幽門螺桿菌分子耐藥檢測(cè)指導(dǎo)的個(gè)體化治療研究進(jìn)展

林塏皓 黃麗芳 李愛民

幽門螺桿菌（helicobacter pylori，Hp）是一種可傳播的革蘭陰性病原體，在我國(guó)和全球的感染率約為50%[1-2]。根除Hp 感染是降低消化道潰瘍、防范胃癌的有效策略[3-4]。傳統(tǒng)的經(jīng)驗(yàn)治療是根據(jù)當(dāng)?shù)乜股氐哪退幪卣鏖_出處方，其方案可包括三聯(lián)療法、非鉍劑四聯(lián)療法（如序貫療法、伴同療法和混合療法）和鉍劑四聯(lián)療法，療程可為7～14 d[5]。然而，隨著Hp 耐藥率日益升高，經(jīng)驗(yàn)治療根除率一直下降，《第五次全國(guó)Hp 感染處理共識(shí)報(bào)告》推薦的14 d 鉍劑四聯(lián)療法的Hp 根除率僅為76.7%[6-8]。在此形勢(shì)下，分子生物學(xué)耐藥檢測(cè)技術(shù)因可以比傳統(tǒng)的基于培養(yǎng)的藥敏試驗(yàn)更加快速、簡(jiǎn)便地獲得Hp 的耐藥信息，并且其指導(dǎo)的個(gè)體化治療可以提高Hp 的根除率和避免不必要的耐藥抗生素的使用，因而越來(lái)越被認(rèn)可和重視[9]。然而，基于分子生物學(xué)耐藥檢測(cè)的個(gè)體化治療的具體指導(dǎo)形式、用藥方案及治療效果尚不清晰。因此，本文就基于分子生物學(xué)耐藥檢測(cè)指導(dǎo)的個(gè)體化治療的診治研究進(jìn)行系統(tǒng)綜述和分析，為個(gè)體化治療的臨床應(yīng)用提供參考。

1 Hp耐藥機(jī)制

最近一項(xiàng)研究顯示，我國(guó)Hp 對(duì)克拉霉素、左氧氟沙星、甲硝唑、阿莫西林、呋喃唑酮、四環(huán)素的原發(fā)性耐藥率分別為37.0%、34.2%、87.9%、2.2%、1.6%、1.2%，繼發(fā)性耐藥率分別為76.9%、61.6%、93.5%、6.1%、3.1%、3.3%[10]。Hp 對(duì)克拉霉素耐藥主要是因?yàn)?3S rRNA 基因的點(diǎn)突變導(dǎo)致克拉霉素與核糖體結(jié)合力降低，這些突變包括A2143G、A2142G、A2142C 等，其中A2143G 和A2142G 位點(diǎn)的突變占80%以上[11-13]。實(shí)際上，目前大多的商用分子耐藥檢測(cè)試劑盒僅涵蓋23S rRNA 基因的A2142G和A2143G 兩種突變位點(diǎn)。喹諾酮類藥物的抗菌機(jī)制主要是抑制Hp 復(fù)制過(guò)程中所必需的DNA 回旋酶和拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅳ，從而抑制細(xì)菌增殖[14]。Hp 對(duì)左氧氟沙星的耐藥主要是由于編碼DNA 的gyrA 基因喹諾酮耐藥決定區(qū)中兩個(gè)密碼子（Asn-87 和Asp-91）發(fā)生突變所致[15]。而阿莫西林、四環(huán)素、呋喃唑酮、甲硝唑、利福平耐藥分別主要由于PBP-1A、16S rRNA、oorD 和porD、rdxA 和frxA、rpoB 的 突變所致[11-13]。

2 Hp耐藥的分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)

傳統(tǒng)的耐藥檢測(cè)是基于培養(yǎng)并通過(guò)瓊脂稀釋法、紙片擴(kuò)散法或E-test 來(lái)檢測(cè)Hp 表型耐藥，具有實(shí)驗(yàn)室設(shè)備要求高、技術(shù)操作難度大、耗時(shí)（需7～10 d）、可重復(fù)性較差、存在一定主觀性等缺點(diǎn)和局限，難以臨床推廣[14]。而分子生物學(xué)耐藥檢測(cè)技術(shù)大多數(shù)以聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）為基礎(chǔ)，其可以在新鮮的、冷凍的或石蠟包埋的胃黏膜組織甚至是糞便和胃液上進(jìn)行檢測(cè)，最快可在數(shù)小時(shí)內(nèi)獲得耐藥檢測(cè)結(jié)果[9，16]。

