卵泡顆粒細胞黃體化過程中的基因表達、孕酮合成及與LDL的作用

張 晗，于 磊

（中國醫(yī)學科學院 醫(yī)學實驗動物研究所人源化動物模型平臺，北京100021）

黃體（corpus luteum）在雌性哺乳動物生殖過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，是維持妊娠所必需的。黃體化在濾泡破裂前已開始，過程中受多種因素的控制，也伴隨多種激素和基因的變化。文章對黃體化過程中主要激素（孕酮）的變化可能涉及的分子機制進行闡述。

1 卵泡顆粒細胞及其卵泡發(fā)育過程

卵泡顆粒細胞（granulosacell，GC）是動物生殖過程中一類重要的細胞，位于卵細胞周圍，是構(gòu)成卵泡的重要組成部分。在原始卵泡階段，顆粒細胞為單層扁平狀，包繞著卵母細胞；在初級卵泡階段，顆粒細胞變?yōu)橹鶢?；在次級卵泡階段，顆粒細胞不斷增生和分裂，變?yōu)?～6層細胞，并且出現(xiàn)卵泡腔（卵泡液是由顆粒細胞分泌的）。顆粒細胞的數(shù)量及分泌雌激素和孕激素的功能與卵泡發(fā)育狀況呈正相關(guān)，卵泡體積愈大顆粒細胞數(shù)量愈多，產(chǎn)生的激素值愈高。卵泡是卵巢的基本功能單位。卵巢卵泡發(fā)育是一個連續(xù)而復雜的變化過程，經(jīng)歷卵泡發(fā)育的啟始、募集、選擇、優(yōu)勢化、排卵和黃體化等過程。一般根據(jù)其形態(tài)變化劃分為以下幾個階段：原始卵泡、初級卵泡、次級卵泡、三級卵泡和成熟卵泡。卵泡的生長和發(fā)育也是一個高度協(xié)調(diào)的生理過程，受多種因素的影響和控制，原始卵泡到成熟卵泡的發(fā)育過程中，大部分卵泡閉鎖，只有少部分發(fā)育為優(yōu)勢卵泡后排卵，形成黃體。

2 黃體的發(fā)生

2.1 黃體的來源

黃體是由排卵后的膜黃體細胞和顆粒黃體細胞轉(zhuǎn)化而來的。成熟卵泡排卵后殘留在卵巢內(nèi)的卵泡壁塌陷，卵泡膜內(nèi)的血管和結(jié)締組織伸入顆粒層。在黃體生成素（LH）的作用下，卵泡壁的細胞體積增大，分化為一個體積很大并富含血管的內(nèi)分泌細胞團，新鮮時呈黃色，稱為黃體。顆粒細胞分化為粒黃體細胞（granular lutein cell），膜細胞分化為膜黃體細胞（theca lutein cell）。粒黃體細胞較大，呈多角形，染色較淺，數(shù)量多；膜黃體細胞較小，呈圓形或多角形，染色較深，數(shù)量少，分布于黃體的周邊。這兩種細胞具有分泌類固醇激素細胞的結(jié)構(gòu)特征，細胞內(nèi)有豐富的滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和管狀嵴的線粒體，還有脂滴和黃色脂色素。黃體是一個短暫的內(nèi)分泌組織，主要分泌孕酮。哺乳類動物黃體中有大小和形態(tài)不同的細胞，大量研究證實，黃體中有兩種黃體細胞：圍繞在卵細胞周圍的顆粒細胞在排卵后形成大黃體細胞（又稱大顆粒黃體細胞），泡膜細胞形成小黃體細胞（又稱小泡膜黃體細胞）。大黃體細胞不再發(fā)生分裂，但細胞體積增大；小黃體細胞可繼續(xù)增生，細胞數(shù)不斷增加，而細胞體積無變化。有研究者發(fā)現(xiàn)，在黃體中期及中期后有一部分大黃體細胞轉(zhuǎn)變?yōu)樾↑S體細胞，有部分小黃體細胞也會轉(zhuǎn)變?yōu)榇簏S體細胞；還有研究者發(fā)現(xiàn)，隨著黃體期進展，大細胞轉(zhuǎn)變?yōu)樾〖毎世w維母細胞樣的形態(tài)。據(jù)B.Fisch等［1］報道，在黃體期不同階段大、小黃體細胞的比例不同，黃體早期以大黃體細胞為主，隨著黃體期的進展大黃體細胞逐漸減少。大黃體細胞合成較多量的孕酮，一般孕酮量比小黃體細胞合成的孕酮量高2倍。這種差異在羊和猴上更為顯著，可達12～30倍。G.D.Niswender等［2］認為，大黃體細胞的壽命是短暫的，一般只有2～5 d，一旦黃體發(fā)生退化，80%以上的黃體細胞將消失。

