我國(guó)豬瘟疫苗研究與應(yīng)用進(jìn)展

李 嬌，祖立闖，王文秀，謝金文，沈志強(qiáng)，

（1.山東綠都生物科技有限公司，山東 濱州 256600；2.山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院，濱州 256600）

豬瘟（Classical swine fever,CSF）是由豬瘟病毒（Classical swine fever virus,CSFV）引起豬的一種高度接觸性、致死性的傳染病，長(zhǎng)期以來(lái)我國(guó)通過(guò)采取以疫苗免疫接種為主，結(jié)合抗體監(jiān)測(cè)、生物安全等綜合性防控措施有效防止了豬瘟的大規(guī)模暴發(fā)和流行[1-2]。隨著全球范圍內(nèi)豬瘟凈化工作的不斷開(kāi)展，部分歐洲和美洲國(guó)家已經(jīng)徹底消滅了豬瘟，這對(duì)我國(guó)凈化豬瘟具有重要的借鑒和指導(dǎo)意義。目前，我國(guó)商品化的豬瘟疫苗主要是基于中國(guó)豬瘟兔化弱毒株（C株）的系列弱毒疫苗，但該類(lèi)疫苗均無(wú)法區(qū)分自然感染豬和疫苗接種豬，這種技術(shù)上的不足在很大程度上限制了我國(guó)豬瘟凈化工作的開(kāi)展，已經(jīng)無(wú)法滿足我國(guó)豬瘟凈化的需要[3]。研制新型、安全、高效和能夠區(qū)分疫苗免疫接種動(dòng)物和野毒感染動(dòng)物的新型標(biāo)記疫苗逐步成為豬瘟防控領(lǐng)域的研究重點(diǎn)，且我國(guó)研究學(xué)者在豬瘟新型標(biāo)記疫苗研究領(lǐng)域已經(jīng)取得了一些重要進(jìn)展。本文綜述了我國(guó)豬瘟滅活疫苗、弱毒疫苗等常規(guī)商品化疫苗的應(yīng)用現(xiàn)狀以及亞單位疫苗、核酸疫苗、活載體疫苗、合成肽疫苗、全長(zhǎng)感染性cDNA標(biāo)記疫苗等新型疫苗方面的研究進(jìn)展，為新形勢(shì)下進(jìn)一步開(kāi)展豬瘟疫苗的研發(fā)提供借鑒與參考，對(duì)我國(guó)豬瘟的綜合防控具有一定的參考價(jià)值。

1 商品化疫苗

1.1 傳統(tǒng)滅活疫苗

自豬瘟病毒流行以來(lái)，人們就一直嘗試采用各種免疫方法對(duì)其進(jìn)行預(yù)防和控制。最開(kāi)始使用高免血清來(lái)免疫豬群，但存在高免血清獲得困難并且存在較大散毒風(fēng)險(xiǎn)等缺點(diǎn)。隨后，研究學(xué)者陸續(xù)開(kāi)展滅活疫苗研究，其中以結(jié)晶紫滅活疫苗的推廣應(yīng)用最為廣泛，在當(dāng)時(shí)歷史條件下為全球范圍內(nèi)豬瘟的防控做出了不可估量的貢獻(xiàn)。滅活疫苗雖然安全，但利用組織培養(yǎng)的病毒效價(jià)較低，疫苗保護(hù)力不足，防治效果有限，限制了該類(lèi)疫苗的發(fā)展。隨著現(xiàn)代生物技術(shù)和生物制品產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展，這些初級(jí)豬瘟疫苗現(xiàn)已退出了市場(chǎng)。