目前已經(jīng)發(fā)展了多種分子檢測(cè)技術(shù)，各種檢測(cè)方法都有相應(yīng)的優(yōu)缺點(diǎn)。這些檢測(cè)方法有PCR 測(cè)序、PCR 限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析、熒光共振能量轉(zhuǎn)移RT-PCR、肽核酸探針RT-PCR、雙啟動(dòng)寡核苷酸引物PCR、微滴式數(shù)字PCR、基因芯片、全基因組測(cè)序、原位雜交、蛋白質(zhì)的分子檢測(cè)等[14，17]。RT-PCR 方法具有準(zhǔn)確可靠、敏感度高、操作簡(jiǎn)便、快速經(jīng)濟(jì)的優(yōu)點(diǎn)，是臨床耐藥檢測(cè)的主流[16]。由于克拉霉素和左氧氟沙星耐藥基因的突變主要為單核苷酸突變，因而非常適合PCR 技術(shù)檢測(cè)。研究也表明克拉霉素和左氧氟沙星的基因型耐藥與表型耐藥具有較好的一致性[18-19]。然而，PCR 耐藥檢測(cè)也存在一些明顯的不足與缺點(diǎn)。一方面，臨床應(yīng)用的分子生物學(xué)耐藥檢測(cè)大多僅檢測(cè)克拉霉素的耐藥突變，少有同時(shí)檢測(cè)左氧氟沙星和/或其他抗生素的耐藥突變，因而分子耐藥檢測(cè)覆蓋的抗生素類型較為局限。另一方面，耐藥檢測(cè)的標(biāo)本多為通過(guò)胃鏡操作有創(chuàng)取樣的胃黏膜組織，而對(duì)于糞便、胃液等這種無(wú)創(chuàng)取樣的標(biāo)本仍較少應(yīng)用，因?yàn)镻CR 檢測(cè)方法的準(zhǔn)確性可能會(huì)受到樣本條件及DNA 污染或降解的影響[14]。例如，死亡細(xì)菌的DNA 可能會(huì)導(dǎo)致假陽(yáng)性結(jié)果。此外，糞便樣本含有Hp DNA 量少并且糞便中血紅蛋白及其降解產(chǎn)物、多糖復(fù)合體、重金屬和蛋白質(zhì)等物質(zhì)可能會(huì)降解DNA 而影響結(jié)果的準(zhǔn)確性[20]。最后，PCR 方法只能準(zhǔn)確地針對(duì)有限數(shù)量的核苷酸，不能檢測(cè)與耐藥相關(guān)的所有可能突變和復(fù)雜結(jié)構(gòu)變體。目前商業(yè)上可用的分子耐藥檢測(cè)只能檢測(cè)最常見的耐藥突變類型，額外的耐藥突變或替代機(jī)制容易導(dǎo)致假陰性結(jié)果[14]。對(duì)于其他分子檢測(cè)技術(shù)，如全基因組測(cè)序可檢測(cè)Hp 的全基因組，獲得更為全面的細(xì)菌基因型分型，具有能夠檢測(cè)到新的、罕見的和復(fù)雜耐藥機(jī)制的能力和優(yōu)點(diǎn)[14，21]，然而其成本昂貴、檢測(cè)周期較長(zhǎng)難以臨床普及?；蛐酒夹g(shù)則具有準(zhǔn)確可靠和高通量的特點(diǎn)[17]，但臨床樣本少時(shí)檢測(cè)成本昂貴。

3 基于分子生物學(xué)耐藥檢測(cè)的個(gè)體化治療

分子生物學(xué)耐藥檢測(cè)指導(dǎo)的個(gè)體化治療是指根據(jù)相關(guān)耐藥基因突變檢測(cè)的結(jié)果選擇敏感抗生素治療，若無(wú)敏感抗生素可供選擇，則根據(jù)當(dāng)?shù)厝巳耗退幪卣鬟x擇耐藥率低的抗生素或結(jié)合既往用藥史選用其他合適的抗生素治療。

