指紋圖譜技術(shù)在黃精質(zhì)量控制研究中的應(yīng)用分析

羅 莎 ，鮑康德 ，姜程曦

（1.溫州大學(xué)生命科學(xué)研究院，浙江溫州 325035；2.浙江省生物醫(yī)藥協(xié)同創(chuàng)新中心，浙江溫州 325035；3.池州市九華山黃精研究所，安徽池州 242811）

中藥的質(zhì)量鑒定和質(zhì)量評價控制方法有很多，指紋圖譜屬于其中之一[1]。通過處理之后的藥材，再經(jīng)過一定的分析技術(shù)和儀器進(jìn)行檢測，可以反映該藥材及制劑中各類不同特性的共有峰圖譜的方法，稱為中藥指紋圖譜[2]。中藥指紋圖譜與指紋識別不同，指紋識別是由基因決定的，基于先天遺傳;而中藥指紋圖譜則是基于該植物物種后天的代謝產(chǎn)物。指紋識別強(qiáng)調(diào)的是“特性”，而中藥指紋圖譜既包含“共性”又包含“特性”?！肮残浴笔悄芊从巢煌幉闹g共有的特征;“特性”是能反映該藥材與其他物質(zhì)的區(qū)別，還能反映不同地區(qū)或不同采收時間的同種藥材的差異[3]。因此中藥指紋圖譜既能用來鑒別不同種類的藥材，又能評價同種類藥材質(zhì)量的好壞。

黃精是中國傳統(tǒng)的中藥材[4]，為百合科黃精屬植物的干燥根莖，分為滇黃精（Polygonatumkingianum Collet Hemsl）、黃精（Polygonatumsibiricum Red）和多花黃精（Polygonatumcyrtonema Hua）。黃精具有養(yǎng)陰潤肺、健脾益氣、潤肺止咳、滋腎、內(nèi)熱消渴等功效[5]。黃精分布較廣，滇黃精在云南、四川、貴州、廣西等省都有分布；黃精在東北地區(qū)、西北地區(qū)、華北地區(qū)、華東地區(qū)等有分布[6]；多花黃精在華東地區(qū)、中南地區(qū)、四川、貴州等地有分布[7]。由于不同產(chǎn)地黃精的質(zhì)量和成分含量各異，因此，需要通過建立指紋圖譜為黃精的質(zhì)量控制研究提供理論依據(jù)。

1 指紋圖譜技術(shù)的應(yīng)用現(xiàn)狀與優(yōu)勢

指紋圖譜技術(shù)作為一種綜合的、可量化的鑒別分析手段，具有模糊性、整體性和專屬性，適用于控制中藥在生產(chǎn)過程中各環(huán)節(jié)中間體及成品的質(zhì)量，對藥材、飲片、提取液、濃縮液、浸膏粉、配方顆粒進(jìn)行一致性評價[8-9]。目前，中藥指紋圖譜技術(shù)已涉及眾多方法，包括薄層掃描（TLCS）、高效液相色譜法（HPLC）、氣相色譜法（GC）等色譜法，以及紫外光譜法（UV）、紅外光譜法（IR）、質(zhì)譜法（MS）、核磁共振法（NMR）和X-射線衍射法等光譜法。其中色譜方法為主流方法，尤其是HPLC、TLCS 和GC 已成為公認(rèn)的3 種常規(guī)分析手段[10]。由于HPLC 具有分離效能高、選擇性高、檢測靈敏度高、分析速度快、應(yīng)用范圍廣等特點(diǎn)，中藥成分絕大多數(shù)可在高效液相色譜儀上進(jìn)行分析檢測，且已積累較豐富的應(yīng)用經(jīng)驗(yàn)。因此高效液相色譜法已成為中藥指紋圖譜技術(shù)的首選方法。隨著HPLC-MS 和GC-MS 等聯(lián)用技術(shù)的應(yīng)用，中藥指紋圖譜技術(shù)更趨完善。