1.2 弱毒疫苗

我國(guó)研究學(xué)者在20世紀(jì)50年代將豬瘟強(qiáng)毒在兔體內(nèi)進(jìn)行連續(xù)傳代后獲得豬瘟病毒兔化弱毒疫苗（HCLV）又稱“C株”，該弱毒疫苗株具有安全、免疫保護(hù)力好、能夠針對(duì)不同的豬瘟野毒株產(chǎn)生免疫保護(hù)力、遺傳特性十分穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)，于1956年開(kāi)始推廣使用，對(duì)世界范圍內(nèi)預(yù)防和控制豬瘟流行發(fā)揮了重要作用。弱毒疫苗可同時(shí)誘導(dǎo)較強(qiáng)的細(xì)胞免疫反應(yīng)和體液免疫反應(yīng)，產(chǎn)生良好的免疫保護(hù)效果，與滅活疫苗相比具有使用劑量小、免疫原性好、不需佐劑、產(chǎn)生免疫快、抗體持久、成本低、使用方便等優(yōu)點(diǎn)。目前我國(guó)使用的商品化弱毒疫苗有兔源脾淋源豬瘟活疫苗、細(xì)胞源豬瘟活疫苗、傳代細(xì)胞源豬瘟活疫苗、豬瘟-豬丹毒-豬多殺性巴氏桿菌病三聯(lián)活疫苗、豬瘟-高致病性豬繁殖與呼吸綜合征二聯(lián)活疫苗。

1.2.1 兔源脾淋源豬瘟活疫苗 該類(lèi)疫苗是通過(guò)將豬瘟兔化弱毒株接種成年家兔，挑選感染定型熱的家兔，經(jīng)無(wú)菌采集其脾臟和淋巴結(jié)進(jìn)行碾磨、冷凍干燥制備而成，其優(yōu)點(diǎn)是免疫原性強(qiáng)，接種后免疫效果好，抗體產(chǎn)生速度快，持續(xù)時(shí)間較長(zhǎng)，同時(shí)該疫苗中含有某些免疫相關(guān)因子，能起免疫增強(qiáng)劑的作用。其缺點(diǎn)是在生產(chǎn)過(guò)程中需要活體動(dòng)物，疫苗生產(chǎn)的成本較高，也不符合動(dòng)物福利。目前市場(chǎng)上所使用的該類(lèi)疫苗有豬瘟活疫苗（兔源）、政府采購(gòu)專(zhuān)用豬瘟活疫苗（脾淋源）、豬瘟耐熱保護(hù)劑活疫苗（兔源）。其中耐熱保護(hù)劑類(lèi)疫苗解決了常規(guī)弱毒疫苗對(duì)保存和運(yùn)輸條件要求高，不利于長(zhǎng)途運(yùn)輸?shù)热秉c(diǎn)，該疫苗可以長(zhǎng)時(shí)間在4℃的環(huán)境中保存和運(yùn)輸，極大地方便了疫苗產(chǎn)品的推廣與應(yīng)用，降低了產(chǎn)品質(zhì)量因保存條件不佳而失效的幾率，從而保障產(chǎn)品質(zhì)量更加穩(wěn)定。

1.2.2 細(xì)胞源豬瘟活疫苗 該類(lèi)疫苗是通過(guò)將豬瘟兔化弱毒株接種于犢牛睪丸細(xì)胞中進(jìn)行培養(yǎng)，收獲細(xì)胞培養(yǎng)物，冷凍干燥后制成，目前市場(chǎng)上所使用的該類(lèi)疫苗有豬瘟活疫苗（細(xì)胞源）、政府采購(gòu)專(zhuān)用豬瘟活疫苗（細(xì)胞源）、豬瘟耐熱保護(hù)劑活疫苗（細(xì)胞源）。該類(lèi)疫苗具有生產(chǎn)成本低、生產(chǎn)量大，生產(chǎn)過(guò)程容易監(jiān)控等優(yōu)點(diǎn)，但該類(lèi)疫苗生產(chǎn)時(shí)需要使用異源原代細(xì)胞培養(yǎng)，產(chǎn)品批間差異較大，且存在牛病毒性腹瀉病毒（BVDV）污染的威脅。

1.2.3 傳代細(xì)胞源豬瘟活疫苗 該類(lèi)疫苗是通過(guò)將豬瘟弱毒株接種于豬睪丸傳代細(xì)胞（ST細(xì)胞）中進(jìn)行培養(yǎng)，將細(xì)胞培養(yǎng)物冷凍干燥而成，目前市場(chǎng)上所使用的該類(lèi)疫苗有豬瘟活疫苗（傳代細(xì)胞源）。該類(lèi)疫苗是使用ST傳代細(xì)胞系進(jìn)行培養(yǎng)，在生產(chǎn)過(guò)程中其批量間差異較小，穩(wěn)定性較好，可以連續(xù)大批量生產(chǎn)，生產(chǎn)過(guò)程容易監(jiān)控，且避免了BVDV的干擾，更重要的是該類(lèi)疫苗能保證接種豬只在母源抗體的干擾下仍能獲得較理想的抗體水平，是目前豬瘟弱毒疫苗中最先進(jìn)、使用最廣泛的疫苗。