3.1 僅檢測(cè)克拉霉素耐藥突變的個(gè)體化治療 克拉霉素耐藥率的增高使含克拉霉素的三聯(lián)療法[22-23]和鉍劑四聯(lián)療法[24-25]的初治根除率均降至難以接受的70%左右。另外，標(biāo)準(zhǔn)三聯(lián)療法對(duì)單一克拉霉素耐藥菌株的根除率更是低至40.7%[26]。隨著國(guó)內(nèi)外對(duì)首診根除成功的重視，克拉霉素耐藥的分子檢測(cè)指導(dǎo)的個(gè)體化治療被推薦列入一線治療（即首次治療）[5，27-28]。實(shí)際上，目前發(fā)表的相關(guān)研究大多僅檢測(cè)克拉霉素的耐藥突變以指導(dǎo)一線治療。這些研究表明，在初治患者中僅檢測(cè)克拉霉素基因型耐藥指導(dǎo)的個(gè)體化治療的意向治療分析（intentionto-treat，ITT）根除率為77%～96%，符合方案分析（per-protocol，PP）根除率在86%以上[24，29-30]。在這些個(gè)體化治療中，對(duì)23S rRNA 突變陰性的敏感菌株選用含克拉霉素的方案能使PP 根除率達(dá)87%以上：克拉霉素聯(lián)合阿莫西林的三聯(lián)療法的根除率為88%～97%，克拉霉素聯(lián)合阿莫西林的鉍劑四聯(lián)療法為87%～100%，序貫療法則為94%（見表1）。在療程方面，韓國(guó)的一項(xiàng)回顧性研究表明，7 d 與14 d 的 克拉霉素三聯(lián)療法對(duì)23S rRNA基因突變陰性Hp的根除率無(wú)差異（ITT：88.4% vs 85.9%，P=0.453）[31]。而對(duì)于23S rRNA 突變陽(yáng)性的耐藥菌株的治療，我國(guó)的研究顯示阿莫西林聯(lián)合四環(huán)素的鉍劑四聯(lián)療法的PP 根除率為86%[24]，阿莫西林聯(lián)合呋喃唑酮的鉍劑四聯(lián)療法的PP 根除率為94%[32]；而韓國(guó)的多項(xiàng)研究顯示使用甲硝唑聯(lián)合四環(huán)素的鉍劑四聯(lián)療法對(duì)耐藥菌株P(guān)P 根除率達(dá)到91%以上（見表1）。上述這些結(jié)果說(shuō)明僅檢測(cè)克拉霉素耐藥性指導(dǎo)的個(gè)體化治療對(duì)首次治療患者具有較好的效果。然而，對(duì)于復(fù)治患者，由于克拉霉素的繼發(fā)性耐藥率會(huì)高度增高[10]，若個(gè)體化治療的策略僅檢測(cè)克拉霉素的耐藥突變，則僅少部分患者可選用敏感的克拉霉素治療，而剩余大部分克拉霉素耐藥的患者則只能經(jīng)驗(yàn)性用藥。德國(guó)的一項(xiàng)回顧性研究顯示，復(fù)治患者23S rRNA 的耐藥突變率高達(dá)84.7%，這些耐藥患者采用避開克拉霉素的三聯(lián)或鉍劑四聯(lián)或大劑量二聯(lián)療法的總體根除率僅為66.7%[33]。因此，僅檢測(cè)克拉霉素基因型耐藥的個(gè)體化治療適用于一線治療患者，而對(duì)復(fù)治患者的臨床指導(dǎo)價(jià)值有限。

