大孔吸附樹脂純化鐵莧菜總黃酮的工藝研究

楊艷俊，吉惠杰，李成成

（吉林化工學院 化學與制藥工程學院，吉林 吉林 132022）

0 引言

鐵莧菜（A.australis）是大戟科鐵莧菜屬的一年生草本植物.鐵莧菜生于曠野、路邊等較濕潤的地方，廣泛分布于黃河流域中下游及長江以南各地[1]，又名人莧、血見愁、海蚌含珠、撮斗裝珍珠、葉里含珠、野麻草等[2]，為大戟科植物鐵莧菜全草，味苦澀性平[3]，具有清熱解毒、消積、止痢和止血的功效，可用于治療痢疾、吐血、便血、崩漏、創(chuàng)傷出血等[4].鐵覓菜可以顯著改善腹瀉、便血、體質(zhì)量減輕、結(jié)腸腸膜潰瘍糜爛、充血水腫等癥狀，對于潰瘍性結(jié)腸炎具有療效[5]，不同的提取液的抗菌效果也不盡相同[6-7]，并且具有抗氧化作用[8].鐵莧菜有明顯的袪痰止咳作用[9]，并且具有促進心肌組織的正?；墓δ躘10].鐵莧菜的化學成分包括黃酮類化合物[11-12]、沒食子酸[13]、谷甾醇等甾醇類化合物[14]和多種揮發(fā)性成分[15].其中黃酮類化合物有蘆丁[4]、白楊素、高良姜黃素、山萘酚苷[16]，黃酮類化合物具有多種生物活性，如抗氧化、抗炎、抗微生物、抗腫瘤等作用[17].

近年來，大孔吸附樹脂被廣泛應用于醫(yī)藥、環(huán)保和食品等領(lǐng)域，在中草藥研究方面也被廣泛應用.本試驗通過幾種不同極性的大孔吸附樹脂純化鐵莧菜總黃酮，篩選適合應用的樹脂，并且對純化工藝進行研究.鐵莧菜這一寶貴資源的高效利用，對促進優(yōu)勢資源轉(zhuǎn)化有著重要的意義.

1 材料與方法

1.1 材料

鐵莧菜購于河北安國市冷背藥材有限公司；蘆丁為自制，含量≥96%；無水乙醇、鹽酸、氫氧化鈉、亞硝酸鈉、硝酸鋁等均為分析純；AB-8、HPD-100、D-101、DM-301、DM130 由天津市海光化工有限公司生產(chǎn).

1.2 儀器與設備

RT-08 粉碎機：榮聰精密科技有限公司；KQ-250B 超聲儀：昆山市超聲儀器有限公司；TU-1810紫外可見分光光度計：上海精密科學儀器有限公司.

1.3 試驗方法

1.3.1 對照品溶液的配制

精確稱取干燥至恒質(zhì)量的蘆丁10 mg，加入60%的乙醇適量，超聲處理使之溶解，用60%的乙醇定容至100 mL，配制成濃度為0.1 mg/mL 的蘆丁溶液，備用.

1.3.2 供試品溶液的制備

將鐵莧菜用粉碎機粉碎，過40 目篩，取50 g，分別加入15 倍生藥量的80%乙醇，85 ℃加熱微沸回流提取2 次，時間為每次5 h，合并提取液，過濾，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至無醇味，即得鐵莧菜提取液，備用.

1.3.3 供試品最大吸收波長的測定

取上述供試品溶液1 mL 于25 mL 容量瓶中，加入5%的NaNO2溶液0.8 mL，搖勻，放置6 min，加入10% 的Al（NO3）3溶液0.8 mL，放置6 min 后再加入1 mol/L 的NaOH 溶液10 mL，搖勻顯色，定容，用紫外可見分光光度計測得最大吸收波長為500 nm.

1.3.4 線性關(guān)系考察

精確稱取0.1 mg/mL 蘆丁標準溶液0.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0、12.0 mL 分置于25 mL 容量瓶中，加入上述顯色劑顯色，定容，以零管為空白.在500 nm 處測定吸光度.以蘆丁濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制標準曲線.求得標準曲線方程為：y=10.832C-0.001 5（C 的單位為mg/mL），R2=0.999 7，蘆丁質(zhì)量濃度在0.000 8～0.004 8 mg/mL范圍內(nèi)與吸光度呈良好的線性關(guān)系.

1.3.5 精密度試驗

取上述8.0 mL 標準品溶液，依照紫外分光光度法在500 nm 處連續(xù)測定6 次，求得吸光度平均值為0.318，RSD 為0.345 1%，結(jié)果表明精密度較好.