1.2.4 豬瘟-豬丹毒-豬多殺性巴氏桿菌病三聯(lián)活疫苗 該類(lèi)疫苗是通過(guò)將豬瘟兔化弱毒株接種乳兔或易感細(xì)胞，收獲含毒乳兔組織或細(xì)胞培養(yǎng)病毒液，以適當(dāng)比例和豬丹毒桿菌弱毒菌液、豬源多殺性巴氏桿菌弱毒菌液混合，經(jīng)冷凍干燥制成，可同時(shí)用于預(yù)防豬瘟、豬丹毒、豬多殺性巴氏桿菌病。由于一般豬瘟疫苗在生產(chǎn)過(guò)程中含有雙抗，而雙抗對(duì)豬丹毒桿菌和豬肺疫桿菌具有明顯的抑制作用，因此配置三聯(lián)苗必須應(yīng)用不含雙抗的豬瘟乳兔組織或細(xì)胞培養(yǎng)物，對(duì)豬瘟疫苗的生產(chǎn)工藝提出了更高要求。

1.2.5 豬瘟-高致病性豬繁殖與呼吸綜合征二聯(lián)活疫苗 目前我國(guó)市場(chǎng)上商品化的該類(lèi)疫苗只有高致病性豬繁殖與呼吸綜合征、豬瘟二聯(lián)活疫苗（TJMF92株+C株），該疫苗是通過(guò)將高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒TJM-F92弱毒株與豬瘟病毒兔化弱毒C株分別接種Marc145細(xì)胞和牛睪丸（BT）傳代細(xì)胞培養(yǎng)，收獲細(xì)胞培養(yǎng)物后按適當(dāng)比例混合，加耐熱保護(hù)劑，經(jīng)冷凍真空干燥制成。該疫苗使用耐熱保護(hù)劑，可在2～8℃保存18個(gè)月，“兩病同防”，一針解決豬瘟、高致病性豬繁殖與呼吸綜合征兩大豬病，簡(jiǎn)化免疫程序，減少對(duì)仔豬的應(yīng)激，降低人力成本。同時(shí)，該二聯(lián)疫苗在豬瘟疫苗效力檢驗(yàn)方面，采用免疫熒光定量技術(shù)（FAID50）替代了傳統(tǒng)豬瘟弱毒疫苗一直沿用的兔定型熱效力檢驗(yàn)方法（該效檢方法是通過(guò)兔子體溫變化間接定量豬瘟疫苗病毒含量的方法，由于我國(guó)并沒(méi)有檢驗(yàn)用兔標(biāo)準(zhǔn)，導(dǎo)致各批次疫苗的批間抗原量差異大，免疫效果也極不穩(wěn)定）。FAID50應(yīng)用免疫熒光方法對(duì)病毒半數(shù)組織感染量進(jìn)行測(cè)定，即把豬瘟疫苗按不同的稀釋度接種到傳代細(xì)胞上增殖，通過(guò)熒光色素標(biāo)記抗體與細(xì)胞表面及細(xì)胞漿內(nèi)的豬瘟抗原結(jié)合后，置熒光顯微鏡下觀察，細(xì)胞漿中出現(xiàn)特異性熒光即判斷有一定量的病毒復(fù)制，實(shí)現(xiàn)了在細(xì)胞水平對(duì)豬瘟病毒進(jìn)行更準(zhǔn)確的定量，為保持產(chǎn)品穩(wěn)定、減少產(chǎn)品批間差提供了保障。

