基于線粒體DNA黑龍江野豬進(jìn)化分析

王文濤，劉 娣,*，張東杰，何鑫淼，田 明

（1.東北林業(yè)大學(xué)野生動(dòng)物與自然保護(hù)地學(xué)院，哈爾濱 150040；2.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧研究所，哈爾濱 150086）

豬是最早由人類從野生馴化為家養(yǎng)的動(dòng)物，地域和文化差異造成世界豬種遺傳多樣性非常豐富[1]，目前認(rèn)為存在2個(gè)以上豬集中馴化區(qū)域[2-3]。野豬馴化成為家豬是長(zhǎng)期自然和人工選擇結(jié)果，從分子遺傳學(xué)角度分析豬起源和進(jìn)化方面認(rèn)為，人類需求性選擇影響不同區(qū)域豬種群分化程度，豬品種呈表型和生產(chǎn)性狀差異。韓洪金等研究酪氨酸酶基因外顯子序列發(fā)現(xiàn)，中國(guó)地方豬由東亞區(qū)域野豬馴化形成[4]，但目前對(duì)于東亞區(qū)域野豬進(jìn)化方面研究較少，因此開(kāi)展黑龍江野豬系統(tǒng)進(jìn)化研究對(duì)闡述東北區(qū)域家豬起源和進(jìn)化歷史具有重要意義。

世界野豬共有5個(gè)屬、8個(gè)種、23個(gè)亞種，中國(guó)野豬有1個(gè)種和7個(gè)亞種，按照地理位置劃分，黑龍江省野豬應(yīng)屬于中國(guó)野豬東北亞種（Sus scrofa ussuricus）。Alves等通過(guò)線粒體DNA研究發(fā)現(xiàn)，不同類型野豬分別被馴化為歐洲、亞洲地區(qū)家豬[5]；Chen等研究歐洲區(qū)域家豬和野豬之間線粒體DNA發(fā)現(xiàn)，蘭德瑞斯豬和歐洲野豬酶切圖譜無(wú)差異，說(shuō)明蘭德瑞斯豬可能由歐洲野豬馴化而成[6]。黑龍江省位于我國(guó)東北區(qū)域，北、東部與俄羅斯相鄰，西部與內(nèi)蒙古、南部與吉林省接壤，黑龍江野豬與內(nèi)蒙古、吉林、遼寧、韓國(guó)野豬之間進(jìn)化關(guān)系一直受研究人員關(guān)注。

目前，在開(kāi)展物種起源、進(jìn)化和馴化方面研究時(shí)，常用線粒體DNA檢測(cè)技術(shù)，尤其是線粒體細(xì)胞色素b基因（Cytochrome b，Cyt b）和線粒體D-loop區(qū)域分析，隨著高通量測(cè)序技術(shù)發(fā)展和大規(guī)模使用，Cyt b基因和線粒體D-loop區(qū)域仍廣泛作為起源進(jìn)化重要標(biāo)記。Cyt b基因具有在動(dòng)植物種群中進(jìn)化速度適中特點(diǎn)，適合在野生動(dòng)物群體水平差異檢驗(yàn)，Meenakshi等研究發(fā)現(xiàn)，豬Cyt b基因有7個(gè)SNP位點(diǎn)，揭示Cyt b基因變異對(duì)繁殖性狀影響顯著，認(rèn)為其可作為母豬繁殖性能標(biāo)記[7]；Wang等利用Cyt b基因分析山東省地方豬品種與國(guó)外豬品種遺傳多樣性及系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，發(fā)現(xiàn)不同地方豬品種之間遺傳距離較小，可能起源于共同祖先[8]。線粒體D-loop區(qū)為線粒體基因組控制區(qū)，位于tRNA-Pro和tRNA-Phe基因之間，線粒體D-loop區(qū)一般包括左、右功能區(qū)和中間保守區(qū)3個(gè)區(qū)域，Larso等研究發(fā)現(xiàn)，不同區(qū)域家豬和野豬在遺傳方面共同特征較多，從側(cè)面證明不同國(guó)家區(qū)域家豬是由野豬馴化而來(lái)；Hongo等研究越南家豬和野豬線粒體DNA發(fā)現(xiàn)，亞洲野豬和亞洲家豬共同形成越南本土家豬[9]；Kim等對(duì)濟(jì)州豬（韓國(guó)）、中國(guó)豬、澳大利亞野豬和歐洲豬等豬種開(kāi)展研究，在最大似然距離基礎(chǔ)上分析其線粒體D-loop區(qū)序列多態(tài)性和不同豬種間系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，獲得不同豬種起源進(jìn)化關(guān)系[10]。綜合前人研究思路，本研究通過(guò)Cyt b基因和線粒體D-loop區(qū)測(cè)序、發(fā)育分析和單倍型組成分析研究黑龍江野豬系統(tǒng)進(jìn)化路徑具有可行性。

