息痛散對高尿酸血癥并發(fā)急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎大鼠治療作用研究*

李娟娥，姜小帆，南曉強(qiáng)，劉沈楠，吉海旺，雷 鵬△

1.陜西省人民醫(yī)院(西安710068)；2.陜西中醫(yī)藥大學(xué)(咸陽712046)

高尿酸血癥(Hyperuricemia，HUA)與痛風(fēng)(Gout)是嘌呤代謝障礙引起的代謝性疾病，痛風(fēng)除高尿酸血癥外，還可表現(xiàn)為急性關(guān)節(jié)炎(Acute gouty arthritis，AGA)，其主要表現(xiàn)為關(guān)節(jié)及周圍軟組織的紅、腫、熱、痛，病情嚴(yán)重者出現(xiàn)關(guān)節(jié)破壞。隨著我國經(jīng)濟(jì)的發(fā)展和人民生活方式的改變，高尿酸血癥和痛風(fēng)的發(fā)病率逐年上升。祖國醫(yī)學(xué)經(jīng)過數(shù)千年的發(fā)展歷程,對痛風(fēng)的防治形成了較為完整的理論體系和豐富的臨床經(jīng)驗(yàn)，但缺乏廣泛深入的相關(guān)機(jī)制研究和高證據(jù)的臨床研究。我們的前期實(shí)驗(yàn)研究和臨床應(yīng)用均發(fā)現(xiàn)息痛散具有降低血清尿酸和緩解急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎癥狀的作用[1-2]，主要與降低炎性因子有關(guān)，但對降低血尿酸及篩選炎癥信號通路的靶點(diǎn)研究尚待進(jìn)一步明確。本研究通過關(guān)節(jié)腔注射尿酸鈉晶體及腹腔注射氧嗪酸鉀溶液建立HUA+AGA大鼠模型，觀察息痛散對急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎大鼠的治療作用，并探討其可能的作用機(jī)制。

材料與方法

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動物：清潔級Wistar雄性大鼠60只，12周齡，平均體重(250±20)g。3只大鼠為一籠飼養(yǎng)。飼養(yǎng)溫度(23±2)℃,濕度(55±10)%,每日12 h光照維持,晝夜循環(huán)。各組大鼠均常規(guī)飼養(yǎng)，并自由攝水、進(jìn)食。動物由第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物與試劑：氧嗪酸鉀(批號：2207-75-2)、尿酸鈉(批號：U2875-5G)、秋水仙堿(批號：H20113208)。Caspase-1、TNF-α、NF-κB(p65)抗體(批號：ab74279、ab175315、ab16502)。ELISA試劑盒、TGF-β1(型號：HLE20746)、IL-1β(型號：HLE20024)、IL-10(型號：HLE20095)、Histamin(型號：HLE20597)。息痛散顆粒(由三九藥業(yè)提供中藥免煎顆粒)。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器：酶標(biāo)儀multiskan mk3型(Labsystems dragon公司)、高速冷凍離心機(jī)TGL-16、湘儀DYY-7C型電泳儀、恒溫培養(yǎng)箱DHP-9052型。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 動物分組：將60只Wistar大鼠按體重分層，采用Excel隨機(jī)方法將大鼠分出12只為正常組，其余均復(fù)制模型。將造模成功的大鼠隨機(jī)分為模型組、秋水仙堿組、息痛散低劑量組、息痛散高劑量組，每組12只。所有大鼠均分籠飼養(yǎng)，每籠6只，自由攝食、飲水，并定期清潔、消毒。

2.2 藥物配制方法：將3 g氧嗪酸鉀晶體溶于97 ml生理鹽水中配成3%氧嗪酸鉀溶液；1250 mg尿酸鈉結(jié)晶加45 ml生理鹽水中，再加5 ml吐溫80，配成25 mg/ml的尿酸鈉溶液50 ml，0.22 μm密理博除菌濾器過濾除菌。

2.3 模型建立：按1 ml/100 g的劑量將3%的氧嗪酸鉀進(jìn)行大鼠腹腔注射，2次/d，連續(xù)注射7 d，構(gòu)建HUA模型。第4天采用2%的戊巴比妥鈉將大鼠麻醉，從右側(cè)踝關(guān)節(jié)背側(cè)按30°～45°方向插入脛骨肌腱內(nèi)側(cè)，將0.2 ml的尿酸鈉溶液注射入關(guān)節(jié)腔內(nèi)，誘導(dǎo)AGA模型，如關(guān)節(jié)有明顯腫脹，即表明模型復(fù)制成功[3-4]。

2.4 給藥方法：給藥劑量根據(jù)“人與動物體表面積換算的等效劑量” 進(jìn)行換算[5]，秋水仙堿組、息痛散高劑量組和息痛散低劑量組的用藥劑量分別為0.3 mg/(kg·d)、72 g/(kg·d)和18 g/(kg·d)，正常組及模型組給予等體積生理鹽水。構(gòu)建AGA模型24 h后給藥， 2次/d，連用10 d均為灌胃治療。