1.3 亞單位疫苗

亞單位疫苗是將病原體保護(hù)性抗原基因?qū)氲绞荏w細(xì)胞或細(xì)菌中，使抗原蛋白獲得高效表達(dá)，并將表達(dá)的蛋白與佐劑聯(lián)合制成的疫苗。亞單位疫苗與常規(guī)滅活疫苗相比，安全性更好，但免疫原性略差，需要和佐劑同時(shí)使用才能達(dá)到免疫效果。由于豬瘟病毒E2蛋白是豬瘟病毒的主要保護(hù)性抗原，能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體，使E2蛋白成為是豬瘟亞單位疫苗研究的首選蛋白。目前我國(guó)市場(chǎng)上商品化的該類(lèi)疫苗只有豬瘟病毒E2蛋白重組桿狀病毒滅活疫苗（Rb-03株），該疫苗是將豬瘟病毒E2蛋白重組于桿狀病毒內(nèi)，在昆蟲(chóng)細(xì)胞上培養(yǎng)表達(dá)豬瘟病毒E2蛋白而制成的新型基因工程疫苗。由于該疫苗不是全病毒疫苗，而是一種僅含有豬瘟E2抗原蛋白的標(biāo)記疫苗，不存在全病毒弱毒疫苗基因突變或毒力返強(qiáng)的危險(xiǎn)，具有良好的安全性，同時(shí)該疫苗只誘導(dǎo)豬體產(chǎn)生E2蛋白抗體，因此可以通過(guò)對(duì)E2蛋白和非E2蛋白的抗體檢測(cè)來(lái)區(qū)分豬只是感染了野毒還是免疫了疫苗，彌補(bǔ)了豬瘟兔化弱毒疫苗不能區(qū)分野毒感染與疫苗免疫動(dòng)物的缺陷，為我國(guó)豬瘟的凈化提供了技術(shù)支持，將有力推動(dòng)我國(guó)豬瘟防控從預(yù)防控制向免疫凈化階段的邁進(jìn)。

2 新型疫苗研究

2.1 核酸疫苗

核酸疫苗又稱DNA疫苗或基因疫苗，是將含有病原體結(jié)構(gòu)蛋白的真核表達(dá)載體作為疫苗直接進(jìn)行免疫，使機(jī)體產(chǎn)生特異性免疫應(yīng)答的一類(lèi)基因疫苗，其能夠同時(shí)誘導(dǎo)細(xì)胞免疫和體液免疫，可產(chǎn)生持久性的免疫應(yīng)答反應(yīng)，具有易于生產(chǎn)、方便保存運(yùn)輸、可誘導(dǎo)機(jī)體長(zhǎng)期或終身免疫、可制備針對(duì)多種病原體的多價(jià)疫苗等優(yōu)點(diǎn)。郭抗抗等[4]將豬瘟病毒E2基因定向克隆至表達(dá)載體pSCA1中，構(gòu)建DNA疫苗重組質(zhì)粒pSCA1-E2，將純化的pSCA1-E2質(zhì)粒分別免疫小鼠和試驗(yàn)豬，二免后分別檢測(cè)小鼠脾淋巴細(xì)胞刺激指數(shù)和豬血清抗豬瘟特異性抗體水平，免疫小鼠產(chǎn)生較高水平的淋巴細(xì)胞刺激指數(shù)，免疫豬可檢測(cè)到抗豬瘟特異性血清抗體，為進(jìn)一步研制新型豬瘟核酸疫苗提供了基礎(chǔ)材料。

2.2 活載體重組疫苗

重組活載體疫苗是將病原體的保護(hù)性抗原基因與其他具有復(fù)制功能的其他載體病毒進(jìn)行重組，該類(lèi)重組疫苗可通過(guò)多種途徑進(jìn)行免疫，可以誘導(dǎo)動(dòng)物機(jī)體產(chǎn)生體液免疫和細(xì)胞免疫，目前豬瘟E2蛋白基因已經(jīng)在痘病毒、腺病毒、偽狂犬病病毒等不同的病毒載體中獲得表達(dá)，在臨床試驗(yàn)中顯示出巨大的潛在應(yīng)用價(jià)值。

