觸珠蛋白-CD163-血紅素加氧酶1通路基因多態(tài)性及交互作用與2型糖尿病并發(fā)冠心病的相關(guān)性

江岳鑫，華潞，韓璐璐，柴琳，嚴(yán)巖，蔣娟娟，劉紅，田蕾，李一石

觸珠蛋白-CD163-氧應(yīng)激誘導(dǎo)型血紅素加氧酶1（Hp-CD163-HO-1）通路是在生理和病理性溶血狀態(tài)下避免游離血紅蛋白（Hb）毒性的一種高效的捕獲-受體-酶系統(tǒng)，其主要機(jī)制包括Hp-Hb清除以及Hb來(lái)源的血紅素清除[1]。2型糖尿?。═2DM）合并冠心病（CAD）患者由于冠狀動(dòng)脈（冠脈）血管彌漫病變較多，狹窄程度較重，且支架術(shù)后再狹窄發(fā)生概率及死亡率均顯著增加，所以備受重視。既往研究表明Hp 2-2型與T2DM患者發(fā)生CAD的風(fēng)險(xiǎn)[2]以及冠脈狹窄嚴(yán)重程度[3]密切相關(guān)，但并無(wú)其與冠脈病變復(fù)雜程度的研究報(bào)道，且其所在通路Hp-CD163-HO-1與T2DM患者CAD發(fā)生的相關(guān)研究并不明確，特別是基因交互作用未報(bào)道。故本文旨在研究Hp-CD163-HO-1通路中關(guān)鍵基因及交互作用與T2DM患者CAD的發(fā)生、發(fā)展的關(guān)聯(lián)。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象與分組 入選2010年～2015年于阜外心血管病醫(yī)院行冠脈造影檢查的T2DM患者共573例，其中男性390例，女性183例，年齡18～85歲。T2DM診斷依據(jù)為糖化血紅蛋白（HbA1c）≥6.5%，或空腹血糖FPG≥7.0 mmol/L，或口服糖耐量試驗(yàn)時(shí)2 h血糖≥11.1 mmol/L。排除未行冠脈造影、無(wú)完整病歷資料及糖耐量異常的病例。從入選患者中根據(jù)冠脈造影結(jié)果分T2DM合并CAD（T2DM+CAD）組（病變狹窄程度≥50%，n=301）及T2DM未合并CAD（T2DMCAD）組（冠脈狹窄程度＜50%，n=272例）；在T2DM+CAD組中，選擇無(wú)既往事件、既往PCI/CABG史的作為SYNTAX組（n=131）。

1.2 方法

1.2.1 研究設(shè)計(jì) 記錄其性別、年齡、體質(zhì)指數(shù)（BMI）、吸煙史、飲酒史、糖化血紅蛋白（HbA1c）等指標(biāo)及SYNTAX評(píng)分。校正性別、年齡、HbA1c水平等，分析tagSNPs及其交互作用與T2DM患者CAD發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)聯(lián)；根據(jù)SYNTAX評(píng)分，分析tagSNPs及其交互作用與T2DM合并CAD病變復(fù)雜程度的關(guān)聯(lián)。

1.2.2 位點(diǎn)分析 選取Hp-CD163-HO-1通路相關(guān)基因氧應(yīng)激誘導(dǎo)型血紅素加氧酶1（HMOX1）、血小板集落因子（PF4）、CD163、白介素4（IL-4）、白介素6（IL-6）、白介素10（IL-10）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）、干擾素γ（IFN-γ），基于下列條件，使用Hapmap#27選取tagSNPs：①上游5000 bp至下游5000 bp區(qū)域；②漢族（CHB或CAD）人群中最小等位基因頻率（MAF）＞0.05；③連鎖不平衡R2≥0.8。而后在上述tagSNPs中使用Haploreg V2（MIT，USA）和SNP Function Prediction（NIH，USA）篩選出具有潛在功能的tagSNPs。Hp基因分型采用二次PCR法[2]；SNPs檢測(cè)采用Taqman熒光定量PCR法進(jìn)行檢測(cè)。Hp引物：①PCR1：P-F：A (5’-GAGGGGAGCTTGCCTTTCCATTG-3’)，P-R：B(5’-GAGATTTTTGAGCCCTGGCTGGT-3’)；②PCR2：P-F：C (5’-CCTGCCTCGTATTAACTGCA CCAT-3’)，P-R：D (5’-CCGAGTGCTCCACAT AGCCATGT-3’)。其余SNPs探針來(lái)自美國(guó)Applied Biosystems公司。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 24.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析。計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組間均數(shù)的比較采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料采用例數(shù)（構(gòu)成比）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)?；蛭稽c(diǎn)分析以Plink v1.07軟件進(jìn)行，計(jì)算位點(diǎn)頻率、MAF、Hardy-Weinberg平衡（HW平衡）。用logistic回歸分析T2DM±CAD組tagSNPs基因型與CAD的危險(xiǎn)比；用線性回歸分析SYNTAX組tagSNPs基因型與SYNTAX評(píng)分的關(guān)系；并分別納入性別、年齡、BMI、吸煙史、高血壓、高脂血癥、動(dòng)脈粥樣硬化、胰島素使用及HbA1c水平作為協(xié)變量進(jìn)行校正。基因交互作用分析采用廣義多因子降維法（GMDR）進(jìn)行。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般資料比較 兩組患者年齡、BMI、合并高血壓病、高酯血癥比例比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＞0.05）。性別、吸煙史、胰島素使用情況及HbA1c存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P均＜0.05），將在后續(xù)分析中進(jìn)行校正（表1）。