中藥及其制劑均為多組分復(fù)雜體系，因此評價其質(zhì)量應(yīng)采用與之相適應(yīng)、能提供豐富鑒別信息的檢測方法，但現(xiàn)行的顯微鑒別、理化鑒別和含量測定等方法都很難解決這一問題。建立中藥指紋圖譜將能較為全面地反映中藥及其制劑中所含化學(xué)成分的種類與數(shù)量，進(jìn)而對藥品質(zhì)量進(jìn)行整體描述和評價[11-12]，這也正好符合中醫(yī)藥整體學(xué)說。在此基礎(chǔ)上，如果進(jìn)一步開展譜效學(xué)研究，可使中藥質(zhì)量與其藥效真正結(jié)合起來，有助于闡明中藥作用機(jī)理。總之，中藥指紋圖譜的研究和建立，對于中藥質(zhì)量控制、促進(jìn)中藥現(xiàn)代化具有重要意義。

2 HPLC 法在黃精指紋圖譜研究中的應(yīng)用

高效液相色譜法（HPLC）是一種較為常用的藥物組分分離分析的手段，是選用高壓力泵將流動相泵進(jìn)到加了填充劑的色譜柱中，進(jìn)而對樣品進(jìn)行分離、測定的一種色譜方法[13-14]，具有操作簡單、分析迅速、高效率分離等優(yōu)點(diǎn)[15]。當(dāng)前HPLC 已經(jīng)普遍應(yīng)用于藍(lán)眼類、黃酮類[16]、皂苷類[17]、香豆素類[18]、生物堿類[19]等化學(xué)成分的分析[20]。王海洋等[21]為了建立黃精多糖組成糖的指紋圖譜，采用柱前衍生化HPLC 法測定黃精多糖的組成，并建立其組成糖的指紋圖譜。結(jié)果顯示，黃精多糖有4 個共有峰，分別為甘露糖、葡萄糖、半乳糖和木糖。董治程等[22]以薯頸皂苷元為對照品，對黃精藥材進(jìn)行HPLC 指紋圖譜研究，為其藥材質(zhì)量控制提供了新的方法，同時為提高中國藥典中黃精質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)奠定了一定的基礎(chǔ)。程林等[23]應(yīng)用RP-HPLC 建立黃精藥材酸水解物的指紋圖譜，并且經(jīng)過參考文獻(xiàn)[24-25]及多次試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，黃精藥材經(jīng)過酸水解衍生化后通過高效液相分析，色譜峰較高、較多且分離度良好，所以可以認(rèn)為黃精藥材的酸水解物適合建立指紋圖譜，能夠?yàn)槠渌幉牡馁|(zhì)量評價提供參考。根據(jù)程林等人的研究，除了選擇薯蕷皂苷或糖類為指標(biāo)對黃精進(jìn)行質(zhì)量檢測外，還可選擇黃精藥材的酸水解物作為指紋圖譜建立的指標(biāo)成分。趙欣等[26]用高效液相色譜-紫外檢測器聯(lián)用建立陜西楊凌黃精的指紋圖譜，結(jié)果表明，用高效液相色譜-紫外檢測器聯(lián)用建立的黃精指紋圖譜穩(wěn)定性、重復(fù)性較好。但是由于試驗(yàn)樣品及采集范圍較小，且采收時間在3、10、11 月份不等，是否為其他各產(chǎn)地的黃精質(zhì)量控制提供精準(zhǔn)參考還有待考證?？稍谮w欣等人研究的基礎(chǔ)上增加樣品基數(shù)，或根據(jù)不同采收時間建立不同的指紋圖譜，然后再進(jìn)行對照比較，為黃精的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供更加精確的參考數(shù)據(jù)。

