結(jié)直腸癌組織中miR-767-3p表達(dá)水平與上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的關(guān)系分析

陳敏洋

結(jié)直腸癌（CRC）為具有高隱匿性、低長(zhǎng)期生存率特點(diǎn)的常見惡性腫瘤，是全球癌癥相關(guān)性死亡的主要原因[1]。盡管腫瘤的診療技術(shù)在不斷發(fā)展，但CRC 的治愈率和長(zhǎng)期生存率并沒有顯著的提高[2]。結(jié)直腸癌導(dǎo)致死亡的主要原因是遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，預(yù)計(jì)約60%的結(jié)直腸癌患者會(huì)出現(xiàn)轉(zhuǎn)移[3]。腫瘤轉(zhuǎn)移是一個(gè)高度復(fù)雜的多步驟過程，并且與上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）密切相關(guān)[4]。而miRNA為動(dòng)植物中廣泛存在的非編碼RNA[5]。目前許多研究發(fā)現(xiàn)，在各種疾病包括腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移中，各種miRNA 參與其中。有研究證實(shí)，CRC的miRNA 差異表達(dá)譜中miR-767-3p 明顯高表達(dá)，且具有一定的診斷價(jià)值[6]。而miR-767-3p 的表達(dá)是否參與癌細(xì)胞的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移有待探討，可通過研究癌細(xì)胞EMT 的程度分析。本研究通過觀察結(jié)直腸癌細(xì)胞和癌前細(xì)胞的miR-767-3p、EMT 相關(guān)蛋白表達(dá)情況及患者的病理特征，分析、推測(cè)結(jié)直腸癌組織中miR-767-3p 表達(dá)水平、EMT 及癌組織侵襲和轉(zhuǎn)移的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取江西省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院病理科2017 年1 月-2021 年12 月收治的70 例結(jié)直腸癌患者的癌組織、癌旁正常組織石蠟標(biāo)本及相關(guān)的臨床資料納入研究。男39 例，女31 例，年齡30～95 歲，平均（56.24±5.96）歲。其中結(jié)腸癌33 例，直腸癌37 例；TNM 分 期：Ⅰ/Ⅱ/Ⅲ/Ⅳ期分別4/29/22/15 例。診斷標(biāo)準(zhǔn)：參照文獻(xiàn)[7]《中國(guó)結(jié)直腸癌診療規(guī)范（2015 版）》中結(jié)腸癌或直腸癌的診斷標(biāo)準(zhǔn)。納入標(biāo)準(zhǔn)：符合上述標(biāo)準(zhǔn)且經(jīng)病理學(xué)診斷確診為CRC；活檢前未經(jīng)過放化療治療；根據(jù)影像手段、CRC 手術(shù)和病理組織可以明確腫瘤的癌體位置、浸潤(rùn)深度及轉(zhuǎn)移情況。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并其他腫瘤；嚴(yán)重肝腎功能損害。