目前，關(guān)于我國(guó)東北地區(qū)野豬起源與進(jìn)化研究報(bào)道較少，東北地區(qū)野豬在全國(guó)野豬進(jìn)化分支地位尚待確定，因此，本研究通過(guò)采集黑龍江地區(qū)野豬樣本，與NCBI提供其他地區(qū)樣本Cyt b基因和線粒體D-loop區(qū)整合，開(kāi)展分子進(jìn)化研究，旨在從線粒體水平檢測(cè)與闡釋黑龍江野豬系統(tǒng)演化。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 供試動(dòng)物

黑龍江野豬樣品23個(gè)，來(lái)自黑龍江省小興安嶺地區(qū)，采集耳組織樣品，液氮保存于黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧研究所分子遺傳實(shí)驗(yàn)室。

1.1.2 供試藥劑

DNA Marker DL2000、4種脫氧核苷酸（dNTPs）、rTaq DNA聚合酶、pMD18-T載體均購(gòu)自大連寶生物工程有限公司；膠回收試劑盒和質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自上海華舜生物工程有限公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)或進(jìn)口分析純。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取

取野豬耳組織樣品50～100 mg，使用酚抽提法提取DNA，使用分光光度計(jì)和瓊脂糖凝膠電泳法測(cè)定和檢測(cè)DNA質(zhì)量，樣品DNA的OD260/280為1.70～1.90，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)時(shí)，應(yīng)滿足條帶清晰、整齊、無(wú)拖尾，點(diǎn)樣孔附近無(wú)殘留等條件，符合后續(xù)試驗(yàn)要求，樣品DNA于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 引物設(shè)計(jì)與合成

參照NCBI上豬Cyt b基因序列（NC_000845）設(shè)計(jì)引物（Forward:5'ATG ACC AAC ATC CGA AAA TCA CAC C 3'；Reverse:5'TCA CTT TAA TAG GTT GTT TTC GAT G 3'），預(yù)期擴(kuò)增長(zhǎng)度為1 137 bp。

參照NCBI上豬線粒體DNA序列（NC_000485.1）設(shè)計(jì)引物（Forward:5'CAA GCA TTC CAT TCG TAT GCA 3'；Reverse:5'TGT ACG TTA TGT CCT GTA ACC ATT G 3'），擴(kuò)增區(qū)域?yàn)镈-loop區(qū)150～591 bp，預(yù)期擴(kuò)增長(zhǎng)度為441 bp。

1.2.3 PCR反應(yīng)體系

PCR反應(yīng)體系：基因組DNA（50 ng·μL-1）1 μL，上、下游引物（10 pmol·μL-1）各1 μL，rTaq DNA聚合酶（5 U·μL-1）1 μL，dNTPs（10 mmol·L-1）2 μL，10 × PCR Buffer 2 μL，ddH2O 11 μL，共計(jì)20 μL。

PCR反應(yīng)條件為：95℃，5 min；30個(gè)循環(huán)：95℃，30 s；退火，30 s；72℃，60 s，循環(huán)結(jié)束；72℃，10 min；16℃，30 min，其中Cyt b基因退火溫度為60℃、線粒體D-loop區(qū)退火溫度為57℃。

1.2.4 克隆測(cè)序

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物通過(guò)1%瓊脂糖凝膠電泳對(duì)目的片段膠回收，連接pMD18-T載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，提取陽(yáng)性克隆質(zhì)粒后，送至北京華大公司測(cè)序。

1.2.5 遺傳多樣性分析

將所測(cè)得序列使用DNAMAN軟件作拼接和人工比對(duì)，應(yīng)用MEGA 7.0軟件比對(duì)整理后序列，并生成.meg格式文件。使用DNASP 5.10打開(kāi).meg格式文件，統(tǒng)計(jì)分析該比對(duì)序列SNP位點(diǎn)、單倍型數(shù)、單倍型多樣性、核苷酸多樣性、平均核苷酸差異數(shù)、保守區(qū)間等。