2.2 黃體化生物學變化

以往人們普遍認為排卵后才發(fā)生卵巢顆粒細胞的黃體化，但越來越多的學者研究證明，黃體化也可以發(fā)生于排卵前［3］。排卵前LH峰的出現(xiàn)使顆粒細胞和膜細胞在形態(tài)和生理功能上都發(fā)生了一系列的變化，分別轉(zhuǎn)化為大黃體細胞（顆粒黃體細胞）和小黃體細胞（膜黃體細胞），此過程即為黃體化。盡管生理狀態(tài)下黃體化發(fā)生在排卵之后，但黃體化并不依賴于排卵的發(fā)生。黃體化在LH峰之后即開始，即便排卵失敗卵泡也能發(fā)生黃體化。這表明排卵和黃體化雖由同樣的促性腺激素誘導，但這兩個過程至少在一定程度上是可以相互獨立的［4］。在黃體形成過程中伴隨著很多生物學和分子生物學變化，甾類激素合成靈敏調(diào)節(jié)蛋白（StAR）將細胞質(zhì)中的游離膽固醇運送至線粒體，并由線粒體外膜轉(zhuǎn)運至內(nèi)膜。細胞色素P450側(cè)鏈裂解酶（P450scc）定位于線粒體內(nèi)膜，負責將膽固醇的側(cè)鏈催化斷裂，形成孕烯醇酮（pregnenolone）。在排卵前的卵泡液中孕酮濃度很低，合成孕酮所需要的P450scc和3β羥類固醇脫氫酶（3-hydroxysteroid dehydrogenase/Δ-5-4 isomerase，3β-HSD）的mRNA表達量暫時性降低，排卵后和黃體化期間mRNA表達量和3β-HSD酶活性升高，隨著黃體的發(fā)育和成熟卵巢孕酮合成量急劇增加。導致這一結(jié)果的主要原因是StAR和P450scc表達量增加［5］。當黃體完全功能化時膽固醇脂酶、P450scc、3β-HSD活性進一步提高。近來的研究結(jié)果表明，StAR的出現(xiàn)與孕酮的合成在時空上有一致性，可見StAR是黃體的功能指標之一［6］。在排卵后顆粒細胞很快就獲得P450scc，因此可以用這個酶的出現(xiàn)作為黃體化的標志［7］。