2.2.1 痘病毒活載體疫苗 痘病毒以其宿主特異性、外源基因容量大、在哺乳動(dòng)物中發(fā)生頓挫感染等特性成為構(gòu)建動(dòng)物病毒活載體疫苗的首選載體之一，李譜華等[5]將豬瘟病毒E2蛋白基因片段定向克隆到重組雞痘病毒表達(dá)載體FPV-P11上，將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至雞痘病毒感染的雞胚成纖維細(xì)胞后篩選出重組雞痘病毒FV282-CSFV-E2，將該重組雞痘病毒3次腹腔接種小鼠，ELISA檢測(cè)血清中豬瘟病毒抗體滴度為1∶4 096，將該重組雞痘病毒頸部和腹股溝皮下分點(diǎn)注射免疫豬3次，4周后用豬瘟病毒石門(mén)強(qiáng)毒株以100 LD50接毒量攻擊，保護(hù)率達(dá)75%，為豬瘟重組雞痘病毒活載體疫苗的研制奠定了基礎(chǔ)。

2.2.2 腺病毒活載體疫苗 腺病毒具有基因轉(zhuǎn)移效率高、毒力低、宿主范圍廣、外源基因裝載容量大等優(yōu)點(diǎn)，能夠在體內(nèi)表達(dá)天然的、保持完整生物活性的抗原蛋白并誘導(dǎo)特異性體液免疫應(yīng)答和細(xì)胞免疫應(yīng)答，是一種良好的活病毒載體。楊玉艾等[6]將豬瘟病毒E0和E2基因定向亞克隆于穿梭載體pAdTrack-CMV中構(gòu)建攜帶E0-E2基因的重組腺病毒轉(zhuǎn)移載體質(zhì)粒pAdEasy-E0-E2，將其轉(zhuǎn)染人胚胎腎細(xì)胞成功包裝出重組腺病毒rAd-E0-E2，將rAd-E0-E2經(jīng)肌肉2次免疫接種6～7周齡豬，3周后用103TCID50的豬瘟野毒株（石門(mén)株）攻擊，rAd-E0-E2免疫組豬存活率達(dá)85.71%，而非重組E0-E2基因的腺病毒免疫組和空白對(duì)照組全部死亡，表明rAd-E0-E2能使免疫豬抵抗豬瘟強(qiáng)毒攻擊，為豬瘟腺病毒重組活載體疫苗的研究開(kāi)發(fā)奠定了基礎(chǔ)。

2.2.3 偽狂犬病病毒活載體疫苗 偽狂犬?。≒seudorabies,PR）是由偽狂犬病病毒（Pseudorabies virus,PRV）引起豬的以仔豬的高死亡率、母豬的繁殖障礙、公豬種用性能降低或喪失、肥豬的神經(jīng)及呼吸系統(tǒng)癥狀為主要特征的急性傳染病，PRV基因組編碼70～100種蛋白，其中含有大量與病毒增殖無(wú)關(guān)的非必需區(qū)可供外源基因的插入，是優(yōu)良的活病毒載體。韓爽等[7]以 TK、gI、gE、US9、部分gN基因缺失的PRV-BE為親本株，通過(guò)同源重組構(gòu)建了表達(dá)豬瘟病毒主要免疫原性基因E2的重組偽狂犬病病毒PRV-CSFV PE2SC，對(duì)重組病毒在PK15細(xì)胞中的遺傳穩(wěn)定性、增殖特性等進(jìn)行的研究表明重組病毒在體外連續(xù)傳20代后仍能穩(wěn)定遺傳，具有良好的遺傳穩(wěn)定性及體外復(fù)制能力，該活載體疫苗可同時(shí)預(yù)防豬瘟和偽狂犬病兩種主要傳染病，為豬瘟和豬偽狂犬病根除計(jì)劃的實(shí)施提供了技術(shù)保障。

2.3 合成肽疫苗

合成肽疫苗是指根據(jù)病原體基因組核苷酸序列推導(dǎo)出其蛋白質(zhì)的氨基酸序列，通過(guò)人工合成的方式制備相應(yīng)的氨基酸寡肽，偶聯(lián)佐劑制成疫苗。Zhou等[8]合成了豬瘟E2蛋白的兩個(gè)B細(xì)胞線性表位RE2-A和RE2-B，獲得了豬瘟多表位疫苗，將該疫苗兩次免疫動(dòng)物后可產(chǎn)生中和抗體。Tian等[9]構(gòu)建了串聯(lián)多個(gè)豬瘟E2抗原表位的多肽疫苗，攻毒試驗(yàn)顯示多肽疫苗可保護(hù)免疫豬抵抗豬瘟病毒野毒株的攻擊。合成肽疫苗能根據(jù)病毒變異情況快速開(kāi)發(fā)出有效的針對(duì)性疫苗，具有極高的開(kāi)發(fā)前景，但合成肽疫苗由人工合成制得，單一的線性抗原表位對(duì)病毒的保護(hù)力有限，多個(gè)中和表位串聯(lián)和添加合適的佐劑是目前增強(qiáng)合成肽疫苗免疫原性的有效手段，而對(duì)豬瘟病毒抗原表位和空間構(gòu)像的深入研究是開(kāi)發(fā)合成肽疫苗的關(guān)鍵。