1.2.6 序列比對(duì)和系統(tǒng)進(jìn)化分析

自GenBank下載16條野豬Cyt b基因序列、457個(gè)已注釋線粒體D-loop區(qū)序列（D-loop數(shù)據(jù)集：PopSet:735861597， 1002342824， 1408588029，526162927），結(jié)合實(shí)驗(yàn)室獲得黑龍江野豬序列，17條Cyt b基因用于構(gòu)建分子進(jìn)化樹(shù)，480條線粒體D-loop區(qū)序列用于單倍型鑒定與系統(tǒng)發(fā)育分析。

單倍型鑒定采用DNASTAR lasergene11的Seq-Man Pro分離，SNP保留依據(jù)為最小等位基因頻率（Minor allele frequency，MAF）＞0.05，所有序列均采用Mega-X的Clustalw作比對(duì)，采用鄰接法建立進(jìn)化關(guān)系，使用500次重復(fù)的bootstrap分析評(píng)估每個(gè)分支的統(tǒng)計(jì)支持。

2 結(jié)果與分析

2.1 黑龍江野豬Cyt b基因系統(tǒng)進(jìn)化分析

2.1.1 PCR擴(kuò)增及克隆測(cè)序

以黑龍江野豬線粒體DNA為模板，獲得黑龍江野豬Cyt b基因條帶，PCR擴(kuò)增結(jié)果見(jiàn)圖1，與預(yù)期片段長(zhǎng)度相符。

圖1 黑龍江野豬Cyt b基因PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 PCR amplification of the Cyt b gene in Heilongjiang wild boar

獲得23條黑龍江野豬Cyt b基因序列，23條Cyt b基因全序列長(zhǎng)度均為1 140 bp，見(jiàn)圖2，其中A、T、C、G含量分別為30.2%、26.9%、29.4%和13.5%，平均A+T含量57.1%，平均C+G含量42.9%，A+T含量略高于C+G含量，未出現(xiàn)明顯偏差。

黑龍江野豬23條Cyt b基因序列共存在2個(gè)變異位點(diǎn)，全部為簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)（Parsimony informative sites），分別位于693 bp和1 045 bp處，無(wú)單一變異位點(diǎn)（Singleton variable sites）。使用Dna SP 5.1軟件分析發(fā)現(xiàn)，黑龍江野豬23條Cyt b序列共檢測(cè)出3種單倍型，單倍型多樣性（Hd）為0.605，核苷酸多樣性（π）為0.00067，平均核苷酸差異數(shù)（K）為0.69203；利用Tajima's D和Fu's Fs檢驗(yàn)得到中性檢測(cè)結(jié)果表明，黑龍江野豬Tajima's D和Fu's Fs值均呈正值，分別為0.64237和0.90198，且差異不顯著（P＞0.05），表明黑龍江野豬群體符合中性進(jìn)化假說(shuō)，種群呈較為穩(wěn)定狀態(tài)。

2.1.2 黑龍江野豬Cyt b基因系統(tǒng)進(jìn)化分析

從NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中共收集整理16條野豬Cyt b基因序列，其中9條為歐洲、亞洲和非洲野豬序列，7條為中國(guó)不同地區(qū)野豬序列，見(jiàn)表1。

圖2 黑龍江野豬Cyt b基因完整編碼區(qū)序列區(qū)Fig.2 Complete sequence region of Cyt b gene in Heilongjiang wild boar

表1 野豬類群具體情況Table 1 Specific situation of wild boar group

構(gòu)建不同野豬群體Cytb基因分子進(jìn)化樹(shù)，見(jiàn)圖3，結(jié)果表明歐洲和非洲野豬聚在一個(gè)分支，而亞洲野豬聚在另一個(gè)分支，彼此間親緣關(guān)系符合地理分布特征。

2.2 黑龍江野豬線粒體D-loop區(qū)系統(tǒng)進(jìn)化分析

2.2.1 PCR擴(kuò)增與測(cè)定

以黑龍江野豬線粒體DNA為模板，獲得黑龍江野豬線粒體D-loop高變區(qū)（150～591 bp）條帶，PCR擴(kuò)增結(jié)果見(jiàn)圖4，與預(yù)期片段長(zhǎng)度相符。