表1 T2DM±CAD兩組組間一般臨床資料比較

2.2 Hp-CD163-HO-1通路基因SNP分布特點(diǎn)本研究篩選確定了16個(gè)位點(diǎn)作為tagSNPs，它們?cè)赥2DM±CAD組及SYNTAX組中的基因型分布特點(diǎn)見(jiàn)表2。T2DM±CAD組中Hp、rs2071748及rs2070874不符合HW平衡；SYNTAX組中Hp不符合HW平衡（P＜0.05）。不符合HW平衡的位點(diǎn)將在后續(xù)分析中排除。

2.3 Hp-CD163-HO-1通路基因SNP與T2DM患者并發(fā)CAD的相關(guān)性 在T2DM并發(fā)CAD風(fēng)險(xiǎn)上，CD163 rs11054072 GA型較AA型風(fēng)險(xiǎn)低（OR=0.69，95%CI：0.49～0.98，P=0.04），IL-4rs3756074 TT型較CC型風(fēng)險(xiǎn)更低（OR=0.11，95%CI：0.01～0.85，P=0.03）；而HMOX1 rs743811 TT型較CC型風(fēng)險(xiǎn)高（OR=2.06，95%CI：1.16～3.64，P=0.01）。在T2DM合并CAD的復(fù)雜程度上，HMOX1 rs743811 TC型較CC型（β=-3.76，95%CI：-7.31～-0.22，P=0.04）及IFN-γ rs2069705 AG型較GG型（β=-3.68，95%CI：-7.19～-0.17，P=0.04）分別表現(xiàn)出基因型與SYNTAX評(píng)分的負(fù)相關(guān)（表3）。

表2 Hp-CD163-HO-1通路基因SNP分布特點(diǎn)

校正協(xié)變量后，在T 2 D M并發(fā)C A D風(fēng)險(xiǎn)上，CD163 rs11054072 GA型較AA型風(fēng)險(xiǎn)更低（O R=0.6 9，9 5%C I：0.4 7～1.0 0，P＜0.05），IL-4 rs3756074 TT型較CC型風(fēng)險(xiǎn)更低（OR=0.11，95%CI：0.01～0.91，P=0.04）；而HMOX1 rs743811 TT型較CC型風(fēng)險(xiǎn)更高（OR=2.06，95%CI：1.13～3.75，P=0.02），與T2DM患者合并CAD相關(guān)；HMOX1 rs743811 TC型較CC型（β=-4.08，95%CI：-7.68～-0.48，P=0.03）及IFN-γ rs2069705 AG型較GG型（β=-3.92，95%CI：-7.39～-0.45，P=0.03）分別表現(xiàn)出與SYNTAX評(píng)分的負(fù)相關(guān)（表4）。

表3 Hp-CD163-HO-1通路基因型與T2DM患者CAD發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)及病變復(fù)雜程度（未校正）