2 結(jié)果與分析

2.1 樹脂吸附與解吸能力考察

2.1.1 樹脂靜態(tài)吸附與解吸考察

取處理后的樹脂AB-8、D-101、HPD-100、DM301、DM130 各4 g，加入到100 mL 錐形瓶中，加入40 mL 總黃酮質(zhì)量濃度為1.344 5 mg/mL 的提取液，每5 min 振搖一次，每次10 s，共2 h，靜置48 h，過濾.取樹脂吸附后的藥液2 mL 于25 mL 容量瓶中，加入顯色劑，在500 nm 處測定吸光度A，計算吸附率.將靜態(tài)吸附的樹脂抽濾至干，室溫條件下，加入100 mL 75%乙醇解吸，每5 min振搖1 次，每次10 s，共2 h，靜置48 h，過濾.分別取解吸后的藥液4 mL 于25 mL 容量瓶中，加入顯色劑，在500 nm 處測定吸光度A，計算解吸率.結(jié)果見表1.

表1 鐵莧菜總黃酮的靜態(tài)吸附率與解吸率

從表1 可以看出，5 種樹脂的靜態(tài)吸附率較高的是D-101、HPD-100、DM301，其中解吸率較高的是D-101.考察這3 種樹脂的動態(tài)吸附與解吸效果，選出最適合的樹脂.

2.1.2 樹脂動態(tài)吸附與解吸考察

取處理后的樹脂D-101、HPD-100、DM301，各15 g，濕法加入到樹脂柱中，分別加入150 mL 總黃酮質(zhì)量濃度為1.217 5 mg/mL 的提取液，以2 BV/h的流速進行動態(tài)吸附，收集吸附后的溶液3 mL 于25 mL 容量瓶中，加入顯色劑，定容，在500 nm 處測吸光度.再用250 mL 75%乙醇以2 BV/h 的流速進行解吸，分別收集解吸液4 mL 于25 mL 容量瓶中，加入顯色劑，定容，在500 nm 處測定吸光度.3 種樹脂在相同條件下的動態(tài)吸附與解吸效果，見表2.

表2 鐵莧菜總黃酮的動態(tài)吸附率與解析率

由表2 可以看出，DM301 的吸附與解吸效果較D-101 好，DM301 的吸附率雖然比HPD-100 的低，但解吸率比HPD-100 的高，以黃酮的解析量來看DM301 最高，故選擇DM301 進行樹脂進一步工藝優(yōu)化研究.

2.2 DM301 型大孔吸附樹脂工藝優(yōu)化研究

2.2.1 上樣液質(zhì)量濃度的考察

取DM301 大孔吸附樹脂5 份，各6 g，濕法裝柱，分別加入鐵莧菜總黃酮提取液（總黃酮質(zhì)量濃度為2.924 mg/mL）以及稀釋0、2、4、8、16 倍的樣品溶液（體積分別為22.5、45、90、180、360 mL），先以2 BV/h 的流速進行吸附，分別收集過柱液并記錄體積，然后以75%乙醇各50 mL 以2 BV/h 的流速進行解吸，分別收集洗脫液并記錄體積，在500 nm 處測定吸光度，計算吸附率與解吸率.

表3 上樣液質(zhì)量濃度考察結(jié)果

由表3 可知，隨著上柱藥液質(zhì)量濃度的降低，吸附率逐漸下降，而解吸率逐漸升高，但隨著解吸率的升高，解吸量下降.綜合考慮，選擇質(zhì)量濃度為1.462 mg/mL.

2.2.2 動態(tài)吸附曲線的考察

取DM301 樹脂6 g（9 mL），濕法加入到樹脂柱中，加入適量總黃酮質(zhì)量濃度為1.462 mg/mL 的鐵莧菜提取液，以1 BV/h 的流速進行動態(tài)吸附，收集流出液，開始時每1 BV（9 mL）為一個流份，共5 個，以后每5 mL 為一個流份，選擇不同流份依次顯色，于500 nm 處測定總黃酮含量，以流出液體積為橫坐標，流出液中總黃酮質(zhì)量濃度為縱坐標，作動態(tài)吸附曲線，計算樹脂吸附量，結(jié)果見圖1.

由圖1 可以看出，當?shù)降? 個點時，吸附余液的濃度大于原液濃度的1/10，此時達到了目標物的泄露點，樹脂吸附黃酮量為65.79 mg.

圖1 動態(tài)吸附曲線

2.2.3 吸附速率的考察

取DM301 大孔吸附樹脂，濕法裝柱，加入鐵莧菜總黃酮提取液（總黃酮質(zhì)量濃度為1.462 mg/mL）45 mL，分別以1、2、3、4、5 BV/h 的流速進行吸附，分別收集過柱液并記錄體積，取各樹脂吸附后的藥液于500 nm 處測定吸光度，計算吸附率.然后以75%乙醇各30 mL 以2 BV/h 的流速進行解吸，分別收集洗脫液并記錄體積，于500 nm 處測定吸光度，計算解吸率，結(jié)果見表4.