3.2 同時(shí)檢測(cè)克拉霉素和左氧氟沙星耐藥突變的個(gè)體化治療 同時(shí)檢測(cè)克拉霉素和左氧氟沙星耐藥突變指導(dǎo)的個(gè)體化治療可能最具臨床應(yīng)用價(jià)值。在治療Hp 的常用六種抗生素中，我國(guó)克拉霉素和左氧氟沙星中度耐藥（原發(fā)性耐藥率為20%～50%），甲硝唑高度耐藥，而阿莫西林、呋喃唑酮和四環(huán)素輕度耐藥并可忽略不計(jì)[7，10]，然而呋喃唑酮和四環(huán)素在我國(guó)難以普遍獲得。因此，獲得克拉霉素和左氧氟沙星的耐藥信息對(duì)指導(dǎo)治療尤為重要。相關(guān)研究表明，一線治療采用阿莫西林聯(lián)合敏感的克拉霉素或敏感的左氧氟沙星的三聯(lián)療法或鉍劑四聯(lián)療法的Hp 根除率ITT 為84%以上，PP 為90%以上（見表1）。對(duì)于復(fù)治患者，希臘的一項(xiàng)小樣本前瞻性研究中阿莫西林聯(lián)合克拉霉素或左氧氟沙星的三聯(lián)療法對(duì)敏感菌株的根除率更是達(dá)100%[34]。對(duì)于難治性Hp 感染患者（既往治療失敗至少2 次），臺(tái)灣的一項(xiàng)研究顯示，對(duì)左氧氟沙星或克拉霉素耐藥突變陰性的Hp 患者分別使用敏感的左氧氟沙星或敏感的克拉霉素聯(lián)合阿莫西林和甲硝唑的序貫療法（14 d）對(duì)敏感菌株的ITT 根除率為89%，然而對(duì)于左氧氟沙星和克拉霉素均耐藥的Hp 患者采用四環(huán)素聯(lián)合阿莫西林和甲硝唑的序貫療法的ITT 根除率僅為70%[35]。這項(xiàng)研究表明，分子耐藥檢測(cè)可以有效分辨出對(duì)克拉霉素和左氧氟沙星敏感菌株因而保證了較好的復(fù)治根除率。實(shí)際該研究中個(gè)體化治療的雙耐藥菌株患者由于阿莫西林和甲硝唑的較高耐藥率，從而導(dǎo)致了根除成功率不佳。另外相關(guān)研究表明僅甲硝唑的單一耐藥也即可降低序貫療法療效[36]。由于鉍劑的應(yīng)用可對(duì)Hp 耐藥菌株的根除率額外增加30%～40%的根除率[37]，因而對(duì)于雙耐藥菌株采用鉍劑四聯(lián)療法可能是更好的選擇?？傊瑫r(shí)檢測(cè)克拉霉素和左氧氟沙星耐藥突變的個(gè)體化治療對(duì)初治和難治性患者均存在指導(dǎo)價(jià)值，對(duì)突變陰性的患者可采用含敏感的克拉霉素或敏感左氧氟沙星治療，而如果對(duì)克拉霉素和左氧氟沙星均耐藥，選用不含克拉霉素和左氧氟沙星的鉍劑四聯(lián)療法可能是較好的選擇，其次為其他非鉍劑四聯(lián)療法。

表1 僅檢測(cè)克拉霉素或同時(shí)檢測(cè)左氧氟沙星耐藥突變的個(gè)體化治療相關(guān)研究總結(jié)一覽表

3.3 其他個(gè)體化治療 有研究顯示，Hp 對(duì)克拉霉素和左氧氟沙星的繼發(fā)耐藥率會(huì)顯著升高（分別為76.9%和61.6%）[10]。因此，對(duì)于復(fù)治特別是難治性Hp 感染患者，僅檢測(cè)克拉霉素和/或左氧氟沙星耐藥突變對(duì)指導(dǎo)選用的敏感抗生素治療的余地大幅縮小。因而同時(shí)檢測(cè)克拉霉素、左氧氟沙星、阿莫西林、四環(huán)素等多種抗生素的耐藥突變可能是較好的選擇。我國(guó)一項(xiàng)回顧性研究中，采用PCR 和測(cè)序的方法同時(shí)檢測(cè)復(fù)治患者四種抗生素（克拉霉素、左氧氟沙星、阿莫西林和四環(huán)素）的耐藥突變指導(dǎo)的個(gè)體化治療可達(dá)到令人滿意的根除率[ITT：90.67%（136/150），PP：95.10%（136/143）]。我國(guó)的另一項(xiàng)小樣本量的前瞻性隊(duì)列研究中，對(duì)難治性Hp 感染患者分別使用PCR 和全基因組測(cè)序檢測(cè)六種抗生素耐藥突變，其指導(dǎo)的個(gè)體化治療根除率分別為83.3%（10/12）和91.7%（11/12）。