成功獲得23條黑龍江野豬線粒體D-loop高變區(qū)基因序列，其中A、T、C、G含量分別為28.7%、30.0%、25.5%和15.8%，平均A+T含量58.7%，平均C+G含量41.3%，A+T含量略高于C+G，但未出現(xiàn)明顯偏差，序列信息見(jiàn)圖5。

圖3 基于不同野豬群體Cyt b基因序列系統(tǒng)發(fā)育分析Fig.3 Phylogenetic analysis of Cyt b gene sequence in different wild boar

圖4 黑龍江野豬線粒體D-loop區(qū)PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.4 PCR amplification of the mtDNA D-loop in Heilongjiang wild boar

黑龍江野豬23條D-loop序列共存在4個(gè)變異位點(diǎn)，分別位于280 bp、388 bp、453 bp和561 bp處，全部為簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)使用Dna SP 5.1軟件分析發(fā)現(xiàn)，黑龍江野豬23條D-loop序列共檢測(cè)出3種單倍型，單倍型多樣性（Hd）為0.755，核苷酸多樣性（π）為0.00377，平均核苷酸差異數(shù)（K）為1.668；利用Tajima's D和Fu's Fs檢驗(yàn)得到中性檢測(cè)結(jié)果表明，黑龍江野豬Tajima's D和Fu's Fs值均呈正值，分別為1.493261和2.096753，且差異顯著（P＜0.05），表明黑龍江野豬群體符合中性進(jìn)化假說(shuō)，種群呈較為穩(wěn)定狀態(tài)。

圖5 黑龍江野豬線粒體D-loop高變區(qū)序列Fig.5 Sequence of hypervariable region in mitochondrial D-loop of Heilongjiang wild boar

2.2 東北亞地區(qū)野豬線粒體D-loop區(qū)系統(tǒng)進(jìn)化分析

為探討東北亞地區(qū)野豬種群分化，首先通過(guò)整合NCBI的Popset子庫(kù)中包括內(nèi)蒙古、吉林、遼寧、韓國(guó)兩個(gè)野豬子數(shù)據(jù)集（popset735861597、popset1002342824），采用鄰接法構(gòu)建基于D-loop區(qū)核苷酸序列鄰接法分子進(jìn)化樹(shù)，東北亞地區(qū)野豬群體線粒體D-loop區(qū)系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系見(jiàn)圖6。

由圖6可見(jiàn)，東北亞地區(qū)野豬主要分3個(gè)類群，其中內(nèi)蒙古、黑龍江、吉林省野豬分為兩個(gè)主要類群，一支由黑龍江和內(nèi)蒙古野豬構(gòu)成，另一支由黑龍江、吉林、內(nèi)蒙古野豬組成，第三支由遼寧省和韓國(guó)野豬組成，說(shuō)明東北亞地區(qū)野豬親緣關(guān)系符合地理分布，但存在地區(qū)差異。

2.3 野豬線粒體D-loop區(qū)單倍型鑒定

為進(jìn)一步探索黑龍江野豬起源與進(jìn)化，整合來(lái)自NCBI已注釋西亞野豬、歐洲野豬、東南亞野豬以及中國(guó)其他地區(qū)野豬序列，構(gòu)建包括480個(gè)樣本的歐亞野豬D-loop區(qū)序列集，并以猯和疣豬為兩級(jí)進(jìn)化外類群，通過(guò)SeqMan Pro過(guò)濾掉MAF小于0.05位點(diǎn)，獲得27個(gè)有效SNPs，其中包括19個(gè)簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)和8個(gè)單一變異位點(diǎn)，最大簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)為452：C/T，根據(jù)外類群提供信息，T為后天突變，見(jiàn)表2，共組成21個(gè)單倍型，歐亞野豬和外類群D-loop單倍型序列比對(duì)與進(jìn)化見(jiàn)圖7。

由圖7可見(jiàn)，所有野豬單倍型可分成兩個(gè)類群：類群I和類群II，類群I主要包括單倍型Hap 1、Hap 2、Hap 4、Hap 8、Hap 9、Hap 11、Hap 13、Hap 14和Hap 18，類群B則包含Hap 3、Hap 5、Hap 6、Hap 7、Hap 10、Hap 12、Hap 15、Hap 16和Hap 17。在類群I中，除單倍型4，其余單倍型擁有外類群代表24T和49C。黑龍江野豬包括3種單倍型，分別為Hap 7、Hap 9和Hap 15，其中Hap 9和Hap 15處于類群I，Hap 7處于類群II。