2.4 全長(zhǎng)感染性cDNA標(biāo)記疫苗

全長(zhǎng)感染性cDNA標(biāo)記疫苗是利用反向遺傳學(xué)技術(shù)將具有標(biāo)記性的基因替換或克隆到致弱病毒全長(zhǎng)cDNA中獲得重組病毒，是利用標(biāo)記基因區(qū)分疫苗株和野毒株的一類(lèi)疫苗。隨著反向遺傳學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展和在動(dòng)物病毒學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用，豬瘟全長(zhǎng)感染性cDNA標(biāo)記疫苗得到了研究學(xué)者的廣泛關(guān)注，其將標(biāo)記性基因克隆到豬瘟病毒弱毒cDNA中，從而使疫苗具有區(qū)分野毒感染和疫苗免疫的優(yōu)勢(shì)，是亟需大力發(fā)展的一種新型豬瘟疫苗。鄒興啟等[10]以豬瘟病毒C株為研究材料，經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增獲得涵蓋全長(zhǎng)的6個(gè)片段，用合適的酶切位點(diǎn)連接，成功構(gòu)建了C株全長(zhǎng)感染性克隆pAC-CS，體外轉(zhuǎn)錄得到RNA，然后將其分別轉(zhuǎn)染BHK-21和SK6細(xì)胞，通過(guò)RT-PCR、免疫過(guò)氧化酶單層細(xì)胞試驗(yàn)和兔體發(fā)熱試驗(yàn)檢測(cè)表明成功構(gòu)建了豬瘟病毒C株感染性克隆，為新型豬瘟cDNA標(biāo)記疫苗的研發(fā)提供了試驗(yàn)依據(jù)。

3 小結(jié)與展望

自2007年起，我國(guó)采取了以強(qiáng)制免疫為主的豬瘟綜合防控策略，在實(shí)施了近10年的強(qiáng)制免疫政策后，2017年國(guó)家取消了豬瘟強(qiáng)制免疫政策，改為對(duì)符合條件的養(yǎng)殖場(chǎng)實(shí)行“先打后補(bǔ)”的財(cái)政補(bǔ)助政策，表明我國(guó)豬瘟防控工作取得了階段性成果，豬瘟防控進(jìn)入了新的歷史階段，距離實(shí)現(xiàn)豬瘟防控的終極目標(biāo)（凈化）已經(jīng)不遠(yuǎn)。無(wú)需置疑的是，傳統(tǒng)疫苗在我國(guó)防控豬瘟中發(fā)揮了不可替代的巨大作用，但其無(wú)法區(qū)分野毒感染和疫苗免疫動(dòng)物的缺陷已經(jīng)不能完全滿足以后國(guó)家豬瘟凈化工作的需要。與傳統(tǒng)疫苗相比，新型疫苗能夠區(qū)分野毒感染和疫苗免疫，且具有廉價(jià)、安全、高效、易于運(yùn)輸與保存等優(yōu)點(diǎn)，其在豬瘟防控中將發(fā)揮越來(lái)越重要的作用，實(shí)現(xiàn)理想的免疫效果，但當(dāng)前我國(guó)在新型疫苗中只有亞單位疫苗實(shí)現(xiàn)了商品化，其它的新型疫苗尚處于研究階段，相信隨著基因工程技術(shù)的不斷發(fā)展以及豬瘟免疫機(jī)制研究的不斷深入，豬瘟的各類(lèi)新型疫苗將會(huì)逐步得到完善，為我國(guó)豬瘟的綜合防控和凈化提供技術(shù)保障。