另外，CYP2C19 基因多態(tài)性與質(zhì)子泵抑制劑類藥物代謝相關(guān)，其突變可影響胃液酸堿度，進(jìn)而影響抗Hp 治療效果。因此，檢測(cè)CYP2C19 基因代謝型以選擇相應(yīng)的抑酸劑并結(jié)合常用抗生素耐藥突變檢測(cè)的個(gè)體化治療也是較好的選擇。日本的一項(xiàng)研究基于PCR 技術(shù)檢測(cè)克拉霉素耐藥突變結(jié)合CYP2C19 基因多態(tài)性指導(dǎo)的個(gè)體化治療根除率達(dá)96%[46]。我國(guó)的楊莉麗等[17]基于可視化基因芯片技術(shù)同時(shí)檢測(cè)克拉霉素、左氧氟沙星耐藥和CYP2C19代謝類型指導(dǎo)的個(gè)體化鉍劑四聯(lián)療法根除率達(dá)到91.2%。

3.4 個(gè)體化治療與經(jīng)驗(yàn)性治療效果比較 分子藥敏檢測(cè)指導(dǎo)的個(gè)體化治療是否優(yōu)于經(jīng)驗(yàn)治療取決于各自治療方案的制訂。縱觀目前相關(guān)研究報(bào)道，基于分子耐藥檢測(cè)的指導(dǎo)的個(gè)體化三聯(lián)療法優(yōu)于經(jīng)驗(yàn)三聯(lián)療法[22，38-39]，而當(dāng)個(gè)體化治療采用“敏感菌株用三聯(lián)療法而耐藥菌株用鉍劑四聯(lián)療法”策略時(shí)，其療效與經(jīng)驗(yàn)性伴同療法和鉍劑四聯(lián)療法相當(dāng)[42-44]。需注意的是，目前大多數(shù)發(fā)表的個(gè)體化治療研究以檢測(cè)克拉霉素的耐藥突變?yōu)橹?，所獲得的耐藥信息有限，可供選擇的敏感抗生素非常有限。另外，大多數(shù)研究的克拉霉素分子耐藥檢測(cè)僅涵蓋23S rRNA基因的A2142G 和A2143G 這兩種突變[22，30，44]，因而存在克拉霉素耐藥假陰性的風(fēng)險(xiǎn)，從而降低了個(gè)體化治療的根除率。然而，由于鉍劑可以提高對(duì)耐藥菌株的根除率，因而在個(gè)體化治療中使用鉍劑可以一定程度上補(bǔ)救假陰性結(jié)果導(dǎo)致的不良影響。研究表明，當(dāng)個(gè)體化治療中對(duì)基因型敏感和耐藥的菌株均采用鉍劑四聯(lián)療法時(shí)，其Hp 根除率療效優(yōu)于經(jīng)驗(yàn)性鉍劑四聯(lián)療法[24-25]。

在藥物依從性方面，個(gè)體化治療和經(jīng)驗(yàn)治療間依從性相似[24]，盡管當(dāng)個(gè)體化治療中的敏感菌株感染患者使用不含鉍劑的三聯(lián)療法也同樣如此[42，47]。在藥物副作用方面，只有當(dāng)個(gè)體化治療采用更少的藥物治療（即不使用鉍劑）時(shí)才可能顯示出優(yōu)勢(shì)[30，43-44]。韓國(guó)的兩項(xiàng)研究顯示，個(gè)體化治療組中采用“敏感菌株用三聯(lián)療法而耐藥菌株用鉍劑四聯(lián)療法”方案時(shí)，其副反應(yīng)發(fā)生率顯著低于經(jīng)驗(yàn)組的含鉍四聯(lián)療法和伴同療法[30，44]。

4 小結(jié)和展望

總而言之，分子耐藥檢測(cè)技術(shù)可以較為準(zhǔn)確可靠地檢測(cè)Hp 的耐藥性，并且其指導(dǎo)的個(gè)體化治療具有較好的效果。然而，目前的分子耐藥檢測(cè)技術(shù)存在著耐藥檢測(cè)范圍有限、大多需胃鏡操作的有創(chuàng)取樣及存在假陰性風(fēng)險(xiǎn)等不足和局限。因此，耐藥檢測(cè)覆蓋范圍廣、取樣簡(jiǎn)單、快速簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)準(zhǔn)確的分子耐藥檢測(cè)技術(shù)仍待研發(fā)和突破。