由表4 可以看出，吸附速率的大小對吸附率沒有太大影響，但解吸率隨著吸附速率的加快而降低，2 BV/h 時解吸率最大，其原因可能是吸附速率的快慢對樹脂吸附是否均勻有影響，吸附速率較快，樹脂吸附較均勻，解吸率較低，綜合考慮吸附速率選2 BV/h 為宜.

表4 吸附速率考察結(jié)果

2.2.4 解吸液質(zhì)量濃度的考察

取DM301 大孔吸附樹脂，濕法裝柱，分別加入鐵莧菜總黃酮提取液（總黃酮質(zhì)量濃度為1.416 mg/mL）45 mL，以2 BV/h 的流速進行吸附后，收集過柱液并記錄體積，分別以30%、50%、75%、95%乙醇各30 mL 以2 BV/h 的流速進行解吸，分別收集洗脫液并記錄體積，于500 nm 處測定吸光度，計算解吸率，結(jié)果見表5.

由表5 可以看出，在其他純化條件相同時，隨著解吸液乙醇濃度的增大，解吸率先增大后減小，所以最佳解吸液乙醇濃度為75%.

表5 解吸液乙醇濃度考察結(jié)果

2.2.5 解吸速率考察

取DM301 大孔吸附樹脂5 份，各6 g，濕法裝柱，分別加入鐵莧菜總黃酮提取液（總黃酮質(zhì)量濃度為1.395 mg/mL）45 mL，以2 BV/h 的流速進行吸附后，分別收集過柱液并記錄體積，分別以75%乙醇各30 mL 以1、2、3、4、5 BV/h 的流速進行解吸，分別收集洗脫液并記錄體積，于500 nm 處測定吸光度，計算解吸率，見表6.

表6 解吸速率考察結(jié)果

2.2.6 洗脫終點考察

取DM301 大孔吸附樹脂1 份6 g，濕法裝柱，分別加入鐵莧菜總黃酮提取液（總黃酮質(zhì)量濃度為1.489 mg/mL）45 mL，以2 BV/h 的流速進行吸附后，收集過柱液并記錄體積，以75%乙醇適量以2 BV/h 的流速進行解吸，分別收集1/3 BV 的洗脫液，于500 nm 處測定吸光度，計算總黃酮含量，結(jié)果見圖2.

由圖2 可以看出，當洗脫液用量到第10 個點時（10/3 BV），洗脫液中總黃酮的質(zhì)量濃度已經(jīng)較低，當洗脫液用量到第12 個點時（4 BV）時，已經(jīng)基本將總黃酮洗脫完全，為避免造成資源浪費，選擇洗脫液用量為10/3 BV（30 mL）.

圖2 洗脫終點曲線

2.2.7 上柱液pH 考察

取DM301 大孔吸附樹脂7 份，各6 g，濕法裝柱，分別加入鐵莧菜提取液（總黃酮質(zhì)量濃度為1.489 mg/mL）45 mL，分別將pH 調(diào)為1、2、3、4、5、7、9 的溶液加入柱內(nèi)，以2 BV/h 的流速進行吸附，收集過柱液，于500 nm 處測定吸光度，計算吸附率.然后以75%乙醇各30 mL 以2 BV/h 的流速進行解吸，收集洗脫液，于500 nm 處測定吸光度，計算解吸率.結(jié)果見表7.

表7 上柱液體pH 的考察結(jié)果

由表7 可以看出，在其他純化條件相同時，隨著上柱液體pH 值的增大，吸附率先增大后減小，吸附率與解吸率有明顯的變化趨勢，綜合考慮吸附率與解吸率，上柱藥液pH 值選擇為4.

2.3 驗證試驗

為了考察上述優(yōu)化工藝的穩(wěn)定性，采用最佳工藝條件，進行3 次驗證性試驗，計算干浸膏中總黃酮的純度，結(jié)果見表8.

表8 工藝驗證試驗考察結(jié)果

由表8 可以看出，經(jīng)DM301 大孔吸附樹脂處理的鐵莧菜提取液，干浸膏中總黃酮純度由7.4%提高到平均30.9%，且具有較好的重現(xiàn)性.

3 結(jié)論

對5 種不同型號的大孔吸附樹脂進行了鐵莧菜總黃酮純化試驗，5 種樹脂均為非極性或弱極性的樹脂，適于對黃酮類化合物進行純化，從吸附量確定了DM301 型大孔吸附樹脂分離純化鐵莧菜總黃酮的效果比較理想.其最佳工藝為：上柱藥液質(zhì)量濃度為1.462 mg/mL，藥液pH 值為4，吸附速率為2 BV/h，再用10/3 BV 的75%乙醇以2 BV/h 的流速洗脫，解吸率平均可達到90%，干浸膏中總黃酮的含量由原來的7.4%提高到30.9%，樹脂富集倍數(shù)約為4.5 倍，表明DM301 型大孔吸附樹脂對鐵莧菜總黃酮具有一定的純化性能，為鐵莧菜總黃酮的工業(yè)化生產(chǎn)提供了理論依據(jù).

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