圖6 東北亞地區(qū)野豬群體線粒體D-loop區(qū)系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系Fig.6 Phylogenetic relationship derived from mitochondrial D-loop region sequences of wild boar population in Northeast Asia

表2 歐亞野豬mtDNA D-loop突變位點(diǎn)分析Table 2 Analysis of mtDNA D-loop mutation loci in Eur-asian wild boar

圖7 歐亞野豬和外類群D-loop單倍型序列比對(duì)與進(jìn)化Fig.7 D-loop haplotype sequence alignment and evolutionary of Eur-asian wild boars and outgroups

2.4 東北地區(qū)野豬單倍型組成鑒定與進(jìn)化分析

基于歐亞野豬D-loop區(qū)序列單倍型情況，對(duì)包括中國(guó)黑龍江野豬、內(nèi)蒙古野豬、吉林野豬、遼寧野豬和韓國(guó)野豬在內(nèi)東北亞地區(qū)56個(gè)野豬線粒體D-loop區(qū)高變序列作單倍型歸類，發(fā)現(xiàn)東北亞地區(qū)野豬種群共涉及5個(gè)單倍型，分為兩個(gè)類群，類群I組包括Hap 3、Hap 7、Hap 9和Hap 15，類群II組僅包括Hap 1，采用鄰接法重新構(gòu)建分子進(jìn)化樹(shù)，每個(gè)單倍型所包含不同地區(qū)野豬群體見(jiàn)圖8。

圖8 東北亞地區(qū)野豬D-loop單倍型系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系Fig.8 Phylogenetic relationship derived from D-loop haplotype sequences of wild boar population in Northeast Asia

由圖8可見(jiàn)，黑龍江野豬具有3個(gè)單倍型，分別為Hap 7、Hap 9和Hap 15，同時(shí)具有24C、24T和49T，內(nèi)蒙古野豬具有2種單倍型，分別為Hap 3和Hap 7，具有24C和49T，遼寧和韓國(guó)野豬僅一種單倍型，為Hap 1，具有與外類群一致24T和49C。

3 討 論

3.1 線粒體DNA

線粒體DNA呈母系遺傳特性，同時(shí)具有相對(duì)穩(wěn)定、背景清晰、結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、分子質(zhì)量較小、數(shù)據(jù)來(lái)源廣泛、數(shù)量眾多等特點(diǎn)，為研究生物母系起源重要標(biāo)記基因，同時(shí)試驗(yàn)材料要求相對(duì)低、獲得結(jié)果清晰，在群體遺傳學(xué)、基因組學(xué)、系統(tǒng)與進(jìn)化生物學(xué)等方面研究應(yīng)用廣泛[11-12]，但因其無(wú)法反應(yīng)父系遺傳情況，不遵守孟德?tīng)栠z傳定律，具有一定局限性，豬線粒體DNA編碼Cyt b基因等37個(gè)基因，而D-loop區(qū)為非編碼區(qū)，主要作用為調(diào)控線粒體DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄。本研究利用Cyt b基因和D-loop區(qū)開(kāi)展黑龍江野豬系統(tǒng)進(jìn)化研究，從母系遺傳角度獲得其規(guī)律，但同樣受線粒體DNA局限性制約，需深入研究。