2.5 大鼠足跖腫脹度的測定：以上各組于治療前、治療后4、12、24、48 h測定各組鼠足容積[5]。足跖腫脹率=(給藥后足容積-給藥前足容積)/給藥前足容積×100%。

2.6 標(biāo)本留?。褐委煹?天各組均取6只大鼠，末次給藥2 h后，按0.3 ml/100 g劑量腹腔注射10%水合氯醛溶液，大鼠麻醉后，腹主動脈取血，4000 r/min，離心10 min，分離血清，檢測血清尿酸及血清中TGF-β1、IL-1β、IL-10、Histamin含量。取右踝關(guān)節(jié)，留拍關(guān)節(jié)大體圖片、關(guān)節(jié)腔內(nèi)圖片、關(guān)節(jié)面圖片。關(guān)節(jié)組織獲取后取一部分放置于4%多聚甲醛溶液固定后行HE染色；另一部分將滑膜組織切成小塊放于EP管，迅速投入液氮中，用于Western blot檢測。剩余每組6只大鼠于治療10 d后，同上處理。

2.7 Western blot檢測:取一定量凍存滑膜組織，加入400 μl PMSF的RIPA蛋白裂解液于冰上勻漿制備樣品，10% SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白；PVDF膜轉(zhuǎn)膜約90 min。用TBST配制5%脫脂奶粉，將膜浸入后，室溫放置1 h。一抗孵育：將封閉液按照1∶500稀釋；二抗孵育：用封閉液按照1∶3000稀釋HRP標(biāo)記二抗,孵育2 h。用ECL試劑盒反應(yīng),X光片壓片、顯影、定影,并用Lab Works軟件對圖像進(jìn)行灰度分析。

2.8 大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜組織的病理形態(tài)學(xué)變化:用4%多聚甲醛溶液固定滑膜組織，分別進(jìn)行脫鈣和脫水后石蠟包埋，切片后行HE染色，于顯微鏡下觀察大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜組織的病理形態(tài)學(xué)變化。

結(jié) 果

1 各組大鼠足跖腫脹率比較 給藥后4 h，各組足跖腫脹率均升高，與正常組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。秋水仙堿組足跖腫脹率減輕，與模型組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，息痛散低劑量與高劑量組均有所降低，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。給藥后12 h，各組足跖腫脹率升高，與正常組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；與模型組比較，秋水仙堿組和息痛散高劑量組足跖腫脹率均減輕，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。給藥后24 h，各組足跖腫脹率均高，與正常組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；與模型組比較，各給藥組足跖腫脹率減輕，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。給藥后48 h，與正常組比較，各組關(guān)節(jié)腫脹度均高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；與模型組比較，各治療組足跖腫脹率均低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。綜上說明，各給藥組均可減輕HUA+AGA大鼠模型的關(guān)節(jié)腫脹度，秋水仙堿約從4 h開始起效，息痛散組約12 h開始起效。見表1。

表1 各組大鼠足跖腫脹率比較(%)

2 各組大鼠血尿酸水平比較 治療5 d后，與正常組UA(98.20±15.20)μmol/L比較，模型組尿酸(Uric acid,UA)(287.56±35.23)μmol/L、秋水仙堿組UA(265.37±31.02)μmol/L、息痛散低劑量組UA(258.87±36.42)μmol/L、息痛散高劑量組UA(248.12±25.87)μmol/L均高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。說明采用腹腔注射氧嗪酸鉀方法可以成功構(gòu)建HUA模型。各藥物治療組中血清UA與模型組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

3 各組大鼠血清TGF-β1、IL-1β、IL-10、Histamin含量比較 與正常組相比，模型組和各藥物治療組大鼠血清中TGF-β1、IL-1β、IL-10、Histamin含量均有差異，具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。治療5 d和10 d時秋水仙堿組血清中TGF-β1、IL-1β、IL-10、Histamin含量與模型組比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。治療5 d時息痛散高劑量組與模型組比較，各項(xiàng)指標(biāo)均有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)，而息痛散低劑量組的IL-1β、Histamin含量與模型組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。治療10 d時，息痛散低劑量組IL-1β、IL-10與模型組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 各組大鼠血清TGF-β1、IL-1β、IL-10、Histamin水平比較(ng/ml)

4 各組大鼠滑膜組織內(nèi)Caspase-1、TNF-α、NF-κB(p65)表達(dá)比較 通過Western blot檢測，治療5 d后各藥物治療組大鼠滑膜組織內(nèi)Caspase-1、TNF-α、NF-κB(p65)含量與模型組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。治療10 d后，秋水仙堿組和息痛散高劑量組Caspase-1、TNF-α和NF-κB(p65)蛋白表達(dá)與模型組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，而息痛散低劑量組，各指標(biāo)差異，無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表3(圖1)。