3 UPLC 法在黃精指紋圖譜研究中的應(yīng)用

超高效液相色譜法（Ultra Performance Liquid Chromatography，UPLC）是一種新式液相色譜技術(shù)，是由超高壓力系和小顆粒填料色譜柱結(jié)合而成，其聯(lián)合之后能夠很明顯地改進(jìn)檢測樣品的靈敏度和色譜峰的分離度，可以縮短樣品分析時間，還可以減少溶劑消耗[27]。其在原理上與HPLC 類似，但又比HPLC 多了很多優(yōu)點(diǎn)。UPLC 的色譜柱粒徑最小達(dá)到了1.7 μm，而HPLC 的色譜柱粒徑一般是5 μm，因此UPLC 使得物質(zhì)的色譜峰變得更窄，增加了峰容量，大大提高了檢測的靈敏度[27]。周寶珍等[3]采用超高效液相色譜法，建立黃精UPLC 指紋圖譜。通過UPLC 對5 個不同來源的黃精成分含量進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)不同品種的黃精成分含量不一樣，由于溫度、光照、地理環(huán)境等因素的影響，同一品種不同產(chǎn)地的黃精成分含量也有差異。同時也發(fā)現(xiàn)每個產(chǎn)地的4、7、10 號共有峰的峰面積都很大，因此猜測4、7、10 號峰所對應(yīng)的成分應(yīng)該是黃精中比較重要的有效成分，若進(jìn)一步確認(rèn)這些成分，對黃精的深入研究非常重要。

目前黃精UPLC 指紋圖譜的研究報道屈指可數(shù)，這對于今后的研究來說既是困難也是機(jī)遇?；谥軐氄涞热说难芯?，可選擇適宜的試驗(yàn)方案繼續(xù)進(jìn)行，對黃精的研究可能會有較大的突破。另外，該研究僅對黃精的UPLC指紋圖譜進(jìn)行了初步探索，并未對黃精多糖、黃酮類、皂苷等進(jìn)行分析處理，因此，可在此基礎(chǔ)上選擇合適的樣品用UPLC 對其進(jìn)行研究測定，或?qū)ζ溆行С煞址暹M(jìn)一步研究分析，為黃精的質(zhì)量控制研究提供可靠的理論依據(jù)。

4 分子標(biāo)記法在黃精指紋圖譜研究中的應(yīng)用

目前，隨著分子標(biāo)記技術(shù)的發(fā)展，SSR（Simple Sequence Repeat）分子標(biāo)記以其較高的穩(wěn)定性、重復(fù)性和多態(tài)性的優(yōu)點(diǎn)，已經(jīng)應(yīng)用于多種藥用植物的研究，包括刺蒺藜、肉果草、菊花、桑黃及雞血藤等。但在藥用黃精上的相關(guān)研究尚屬空白，急需篩選黃精的SSR 核心引物并構(gòu)建核酸指紋圖譜[28]。

王世強(qiáng)等[29]對在全國32 個不同地區(qū)的野生藥用黃精種質(zhì)收集整理基礎(chǔ)上，通過前期轉(zhuǎn)錄組測序分析，篩選出黃精多糖代謝合成通路的關(guān)鍵酶基因后，據(jù)此開發(fā)并篩選SSR 核心引物，并構(gòu)建黃精品種（系）DNA 指紋圖譜庫，為今后黃精的品種選育及鑒定提供技術(shù)支撐。該研究成功應(yīng)用12 對基于多糖代謝合成通路的關(guān)鍵酶基因開發(fā)的SSR 引物，一次性鑒定32 個地區(qū)（3 個種）的黃精材料，對多糖含量接近且親緣關(guān)系相近的黃精品種也能擴(kuò)增出多態(tài)性條帶并進(jìn)行區(qū)分，且每個地區(qū)的指紋圖譜具有唯一性。楊培等[30]對44 份黃精屬樣品應(yīng)用通用引物擴(kuò)增其葉綠體 rbcL、matK、psbA-trnH 及核 ITS2 和 ITS 序列，分析其種內(nèi)、種間變異，應(yīng)用BLAST 和Nearest Distance方法計算物種鑒定效率。結(jié)果顯示，DNA 條形碼候選序列psbA-trnH、matK 及rbcL 不適用于黃精屬藥用植物的鑒定，葉綠體全序列或通過葉綠體全序列篩選合適的DNA片段可能是該屬藥用植物分子鑒定的方向。