2.2.1 孕酮的生物合成 孕酮合成的底物是膽固醇（cholesterol）。在正常條件下，大部分膽固醇在肝臟內(nèi)合成，再以脂蛋白的形式被運輸?shù)筋惞檀忌山M織（如腎上腺皮質(zhì)、卵泡、黃體和睪丸等）。所有類固醇的合成都依賴于膽固醇被運輸至線粒體，然后從線粒體外膜被轉(zhuǎn)運至內(nèi)膜，在那里膽固醇的側(cè)鏈被膽固醇側(cè)鏈斷裂酶復合體（cholesterol sidechain cleavage enzyme complex）切開后形成孕烯醇酮（pregnenolone）。將膽固醇運輸至線粒體外膜的過程似乎需要一個完整的細胞骨架，如果微管和微絲功能受到抑制則阻止了線粒體內(nèi)膽固醇的積累。細胞骨架蛋白的磷酸化狀態(tài)可能影響類固醇的運輸速率。另外，類固醇結(jié)合蛋白也在膽固醇運輸至線粒體的過程中發(fā)揮重要作用。類固醇合成途徑中的限速步驟是將膽固醇從線粒體外膜轉(zhuǎn)運到內(nèi)膜的過程。目前已經(jīng)知道類固醇合成StAR在這個過程中是不可或缺的［8］。StAR是由含有一個線粒體靶向序列的前體經(jīng)過轉(zhuǎn)錄后修飾所形成。Y.Tsujishita等［9］的研究表明，StAR將膽固醇轉(zhuǎn)運至線粒體內(nèi)膜，StAR蛋白的C末端被證實在轉(zhuǎn)運膽固醇進入線粒體內(nèi)膜過程中發(fā)揮重要作用。這個區(qū)域被稱為StART結(jié)構(gòu)域（StAR-related lipid tansfer domains）。根據(jù)該模型，StAR蛋白的結(jié)構(gòu)允許膽固醇分子通過，StART結(jié)構(gòu)域可以改變線粒體膜，并含有一個疏水性膽固醇結(jié)合通道，每次轉(zhuǎn)運一個膽固醇分子進入內(nèi)膜。位于類固醇生成細胞線粒體膜上的外周型苯二氮受體也被證實在膽固醇運輸過程發(fā)揮作用。在類固醇生成細胞內(nèi)刪除該受體基因，使細胞類固醇合成急劇下降，而這可以被重新向細胞引入該受體所翻轉(zhuǎn)，該受體的內(nèi)源性配體已經(jīng)被證實對人絨毛膜促性腺激素（hCG）刺激的類固醇生成是必需的［10］。

膽固醇一旦進入線粒體內(nèi)，其內(nèi)膜上的膽固醇側(cè)鏈斷裂，從而形成孕烯醇酮。然后它被運送到緊挨著線粒體的滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)里的3β-HSD將孕烯醇酮轉(zhuǎn)變成孕酮［11］。

2.2.2 StAR StAR是B.J.Clark等［12］于1994年從小鼠MA-10LLeydig細胞株中克隆并純化出來的一種轉(zhuǎn)運蛋白。在動物體內(nèi)，StAR廣泛分布于卵巢、睪丸、腎上腺、腎臟和腦中。E.Lavaque［13］等研究發(fā)現(xiàn)，除了在腎上腺、黃體、睪丸間質(zhì)細胞和支持細胞等處有StAR表達外，在脊髓的施萬細胞，腦內(nèi)星形膠質(zhì)細胞，大腦皮層、海馬，小腦的顆粒細胞，下丘腦的弓狀核等處都有表達。說明StAR的分布不僅局限于類固醇激素細胞。

StAR是激素可誘導的線粒體蛋白，根據(jù)分子質(zhì)量的大小分為三種：32，37，30 kDa。其中32，37 kDa StAR是30 kDa StAR的前體。人和小鼠的StAR基因結(jié)構(gòu)分別為8.0，6.5 kb，都由6個內(nèi)含子和7個外顯子組成，外顯子長度一致。StAR在不同物種間有高度的保守性，一致性為85% ～90%，相似性約為90%。蛋白質(zhì)的端序列是線粒體引導肽，生物活性部位位于C端，可有脂質(zhì)或膽固醇結(jié)合，大約由210個氨基酸組成，稱為StAR相關(guān)脂質(zhì)轉(zhuǎn)運結(jié)構(gòu)域（StAR-related lipid transfer，STSRT），第63～188位氨基酸片段有防止蛋白酶水解的作用。StAR是類固醇激素合成中的調(diào)節(jié)蛋白之一。StAR的分布具有高度特異性，位于類固醇激素細胞的線粒體膜上，參與膽固醇由線粒體外膜向線粒體內(nèi)膜的轉(zhuǎn)運，然后由P450scc將不溶性膽固醇轉(zhuǎn)化為可溶性孕烯醇酮，是類固醇激素合成過程重要的限速步驟［14］。StAR可介導黃體中孕酮的產(chǎn)生，并且StAR的表達與孕酮形成的水平是一致的［15-16］。在黃體早期StAR蛋白的表達水平低，黃體中期升髙，而黃體晚期又下降，進一步證實了StAR的表達可作為黃體功能的可靠衡量指標。

