎn)。而超臨界流體色譜對于黃酮類化合物是一種非常有效的提取方法。呂惠生等[24]應(yīng)用SFC技術(shù)從赤芍粗提物中同時(shí)分離并制備芍藥苷與芍藥內(nèi)酯苷活性組分。其采用半制備的CN色譜柱，考察了夾帶劑、CO2流量、柱壓、柱溫對分離效果的影響。為模擬制備型超臨界色譜大規(guī)模分離和制備芍藥苷和芍藥內(nèi)酯苷產(chǎn)品提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)和技術(shù)支持。王波等[25]使用超高效合相色譜法快速分離了黃芪中5種黃酮類化合物，分別考察了不同色譜柱、色譜條件對5種黃酮類化合物分離能力的影響，最終確定流速0.4 mL·min-1、甲醇為改性劑進(jìn)行梯度洗脫、背壓11.72 MPa、柱溫40 ℃為最佳條件，能夠在15 min實(shí)現(xiàn)對復(fù)雜黃酮類化合物的有效分離。王學(xué)軍等[26]將超臨界流體色譜技術(shù)應(yīng)用于銀杏葉提取物中黃酮類化合物槲皮素和蘆丁的含量測定。方法高效快速，條件溫和、定量準(zhǔn)確。相對于其他黃酮類化合物的分離方法，如液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)、高效液相色譜法，超臨界流體色譜具有儀器便宜、特異性強(qiáng)、精確度高、分離時(shí)間短的優(yōu)勢。

2.4 內(nèi)酯類 內(nèi)酯類成分的傳統(tǒng)分離純化方法，多采用有機(jī)溶劑提取-硅膠柱色譜、高速逆流色譜等。這些方法均需消耗大量的有機(jī)溶劑，不僅浪費(fèi)資源、污染環(huán)境，還難以保證產(chǎn)品的質(zhì)量。莫緒飛等[27]采用SFC技術(shù)提純當(dāng)歸揮發(fā)油中Z-藁本內(nèi)酯。通過考察流速、改性劑、溫度、壓力對色譜分離過程的影響，確定了較合適的色譜條件：CO2流速10 g·min-1，柱溫313.15 K，柱壓14 MPa；在此條件下得到了純度為98.5%的Z-藁本內(nèi)酯單體。于琳琳[28]建立了SFC分離純化木香中木香烴內(nèi)酯和去氫木香烴內(nèi)酯的方法，并對色譜分離過程的熱力學(xué)規(guī)律進(jìn)行了研究，指出該條件下的SFC分離過程為晗控過程。秦秀秀[29]以使用SC-CO2作為SFC流動相的主體，添加體積分?jǐn)?shù)為5%的乙醇，建立了從穿心蓮中分離測定穿心蓮內(nèi)酯與脫水穿心蓮內(nèi)酯的SFC方法。

2.5 糖類 糖類是人體的最主要能源物質(zhì)，其分離分析方法備受關(guān)注。常用的分離方法是GC法和HPLC法。但由于糖類的揮發(fā)性小，采用GC法常需要衍生。HPLC法雖不需要衍生化，但需使用糖分析柱(氨基柱)成本高，不適于擴(kuò)大生產(chǎn)。齊建平等[30]采用自行研發(fā)的超臨界流體色譜儀成功分離了木糖、葡萄糖和蔗糖。通過優(yōu)化有機(jī)改性劑種類、濃度、系統(tǒng)背壓、流速和溫度實(shí)現(xiàn)了在10 min內(nèi)對三種糖類的有效分離。擴(kuò)展了新型超臨界流體色譜儀的應(yīng)用范圍。