1.2 方法 收集患者結(jié)直腸癌組織和癌旁正常組織包埋在石蠟中，冰凍層-20 ℃保存。（1）miR-767-3p水平檢測(cè)：采用PCR 法檢測(cè)組織miR-767-3p 表達(dá)[8]。使用TRIzol 試劑從組織中提取總RNA。用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將提取的總RNA 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，后PCR 擴(kuò)增儀中擴(kuò)增，反應(yīng)體系20 μL，反應(yīng)條件為預(yù)變性95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，擴(kuò)增60 ℃44 s，40 個(gè)循環(huán)，以U6 作為內(nèi)部對(duì)照，以2-ΔΔCt法計(jì)算miR-767-3p 相對(duì)表達(dá)量。U6snRNA 引物序列：TTCGTGAAGCGTTCCATATrrT；miR-767-3p 引物序列：TCTGCTCATACCCCATGGTTTCT。（2）采用免疫組化法分別對(duì)E-cadherin、N-cadherin、β-catenin和Vimentin 的表達(dá)檢測(cè)，操作方法：中性甲醛固定，石蠟包埋，切片，烤片，然后酒精梯度洗脫。用pH8.0 EDTA 修復(fù)液進(jìn)行高壓加熱抗原修復(fù)，TBST沖洗，沖洗后用過氧化氫阻斷內(nèi)源性過氧化物酶。切片滴加E-cadherin 抗體（ab40772）/N-cadherin 抗體（ab76011）/Vimentin 抗體（ab92547）/β-ccatenin抗體（ab32572）等單克隆抗體（均由北京中杉公司提供）。接著孵育1 h，用DAB 試劑染色，沖洗用蘇木素復(fù)染后，脫水干燥，中性樹膠固定。細(xì)胞胞膜出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性細(xì)胞。顯微鏡（×400）視野下觀察陽性細(xì)胞百分比及染色強(qiáng)度，觀察多個(gè)視野，以判定標(biāo)準(zhǔn)陽性細(xì)胞百分比評(píng)分與染色強(qiáng)度評(píng)分的乘積≥3 分為陽性表達(dá)。標(biāo)準(zhǔn)如下：陽性細(xì)胞按≤5%、6%～25%、26%～50%、51%～75%、≥76%分別記為0、1、2、3、4 分；染色強(qiáng)度根據(jù)未染色、淡黃色、棕黃色、棕褐色分別記為0、1、2、3 分。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 21.0 統(tǒng)計(jì)軟件處理數(shù)據(jù)，符合正態(tài)性分布的計(jì)量資料采用（）表示，兩兩比較行t檢驗(yàn)，多分類的計(jì)量資料行F檢驗(yàn)，多組兩兩比較行SNK-q檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以率（%）表示，組間對(duì)比行χ2檢驗(yàn)，以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。定距和定類資料相關(guān)性分析，用單因素方差分析F檢驗(yàn)，用η（eta）系數(shù)來度量關(guān)聯(lián)強(qiáng)度，E2＞0.16，存在強(qiáng)相關(guān)；0.16≥E2≥0.06，存在中度的相關(guān)關(guān)系；E2＜0.06，相關(guān)程度比較微弱。

2 結(jié)果

2.1 癌組織和癌旁正常組織的miR-767-3p 和EMT指標(biāo) 結(jié)直腸癌患者的癌組織中miR-767-3p 表達(dá)量明顯高于癌旁正常組織，E-cadherin 陽性率明顯低于癌旁正常組織，N-cadherin 陽性率、β-catenin陽性率、Vimentin 陽性率均明顯高于癌旁正常組織，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表1。

表1 癌組織和癌旁正常組織的miR-767-3p和EMT指標(biāo)

2.2 結(jié)直腸癌組織中miR-767-3p 和EMT 相關(guān)蛋白的表達(dá) 以CRC 癌組織中的miR-767-3p 表達(dá)的中位數(shù)（4.63）為界限值，將CRC 患者分為miR-767-3p 高表達(dá)組和低表達(dá)組。E-cadherin（+）的miR-767-3p 表達(dá)量明顯低于E-cadherin（-），且miR-767-3p 高表達(dá)組的E-cadherin（+）比例顯著低于低表達(dá)組（P＜0.05）；N-cadherin（+）的miR-767-3p 表達(dá)量明顯高于N-cadherin（-），且miR-767-3p 高表達(dá)組的N-cadherin（+）比例顯著高于低表達(dá)組（P＜0.05）；β-catenin（+）的miR-767-3p 表達(dá)量明顯高于β-catenin（-），且miR-767-3p 高表達(dá)組的β-catenin（+）比例顯著高于低表達(dá)組（P＜0.05）；Vimentin（+）的miR-767-3p 表達(dá)量明顯高于Vimentin（-），且miR-767-3p 高表達(dá)組的Vimentin（+）比例顯著高于低表達(dá)組（P＜0.05）。見表2、3。

表2 結(jié)直腸癌組織中EMT相關(guān)蛋白的不同表達(dá)的miR-767-3p表達(dá)量比較（）

表2 結(jié)直腸癌組織中EMT相關(guān)蛋白的不同表達(dá)的miR-767-3p表達(dá)量比較（）

表3 miR-767-3p高表達(dá)組、低表達(dá)組EMT相關(guān)蛋白的表達(dá)比較[例（%）]

2.3 miR-767-3p 在不同臨床病理特征結(jié)直腸癌組織中的表達(dá) 不同浸潤(rùn)深度的腫瘤組織miR-767-3p 比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），且在miR-767-3p高表達(dá)組和低表達(dá)組上的分布差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；腫瘤的不同分化程度、轉(zhuǎn)移情況和TNM 分期的miR-767-3p 比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；高分化的腫瘤的miR-767-3p 表達(dá)量顯著低于中、低分化的腫瘤（P＜0.05）；而在miR-767-3p 高表達(dá)組中，低分化程度的腫瘤比例（45.71%）比低表達(dá)組（11.43%）更高；有腫瘤轉(zhuǎn)移的癌組織中miR-767-3p 表達(dá)量更高，而miR-767-3p 低表達(dá)組中無腫瘤轉(zhuǎn)移的比例（85.71%）更高；TNM 分期為Ⅰ～Ⅱ期的癌組織中miR-767-3p 表達(dá)量顯著高于Ⅲ期和Ⅳ期，且高表達(dá)組中Ⅰ～Ⅱ期比例（54.29%）明顯更高。見表4、5。