2.2.3 P450scc 細胞色素P450被稱為加單氧酶（monooxygenase）、多功能氧化酶（mixed function oxidase）、羥化酶（hydroxyiase），是一組結(jié)構(gòu)功能相關(guān)的超家族同工酶，屬于血紅蛋白類酶。其中P450scc是動物體內(nèi)將膽固醇轉(zhuǎn)化成為孕烯醇酮的唯一酶。這個過程需要NADPH通過線粒體的鐵氧還蛋白及其還原酶給P450scc提供充足的電子。孕烯醇酮可通過3β-HSD轉(zhuǎn)化為孕酮，脫氫異雄酮通過3β-HSD轉(zhuǎn)化為睪固酮，也可以由孕酮通過CYP17轉(zhuǎn)化為睪固酮，睪酮又通過CYP19轉(zhuǎn)化為17-雌二醇（E2），因此說CYP11、3β-HSD、CYP17、CYP19這幾種類固醇代謝酶對動物的性腺類固醇生成起著至關(guān)重要的調(diào)節(jié)作用。

3 LDL的攝入與代謝

3.1 低密度脂蛋（LDL）的結(jié)構(gòu)

LDL由脂質(zhì)和蛋白質(zhì)組成，組成的超分子復合物的分子質(zhì)量達（2.5～3.0）×106Da，含有2 000～3 000個脂質(zhì)分子。在LDL的中心是一個非極性的核，其中以膽固醇酯為主，其次為一定數(shù)量的三酰甘油和一些未酯化的游離膽固醇。包裹在核外面的是親水的脂性外殼。這個外殼由單層磷脂組成，其中含有大量的游離膽固醇和一個載脂蛋白apo-B100，后者是目前已知最大的單體糖蛋白。由于LDL中不同種類脂分子間具有很強的相互作用力，因此很難將表層與核心成分彼此分離。有報道稱，在LDL中存在一個疏水的中間層，它由磷脂?；湣⒂坞x膽固醇、一些膽固醇酯分子和疏水性蛋白質(zhì)域構(gòu)成，這一描述解釋了中心核脂類與表層間的相互影響［17］。

3.2 LDL參與黃體化過程

很多研究已經(jīng)證實，StAR和P450scc基因的表達可以由多種因素（如激素、生長因子、轉(zhuǎn)錄因子和表觀遺傳修飾等）在不同的水平進行調(diào)控。LDL是黃體類固醇激素合成所需膽固醇的最主要來源之一［18］，可以被大多數(shù)物種的黃體細胞所利用。在排卵前的卵泡液中LDL含量極低，排卵后卵泡黃體化，同時黃體內(nèi)毛細血管增生，卵泡殘留的顆粒細胞和膜細胞才接觸到大量的LDL。LDL促進孕酮的產(chǎn)生不僅僅歸因于LDL作為底物提高膽固醇量，越來越多的研究證實LDL對牛黃體細胞和豬顆粒細胞的孕酮合成具有刺激作用，這種刺激可能是來源于LDL的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用［19］。也有研究表明，LDL可以上調(diào)牛顆粒細胞中StAR和P450scc的mRNA和蛋白質(zhì)表達，其中LDL對StAR的促進作用可能取決于StAR啟動子的上調(diào)和轉(zhuǎn)錄因子類固醇生成因子1的活性［20］。

4 展望

對活體動物的黃體進行體內(nèi)研究技術(shù)上存在一定的局限性，且單純以黃體細胞作為研究對象，說明其內(nèi)分泌的精細調(diào)控尚有不全之處。今后可最大化體外模擬體內(nèi)黃體化過程，進一步研究脂蛋白與黃體化過程的聯(lián)系，更深入地了解體內(nèi)卵泡排卵后LDL在顆粒細胞黃體化過程中的作用，進而為提高母畜的繁殖效率提供理論和實踐依據(jù)。