3 SFC在藥物代謝中的應(yīng)用

藥物進(jìn)入機(jī)體經(jīng)過吸收、分布后，在體內(nèi)多種藥物代謝酶(尤其肝藥酶)的作用下，化學(xué)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，完成生物轉(zhuǎn)化，稱為藥物代謝。由于機(jī)體內(nèi)血漿蛋白、內(nèi)源性物質(zhì)等成分的干擾，使體內(nèi)藥物的分離分析工作更加困難，藥物代謝檢測技術(shù)的要求也隨之提高。張淑麗等[31]建立了運(yùn)用超高效合相色譜-四極桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)研究果糖誘導(dǎo)的高尿酸血癥血清中脂質(zhì)代謝組學(xué)的方法，對比模型組和對照組的代謝圖譜，篩選出11個(gè)不同代謝物，為高尿酸血癥的早期診斷和預(yù)防提供了依據(jù)。劉蕊[32]研究并建立了UPC2-MS/MS系統(tǒng)測定人體血漿中雙環(huán)醇含量分析方法。與HPLC系統(tǒng)相比分析時(shí)間更短(4 min)，靈敏度更高，更加環(huán)保。該方法能夠滿足雙環(huán)醇臨床藥物代謝動力學(xué)研究的要求，可用于雙環(huán)醇藥物代謝動力學(xué)相關(guān)研究。孟祥駿[33]創(chuàng)新性地建立了一種快速簡單且靈敏度高的用于同時(shí)測定大鼠血漿中洛鉑兩個(gè)非對映異構(gòu)體的SFC-MS/MS分析方法，可用于研究洛鉑兩個(gè)非對映異構(gòu)體在藥代動力學(xué)上的立體選擇性，為體內(nèi)藥物分析提供了新思路。Hsieh等[34]通過填充柱超臨界流體色譜-大氣壓化學(xué)離子-串聯(lián)質(zhì)譜(pSFC-APCI/MS/MS)法進(jìn)行了氯氮平、昂丹司瓊、甲苯磺丁脲和撲利酮的代謝穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)。

4 SFC在雜質(zhì)檢測中的應(yīng)用

使用超臨界流體色譜還可以對藥物中雜質(zhì)進(jìn)行分離分析。王勇越[35]首次利用UPC2-Q-TOF對阿洛西林鈉中的聚合物進(jìn)行了分析鑒定，從質(zhì)譜圖的信息中推測從UPC2分離出的峰為雜質(zhì)聚合物峰。該法分離度良好，實(shí)現(xiàn)了采用超臨界流體色譜分離雜質(zhì)。趙紅海[36]使用反相HPLC和超臨界流體色譜(SFC)及手性制備色譜技術(shù)對庚酸炔諾酮中的兩個(gè)痕量雜質(zhì)進(jìn)行分離純化，并對這兩個(gè)雜質(zhì)進(jìn)行了結(jié)構(gòu)確認(rèn)。

5 結(jié)語

通過歸納超臨界流體色譜在分析化學(xué)中的應(yīng)用進(jìn)展，能認(rèn)識到以下幾個(gè)問題：首先，SFC對比HPLC、GC這些廣泛使用的色譜技術(shù)，存在明顯優(yōu)勢，尤其是在手性化合物的分離分析方面，所以研究人員在有分離手性化合物的需求時(shí)，可以優(yōu)先考慮SFC或者UPC2，除此之外，SFC還普遍具有分離時(shí)間短的特點(diǎn)，此特點(diǎn)可以用于大量樣品的分離分析以節(jié)省時(shí)間、提高效率，且SFC的常用流動相CO2無毒、綠色，這一點(diǎn)在當(dāng)今全球污染趨勢嚴(yán)峻的現(xiàn)狀下難能可貴； 其次，不論SFC還是UPC2仍然具有它們不可忽視的缺點(diǎn)，那就是可用的流動相種類非常有限，超臨界CO2作為最常用的流動相，不能洗脫極性化合物，同時(shí)對結(jié)構(gòu)或分子量相似的物質(zhì)的分離能力不足，雖然添加改良劑或添加劑能夠改善上述情況，但流動相中加入有機(jī)溶劑后不能采用氫焰離子化檢測器，限制了其使用，因此需要積極開發(fā)新的更加全面的流動相。