表3 各組大鼠滑膜組織內(nèi)Caspase-1、TNF-α和NF-κB(p65)蛋白表達(dá)比較

A：模型組；B：息痛散低劑量組；C：息痛散高劑量組；D：秋水仙堿組

5 各組大鼠關(guān)節(jié)滑膜組織病理形態(tài)學(xué)情況 通過HE染色觀察到，治療10 d時模型組大鼠滑膜組織即出現(xiàn)炎性病變，關(guān)節(jié)腔積液顯著增多，滑膜組織充血、水腫，可見大量的淋巴和單核細(xì)胞浸潤，關(guān)節(jié)軟骨表面光滑，未見明顯顆粒；與模型組相較，秋水仙堿組及息痛散高劑量組關(guān)節(jié)腔積液明顯減少，滑膜組織輕度充血、水腫，可見少許炎性細(xì)胞浸潤；息痛散低劑量組與模型組比較，區(qū)分度不顯著(圖2)。

A：模型組；B：秋水仙堿組；C：息痛散低劑量組；D：息痛散高劑量組

討 論

痛風(fēng)是長期嘌呤代謝障礙、血尿酸增高導(dǎo)致單鈉尿酸鹽沉積于骨關(guān)節(jié)，引發(fā)的急、慢性炎癥和組織損傷[6]。目前，研究認(rèn)為急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎主要與TLR4/NF-κB的炎性信號通路有關(guān)。NF-κB是一種DNA結(jié)合蛋白因子，參與不同促炎分子和不同酶的轉(zhuǎn)錄，如細(xì)胞因子、趨化因子、細(xì)胞黏附等。當(dāng)MSU沉積于細(xì)胞外時，與細(xì)胞膜上的Toll樣受體結(jié)合，活化NF-κB，進(jìn)一步激活NLRP3炎癥小體，誘導(dǎo)pro-Caspase-1自我剪切為活化的Caspase-1，進(jìn)而活化IL-1β、IL-18，激活下游的一系列炎癥反應(yīng)[7-8]。IL-10是一種抑制軟骨分解的細(xì)胞因子[9]，可直接抑制破壞軟骨的IL-1和TNF-α等炎性因子的合成。

中醫(yī)學(xué)將本病納入“骨痹、痹證、筋痹、歷節(jié)風(fēng)、白虎歷節(jié)”等范疇，主要因先天脾腎不足，或七情損傷、或飲食不當(dāng)、或關(guān)節(jié)外傷，致痰濁內(nèi)聚，或加之外感邪氣，形成熱毒、痰濁、瘀血滯留肢體筋脈關(guān)節(jié)，形成紅、腫；焮熱及劇痛[10-11]。息痛散由石膏、忍冬藤、黃柏、蒼術(shù)、牛膝、桃仁、全蝎等組成。方中生石膏，辛甘性寒，清透肌膚骨節(jié)郁熱；忍冬藤清熱解毒、宣泄風(fēng)熱，兩藥共為君藥；蒼術(shù)燥濕健脾，黃柏清熱燥濕，合為臣藥；桃仁、全蝎活血化瘀、通絡(luò)止痛；川牛膝祛風(fēng)除濕、疏經(jīng)通絡(luò)，且引藥下行，使諸藥直達(dá)病所。全方共奏清熱瀉火、祛瘀通絡(luò)、燥濕化痰之功。

近年來，中藥復(fù)方治療AGA研究比較多，證實(shí)清熱祛濕、通絡(luò)止痛的中藥復(fù)方具有消炎止痛的作用，可以改善患者的關(guān)節(jié)疼痛等癥狀[12]，但目前大部分研究僅停留在藥效學(xué)方面，缺乏深入的機(jī)制研究[13-14]。本研究發(fā)現(xiàn)息痛散可以減輕HUA+AGA大鼠模型關(guān)節(jié)腫脹度，改善滑膜組織的炎性反應(yīng)，調(diào)節(jié)血清中TGF-β1、IL-1β、IL-10、Histamin水平，降低踝關(guān)節(jié)滑膜組織中Caspase-1、TNF-α、NF-κB蛋白的表達(dá)，其作用機(jī)制可能與TLR4/NF-κB信號通路抑制NLRP3炎性體激活有關(guān)。高尿酸血癥是導(dǎo)致AGA的主要因素，故本研究采用的是高尿酸血癥+急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎模型，更符合人類急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的發(fā)病機(jī)制，但可能由于采用的是急性炎癥期模型，故對關(guān)節(jié)軟骨暫未形成明顯破壞，需要日后進(jìn)一步完善。