表4 不同臨床病理特征結(jié)直腸癌組織中的miR-767-3p表達(dá)

2.4 結(jié)直腸癌組織的miR-767-3p 表達(dá)量與上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化、腫瘤病理特征的關(guān)系及相關(guān)程度 癌組織中miR-767-3p 表達(dá)量與E-cadherin、N-catenin、Vimentin 表達(dá)存在相關(guān)關(guān)系（P＜0.05），且E2＞0.16，相關(guān)程度強(qiáng)；癌組織中患者的miR-767-3p 表達(dá)量與β-cadherin 表達(dá)存在相關(guān)關(guān)系（P＜0.05），0.16≥E2≥0.06，存在中度的相關(guān)關(guān)系。癌組織中患者的miR-767-3p 表達(dá)量與腫瘤分化程度、TNM 分期存在相關(guān)關(guān)系（P＜0.05），且E2＞0.16，相關(guān)程度強(qiáng)；癌組織中患者的miR-767-3p 表達(dá)量與腫瘤的轉(zhuǎn)移情況存在相關(guān)關(guān)系（P＜0.05），0.16≥E2≥0.06，存在中度的相關(guān)關(guān)系；癌組織中患者的miR-767-3p表達(dá)量與浸潤(rùn)深度無相關(guān)關(guān)系（P＞0.05）。見表6。

表5 miR-767-3p高、低表達(dá)組的臨床病理特征比較[例（%）]

表6 miR-767-3p與不同EMT蛋白、侵襲和轉(zhuǎn)移的相關(guān)程度

3 討論

miRNA 為長(zhǎng)度在19～30 個(gè)核苷酸之間的非編碼RNA，參與各種生物學(xué)和病理過程，包括腫瘤細(xì)胞增殖、存活、凋亡和腫瘤發(fā)生[5]。在過去二十年里，大量研究發(fā)現(xiàn)疾病都有特殊的miRNA 表達(dá)譜，與正常組織中的表達(dá)不同，這些差異同時(shí)在癌癥中發(fā)現(xiàn)，因此miRNA 目前作為基因表達(dá)調(diào)節(jié)劑被廣泛研究癌癥的新診斷標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)[9-11]。miR-767 可根據(jù)核苷酸的排列分為miR-767-3p 和miR-767-5p，后者目前在國(guó)外廣泛用于尋找腫瘤的新治療靶點(diǎn)，而miR-767-3p 在腫瘤方面的研究的相關(guān)報(bào)道較少。但有研究發(fā)現(xiàn)CRC 患者的癌細(xì)胞和外周血組織中miR-767-3p 相對(duì)健康人群高表達(dá)[12]。EMT 是腫瘤細(xì)胞惡性過程，侵襲和轉(zhuǎn)移的重要機(jī)制之一，主要表現(xiàn)為上皮細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞極性和緊密連接喪失，細(xì)胞間黏性降低，以及向具有侵襲性和轉(zhuǎn)移性能力的間質(zhì)細(xì)胞形態(tài)的轉(zhuǎn)化[13]。因此本研究通過對(duì)CRC 患者的病理標(biāo)本檢測(cè)觀察miR-767-3p、EMT 相關(guān)蛋白表達(dá)情況并結(jié)合患者的病理特征，分析miR-767-3p 的不同表達(dá)與癌組織的侵襲和轉(zhuǎn)移的關(guān)系。

在本研究中，CRC 患者癌組織和癌旁正常組織中miR-767-3p、E-cadherin 陽性率、N-cadherin 陽性率、β-catenin 陽性率、Vimentin 陽性率均有顯著性差異，癌組織中miR-767-3p 表達(dá)水平高于癌旁正常組織中，EMT 蛋白的表達(dá)異常均傾向EMT過程變化。說明在CRC 患者癌組織不同于癌旁正常組織，出現(xiàn)了miR-767-3p 高表達(dá)和EMT 過程。這結(jié)果與劉霞等[12]的研究相符，且提供了進(jìn)一步研究的基礎(chǔ)。