3.2 野豬Cyt b基因系統(tǒng)進(jìn)化

現(xiàn)代野豬在全球各地皆有分布，研究人員利用線粒體DNA檢測(cè)技術(shù)，在野豬和家豬起源方面開(kāi)展大量研究，認(rèn)為不同地區(qū)家豬間在線粒體DNA上遺傳差異較大，相同地區(qū)家豬和野豬間共同遺傳特征較多，證明不同地區(qū)家豬由當(dāng)?shù)匾柏i馴化而來(lái)。本課題組前期在對(duì)民豬和大白豬Cyt b基因作遺傳多樣性研究時(shí)發(fā)現(xiàn)，民豬60條Cyt b基因序列共存在5個(gè)變異位點(diǎn)、5種單倍型，單倍型多樣性為0.638，核苷酸多樣性為0.0011，平均核苷酸差異數(shù)為1.11356，中性檢測(cè)結(jié)果表明，民豬群體符合中性進(jìn)化假說(shuō)，種群呈較為穩(wěn)定狀態(tài)；大白豬Cyt b基因序列共存在14個(gè)變異位點(diǎn)、4種單倍型，單倍型多樣性為0.581，核苷酸多樣性為0.00599，平均核苷酸差異數(shù)為6.05419，中性檢測(cè)結(jié)果表明，大白豬群體不符合中性進(jìn)化假說(shuō)，種群經(jīng)過(guò)擴(kuò)張。本試驗(yàn)在對(duì)黑龍江野豬Cyt b基因研究中同樣通過(guò)單倍型多樣性、核苷酸多樣性和平均核苷酸差異數(shù)分析其遺傳多樣性，與民豬和大白豬群體比較發(fā)現(xiàn)，所采集黑龍江野豬Cyt b基因群體遺傳多樣性相對(duì)貧乏，其核苷酸多樣性遠(yuǎn)低于民豬和大白豬，與野生狀態(tài)下黑龍江野豬不同血統(tǒng)個(gè)體交流受限有關(guān)，大白豬核苷酸多樣性最高，可能與商品化養(yǎng)殖為避免近交而不斷引入外緣血統(tǒng)或與其他豬種雜交改良有關(guān)，利用Tajima's D和Fu's Fs檢驗(yàn)得到中性檢測(cè)結(jié)果表明黑龍江野豬和民豬均符合中性進(jìn)化假說(shuō)，種群呈較為穩(wěn)定狀態(tài)，而大白豬群體不符合中性進(jìn)化假說(shuō)，種群經(jīng)歷擴(kuò)張，所得結(jié)果與3個(gè)種群實(shí)際情況相符，黑龍江野豬長(zhǎng)期處于自然繁衍狀態(tài)，民豬市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)力低于進(jìn)口商品豬種，近年一直處于保種狀態(tài)，未經(jīng)歷快速擴(kuò)群，處于相對(duì)穩(wěn)定狀態(tài)，而大白豬則是目前世界范圍內(nèi)大規(guī)模養(yǎng)殖品種；系統(tǒng)進(jìn)化分析表明歐洲和非洲野豬聚為一類，而亞洲野豬聚為另一類，彼此間親緣關(guān)系符合地理分布特征。

3.3 野豬線粒體D-loop區(qū)系統(tǒng)進(jìn)化

張怡研究發(fā)現(xiàn)野豬種群遺傳結(jié)構(gòu)，有27個(gè)單倍型為東亞野豬線粒體DNA D-loop區(qū)序列獨(dú)有，東亞野豬遺傳多樣性顯著高于歐洲野豬，認(rèn)為東亞野豬由12個(gè)獨(dú)立分支構(gòu)成，朝鮮野豬和韓國(guó)野豬分散在3個(gè)亞支中，東亞野豬在不同地理區(qū)域經(jīng)歷不同種群歷史[13]。本研究針對(duì)23頭黑龍江野豬樣品，展開(kāi)線粒體D-loop高變區(qū)150～591 bp測(cè)序分析，所構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)表明，黑龍江野豬和吉林野豬、內(nèi)蒙古野豬親緣關(guān)系較近，與遼寧野豬和韓國(guó)野豬相對(duì)較遠(yuǎn)，符合地理分布特征，與黑龍江野豬Cyt b基因系統(tǒng)進(jìn)化分析一致，也與張冬杰等對(duì)黑龍江野豬分子進(jìn)化分析結(jié)果相同[14]。

在世界家豬進(jìn)化領(lǐng)域，部分研究人員認(rèn)同傳統(tǒng)二元論觀點(diǎn)，即現(xiàn)代家豬有歐亞兩大母系起源，因此野豬也被稱為歐亞野豬[15]。野豬根據(jù)地理和形態(tài)學(xué)標(biāo)準(zhǔn)則可區(qū)分為4個(gè)“亞種群”，分別為歐洲亞群，包括歐洲野豬、薩丁島野豬、北非野豬、中東野豬、高加索野豬和里海野豬；印度亞群，包括印度野豬和斯里蘭卡野豬；遠(yuǎn)東亞群，包括西伯利亞野豬和烏蘇里野豬、日本的日本野豬和琉球野豬、中國(guó)臺(tái)灣野豬、華南野豬和高麗野豬；印尼亞群，包括印尼野豬，目前已記錄野豬有20個(gè)亞種，黑龍江省內(nèi)野豬，按地理位置分應(yīng)屬于遠(yuǎn)東亞群。倪攀研究歐亞野豬線粒體DNA發(fā)現(xiàn)，東北野豬出現(xiàn)在歐洲家豬和野豬分支，部分歐洲家豬出現(xiàn)在亞洲分支，說(shuō)明存在母系滲入現(xiàn)象[16]；李崇奇等研究中國(guó)野豬線粒體DNA發(fā)現(xiàn)，中國(guó)華南區(qū)域野豬通過(guò)自然遷徙或人口流動(dòng)，由華南地區(qū)向北部區(qū)域移動(dòng)，到達(dá)中國(guó)東北區(qū)域形成東北區(qū)域野豬[17]；徐秋良等在對(duì)淮南豬、東北野豬單倍型Network網(wǎng)絡(luò)研究中發(fā)現(xiàn)，東北野豬雖與淮南豬擁有部分共同單倍型，但與國(guó)外豬種親緣關(guān)系較近[18]；楊國(guó)偉等在東北野豬線粒體DNA研究中發(fā)現(xiàn)，東北區(qū)域野豬可能從歐洲方向遷移而來(lái)[19]。因黑龍江省與俄羅斯接壤有關(guān)，其地理區(qū)域橫跨歐亞大陸，部分歐洲野豬參與東北區(qū)域野豬形成。