2.4 Hp-CD163-HO-1通路基因交互作用與T2DM患者并發(fā)CAD的相關(guān)性 校正的GMDR分析所示（表5），T2DM±CAD組間HMOX1 rs743811與IL-4 rs3756074存在交互作用（CVC 2/10，訓(xùn)練樣本準(zhǔn)確度57%，測(cè)試樣本準(zhǔn)確度44%）；同時(shí)HMOX1 rs743811、IL-10 rs1800871與IL-6 rs1800796三個(gè)位點(diǎn)間也存在交互作用（CVC 2/10，訓(xùn)練樣本準(zhǔn)確度61%，測(cè)試樣本準(zhǔn)確度45%），但均不能確定與T2DM患者CAD發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)（P＞0.05）。SYNTAX組IFN-γ rs2069705與IL-10 rs3790622存在交互作用（CVC4/10，訓(xùn)練樣本準(zhǔn)確度67%，測(cè)試樣本準(zhǔn)確度42%），且與T2DM患者冠脈病變復(fù)雜程度相關(guān)（P＜0.05）；同時(shí)HMOX1 rs743811、IL-10 rs1800871與IL-6 rs1800796三個(gè)位點(diǎn)間也存在交互作用（CVC 4/10，訓(xùn)練樣本準(zhǔn)確度76%，測(cè)試樣本準(zhǔn)確度44%），并與T2DM患者冠脈病變復(fù)雜程度相關(guān)（P＜0.05）。

表4 Hp-CD163-HO-1通路基因基因型與T2DM患者CAD發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)及病變復(fù)雜程度（校正后）

表5 Hp-CD163-HO-1通路基因位點(diǎn)交互作用的GMDR分析

3 討論

本研究探索了Hp-CD163-HO-1通路基因及其交互作用與T2DM患者CAD發(fā)生及發(fā)展的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)IL-6 rs1800796，HMOX1 rs743811與IL-10 rs1800871三個(gè)基因的交互作用與T2DM患者CAD病變冠脈病變復(fù)雜程度有關(guān)。

HW平衡是遺傳學(xué)研究的基石[4,5]，為避免影響后續(xù)分析結(jié)果，本研究舍去了不符合HW平衡的位點(diǎn)?；蚨鄳B(tài)性結(jié)果顯示，HMOX1 rs743811 TT型與T2DM患者CAD的發(fā)生及病變復(fù)雜程度均有明確相關(guān)性，且該位點(diǎn)同時(shí)存在于后續(xù)基因交互作用的模型中。以往HMOX1與CAD相關(guān)的報(bào)道主要見(jiàn)于其啟動(dòng)子區(qū)域的GT重復(fù)[6-8]，關(guān)于本位點(diǎn)的研究較少。

本研究在分析T2DM患者CAD發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)的基因交互作用時(shí)，得到的兩位點(diǎn)模型（HMOX1 rs743811和IL-4 rs3756074）及三位點(diǎn)模型（HMOX1 rs743811、IL-6 rs10800796和IL-10 rs1800871）均存在交互作用，其中后者訓(xùn)練樣本準(zhǔn)確度（0.61）和測(cè)試樣本準(zhǔn)確度（0.45）均高于前者（0.57，0.40），表明后者模型擬合更優(yōu)，但因P＞0.05，并未得到統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，且二者交叉驗(yàn)證一致性較低（2/10），意義不明確。在分析T2DM合并CAD患者冠脈病變復(fù)雜程度的基因交互作用時(shí)，得到的兩位點(diǎn)模型（IFN-γ rs2069705和IL-10 rs3790622）和三位點(diǎn)模型（HMOX1 rs743811、IL-6 rs10800796和IL-10 rs1800871），二者交叉驗(yàn)證一致性均為4/10，模型擬合P值均小于0.05，說(shuō)明二者均與T2DM患者冠脈病變復(fù)雜程度相關(guān)。后者訓(xùn)練樣本準(zhǔn)確度（0.76）和測(cè)試樣本準(zhǔn)確度（0.44）均略高于前者（0.67，0.42），證明了后者更優(yōu)。本研究在分別分析T2DM±CAD組和SYNTAX組基因交互作用時(shí)，得到了相同的三位點(diǎn)模型（HMOX1rs743811、IL-6 rs10800796和IL-10 rs1800871），但僅在SYNTAX組中有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，值得在后續(xù)研究中驗(yàn)證。以往研究中，IL-6基因型與CAD是否存在確切關(guān)聯(lián)，不同的研究結(jié)果仍存在分歧[9,10]。IL-10可以在動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成過(guò)程表達(dá)，具有強(qiáng)動(dòng)脈保護(hù)和抗再狹窄作用[11-13]，但現(xiàn)存的IL-10 SNP對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)的臨床研究結(jié)果存在爭(zhēng)議[14,15]。結(jié)合本研究交互作用分析，既往研究結(jié)果中IL-6及IL-10對(duì)于CAD的不確切的研究結(jié)果可能與其存在基因交互作用相關(guān)，故今后類似研究還應(yīng)考慮并進(jìn)一步驗(yàn)證基因相互作用的影響。