在本研究中，癌組織患者EMT 各蛋白不同表達(dá)下的miR-767-3p 的表達(dá)量均顯著不同，E-cadherin（+）者miR-767-3p 的表達(dá)量明顯更低，N-cadherin（+）者、β-catenin（+）者、Vimentin（+）者miR-767-3p 的表達(dá)量均明顯更高，體現(xiàn)不同miR-767-3p 表達(dá)量的癌組織與EMT 的進(jìn)程有所不同。以CRC 癌組織中的miR-767-3p 表達(dá)的中位數(shù)4.63 為界限值，將CRC 患者分為miR-767-3p高表達(dá)組和低表達(dá)組，EMT 各蛋白的表達(dá)在高表達(dá)組和低表達(dá)組上分布有顯著差異，高表達(dá)組的E-cadherin 陽性率更低，而N-cadherin、β-catenin、Vimentin 陽性率更高。在相關(guān)性分析中，E-cadherin、N-cadherin、Vimentin 與miR-767-3p的表達(dá)都有強(qiáng)相關(guān)性，β-catenin 與miR-767-3p 的表達(dá)中等相關(guān)，以上結(jié)果均可表明miR-767-3p 的高表達(dá)很可能與EMT 過程有關(guān)。在腫瘤中EMT 通常表現(xiàn)為E-鈣黏蛋白轉(zhuǎn)化為N-鈣黏蛋白，這種轉(zhuǎn)化表現(xiàn)為上皮細(xì)胞標(biāo)志物（E-cadherin）的下調(diào)表達(dá)和間充質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物（N-cadherin 和Vimentin）的上調(diào)表達(dá)，同時(shí)可能出現(xiàn)β-catenin 的入核，激活Wnt/β-catenin 通路，這些蛋白是EMT 發(fā)生和發(fā)展的基本標(biāo)志物[14-15]。有研究報(bào)告，E-cadherin、β-catenin、N-cadherin 和Vimentin 的表達(dá)與臨床病理特征（如局部腫瘤分化和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移）和患者預(yù)后不良之間存在顯著相關(guān)性[16-17]。與本研究中miR-767-3p、EMT 相關(guān)蛋白、腫瘤病理特征結(jié)果與上述描述相符。miR-767-3p 異常表達(dá)導(dǎo)致CRC 癌組織EMT 進(jìn)展的具體作用的信號(hào)通路或基因上尚未明確，在其他腫瘤細(xì)胞（人黑色素瘤、膠質(zhì)瘤、非小細(xì)胞肺癌）中，其通過靶向TET 基因，降低TET1和TET3 的活性，導(dǎo)致抑癌基因5-羥甲基胞嘧啶（5-mC）水平降低，調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞DNA 甲基化，減少對(duì)E-cadherin 的保護(hù)和減少對(duì)Wnt/β-catenin 通路的抑制，誘發(fā)EMT 和轉(zhuǎn)移[18-20]。

腫瘤病理方面，miR-767-3p 的表達(dá)與腫瘤的分化程度、TNM 分期強(qiáng)相關(guān)，具體表現(xiàn)為高分化的腫瘤的miR-767-3p 表達(dá)量顯著低于中、低分化的腫瘤；而在miR-767-3p 高表達(dá)組中，低分化程度的腫瘤比例相比低表達(dá)組更高。TNM 分期為Ⅰ～Ⅱ期的患者癌組織中miR-767-3p 表達(dá)量顯著高于Ⅲ期和Ⅳ期，且高表達(dá)組中Ⅰ～Ⅱ期患者比例（54.29%）明顯更高；總體表現(xiàn)為miR-767-3p 表達(dá)量越高，腫瘤分化越低，且Ⅰ～Ⅱ期患者多數(shù)miR-767-3p 高表達(dá)。結(jié)果與劉霞等[12]和劉寒梢等[21]研究相符。具體機(jī)制可能與上述miR-767-3p 高表達(dá)誘發(fā)EMT 和轉(zhuǎn)移有關(guān)。

綜上所述，miR-767-3p 高表達(dá)與上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化密切相關(guān)，同時(shí)與腫瘤的病理特征有關(guān)，推測(cè)癌組織中miR-767-3p 表達(dá)水平升高可能通過促進(jìn)EMT 發(fā)生導(dǎo)致癌組織侵襲和轉(zhuǎn)移，但具體機(jī)制還有待后續(xù)研究證明。