王世強(qiáng)等人[29]的研究除了構(gòu)建傳統(tǒng)的指紋圖譜代碼，還為每一個地區(qū)的黃精種質(zhì)構(gòu)建指紋圖譜二維碼，可以高效、方便地錄入大量信息，有助于黃精優(yōu)良種質(zhì)及品種的鑒定。該DNA 指紋圖譜庫的構(gòu)建，一方面可以服務(wù)于黃精種質(zhì)資源遺傳多樣性分析，另一方面，也可結(jié)合形態(tài)學(xué)數(shù)據(jù)庫，更加立體地為品種保護(hù)、優(yōu)良品種選育、優(yōu)良種質(zhì)鑒定等相關(guān)工作提供支持。但是，黃精屬植物分布廣泛，在中國境內(nèi)就有30 多種，該研究將試驗(yàn)樣本分為3個種進(jìn)行研究，可參考其試驗(yàn)方法，對黃精其他種類的藥材進(jìn)行試驗(yàn)探究。楊培等人的研究為黃精的DNA 指紋圖譜打開了思路，既然用通用引物得不到試驗(yàn)結(jié)果，是否可大膽嘗試黃精的DNA 全序列進(jìn)行試驗(yàn)，或基于葉綠體全基因組篩選合適的DNA 片段來進(jìn)行鑒定，這都是急需解決的問題。

5 NMR 法在黃精指紋圖譜研究中的應(yīng)用

方圓等[31]將分離所得多糖單體通過單糖組成分析、核磁共振13C-NMR 和135DEPT-NMR 譜分析，得知多糖I、多糖II 及多糖III 的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)多糖III 為部分被乙酯化的果膠，這種果膠類化合物在黃精中尚屬首次發(fā)現(xiàn)。并且發(fā)現(xiàn)了低聚糖II 中有一個對稱結(jié)構(gòu)，屬于肌醇類，但具體結(jié)構(gòu)特點(diǎn)并沒有進(jìn)一步研究。由此可見，核磁共振氫譜（1H-NMR）是用于鑒定有機(jī)化合物結(jié)構(gòu)的重要方法之一，可以獲取各種有機(jī)化合物及無機(jī)化合物的包括質(zhì)子的化學(xué)位移、數(shù)量、偶合關(guān)系等在內(nèi)的多個結(jié)構(gòu)信息[32]。另外，通過查閱文獻(xiàn)[32-33]可知，HPLC-NMR 聯(lián)用技術(shù)是同時進(jìn)行未知混合物分離和結(jié)構(gòu)鑒定最好的手段之一。隨著HPLC-NMR 技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展，HPLC-NMR 聯(lián)用系統(tǒng)將成為中藥質(zhì)量控制最有效的手段之一[33]。那是否可利用核磁共振技術(shù)對黃精的某種糖類或其他含有質(zhì)子的物質(zhì)進(jìn)行檢測，從而建立黃精的核磁共振指紋圖譜研究，以及利用HPLC-NMR 聯(lián)用技術(shù)對黃精的成分進(jìn)行進(jìn)一步的開發(fā)研究，都需進(jìn)行更加深入的研究分析。

6 其他分析方法在黃精指紋圖譜研究中的應(yīng)用

隨著分子生物學(xué)的快速發(fā)展及應(yīng)用，為中藥的質(zhì)量控制提供了新的思路。利用現(xiàn)代分子生物學(xué)的原理和方法，將動植物類中藥的質(zhì)量控制技術(shù)從形態(tài)、組織、細(xì)胞推進(jìn)到分子水平，解決目前中藥品種分類和鑒定及內(nèi)在質(zhì)量評價的難題。

盧燕等[34]對黃精、玉竹進(jìn)行蛋白質(zhì)、POD 同工酶和EST 同工酶電泳指紋圖譜的分析比較，結(jié)果表明，兩者的蛋白質(zhì)、POD 和EST 同工酶3 種電泳指紋圖譜均具有明顯差異，表明電泳指紋圖譜在中藥品種鑒定上的可靠性、準(zhǔn)確性。