3.4 黑龍江野豬單倍型進(jìn)化分析

本研究依據(jù)線粒體D-loop高變區(qū)單倍型篩選，歐亞野豬主要有21種單倍型，根據(jù)圖6可看出，外類群代表性SNP為24T和49C，由此類群I應(yīng)為最古老野豬種群，Hap9和Hap10則為24C和49C，屬于向類群II過(guò)渡的代表性單倍型，類群II為后續(xù)演化野豬種群，該類群可能為第二輪進(jìn)化擴(kuò)散結(jié)果，為歐亞野豬馴化起源提供理論依據(jù)。由單倍型組成分析可知，東北亞地區(qū)野豬共存在5種線粒體D-loop單倍型，根據(jù)圖7單倍型分子進(jìn)化關(guān)系，內(nèi)蒙古、黑龍江、吉林野豬屬于類群II，而遼寧省和韓國(guó)野豬則屬于類群I，黑龍江野豬3種單倍型Hap 7、Hap 9和Hap 15中，具有24C、24T和49T，內(nèi)蒙古野豬2種單倍型Hap 3和Hap 7中，具有相同24C和49T，遼寧野豬和韓國(guó)野豬唯一單倍型Hap 1，D-loop區(qū)在此處為24T和49C，與外類群猯和疣豬一致，說(shuō)明遼東半島地區(qū)野豬可能為最古老野豬進(jìn)化分支之一；由于樣本收集有限，本研究及NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)遼寧野豬、吉林野豬、黑龍江野豬和內(nèi)蒙古野豬線粒體DNA序列中，并未發(fā)現(xiàn)過(guò)渡單倍型Hap9和Hap10，說(shuō)明吉林野豬、黑龍江野豬和內(nèi)蒙古野豬并非從遼東半島演化而來(lái)，可能從另外一條遷徙路線形成當(dāng)?shù)匾柏i，在吉林、黑龍江和內(nèi)蒙古等地發(fā)生分化，而黑龍江野豬線粒體D-loop區(qū)單倍型種類最多（3種），包括內(nèi)蒙古野豬和吉林野豬所有單倍型，說(shuō)明黑龍江地區(qū)可能為中國(guó)東北部野豬分化中心之一，研究結(jié)果為東北亞地區(qū)野豬起源與進(jìn)化提供理論依據(jù)。

4 結(jié)論

①獲得黑龍江野豬Cyt b基因序列，其遺傳多樣性相對(duì)較低；分子進(jìn)化樹(shù)顯示不同地區(qū)野豬親緣關(guān)系遠(yuǎn)近符合地理分布特征，與其線粒體D-loop區(qū)序列進(jìn)化分析結(jié)果一致。

②黑龍江野豬線粒體D-loop區(qū)序列單倍型系統(tǒng)進(jìn)化分析表明，黑龍江野豬單倍型種類最多（3種），包括內(nèi)蒙古野豬和吉林野豬所有單倍型，黑龍江地區(qū)可能是野豬分化中心之一。

本研究雖整合大量來(lái)自NCBI野豬線粒體D-loop區(qū)數(shù)據(jù)，但仍難以保證野豬樣本覆蓋度，線粒體DNA屬于母系遺傳的鑒定手段，后期需開(kāi)展大樣本采集與全基因組測(cè)序，揭示東北亞地區(qū)野豬真正進(jìn)化途徑。