另外，還有一些方法沒有用于建立黃精指紋圖譜，但在建立其他中藥指紋圖譜上應(yīng)用相對較多。比如，邵艷華等[35]采用高效薄層色譜法建立了由9 個特征斑點(diǎn)構(gòu)成的砂仁揮發(fā)油類成分的高效薄層色譜指紋圖譜共有模式。楊波等[36]采用傅里葉變換紅外光譜分析方法，采集黨參藥材及水提物的紅外光譜并進(jìn)行雙指標(biāo)序列分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，所得到的黨參及其提取物的紅外光譜分析結(jié)果具有獨(dú)特而穩(wěn)定的特征，可以作為其質(zhì)量控制的根據(jù)。閆新豪等[37]采用高純水為溶劑回流提取待測冬蟲夏草的有效成分，對不同產(chǎn)地的冬蟲夏草進(jìn)行指紋圖譜采集。黃欣佩等[38]模擬沉香熏燒的使用過程并且應(yīng)用靜態(tài)頂空進(jìn)樣-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)構(gòu)建指紋圖譜。馮繼承等[39]建立雙黃連顆粒指紋圖譜，為該產(chǎn)品質(zhì)量控制提供有效方法。以上研究均證明指紋圖譜能夠解釋和評價中藥中包含的藥效成分信息，能夠更加全面準(zhǔn)確對其進(jìn)行質(zhì)量評價。因此，希望盡快建立更加切實(shí)有效的黃精指紋圖譜，使其分析方法多元化，進(jìn)一步為其質(zhì)量控制體系服務(wù)。

7 結(jié)論與展望

中藥指紋圖譜技術(shù)在現(xiàn)代及未來的中藥質(zhì)量控制中都占有很重要的地位，其可分析中藥中有效成分和無效成分的種類和含量分布的信息，符合中醫(yī)、中藥整體性和模糊性的特點(diǎn)。隨著越來越多的技術(shù)不斷被應(yīng)用于中藥指紋圖譜的研究，中藥指紋圖譜必然在中藥質(zhì)量控制、中藥藥效成分研究、中藥作用機(jī)制研究等多方面發(fā)揮更加重要的作用[40]。中藥指紋圖譜可鑒別出化學(xué)成分及組成層面上的差異，因此能鑒定其質(zhì)量的好壞，對于中藥的發(fā)展起著至關(guān)重要的作用。而保證中藥質(zhì)量的好壞和產(chǎn)業(yè)過程的全程控制，劉昌孝院士[41]提出了建設(shè)基于中藥質(zhì)量標(biāo)志物的中藥產(chǎn)品質(zhì)量追溯系統(tǒng)。中藥質(zhì)量標(biāo)志物是存在于中藥材和中藥產(chǎn)品（飲片、中藥煎劑、中藥提取物、中成藥制劑等）中固有的或加工制備過程中形成的、與中藥的功能屬性密切相關(guān)的化學(xué)物質(zhì)，作為反映中藥安全性和有效性的標(biāo)志性物質(zhì)進(jìn)行質(zhì)量控制[42-44]。因此，將兩者有效結(jié)合是保證中藥質(zhì)量控制的關(guān)鍵。

黃精作為藥食同源的中藥材，具有極大的開發(fā)潛質(zhì)和市場價值，黃精質(zhì)量的標(biāo)準(zhǔn)化、規(guī)范化是其走向大眾、走出國門的基礎(chǔ)。姜程曦等[4]通過文獻(xiàn)分析，對黃精質(zhì)量標(biāo)志物進(jìn)行預(yù)測，認(rèn)為黃精中的多糖和皂苷類成分與其有效性密切相關(guān)，是其可能的主要藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，可作為質(zhì)量標(biāo)志物進(jìn)行選擇?？筛鶕?jù)此推測，采用HPLC、TLCS、NMR、HPLC-NMR 聯(lián)用等分析手段獲取其化學(xué)組分信息并建立指紋圖譜，再將試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析整合，找到發(fā)揮作用的關(guān)鍵藥效物質(zhì)，進(jìn)而發(fā)現(xiàn)其質(zhì)量標(biāo)志物，這將是今后研究的重點(diǎn)與難點(diǎn)。黃精快速發(fā)展的瓶頸在于質(zhì)量的規(guī)范統(tǒng)一，如何快速、準(zhǔn)確、便捷地評價黃精的質(zhì)量，己成為當(dāng)前亟需解決的一個難題。因此，應(yīng)牢牢把握指紋圖譜這一重要手段，為黃精的質(zhì)量控制保駕護(hù)航，助力黃精的研究與發(fā)展。