β-環(huán)糊精研究及應(yīng)用進(jìn)展

趙永亮，管景帥，溫金娥，王衛(wèi)國，賈 柯，穆甲駿，王 衛(wèi)

（1.河南工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院，河南 鄭州 450001；2.河南經(jīng)濟(jì)貿(mào)易高級(jí)技工學(xué)校，河南 新鄉(xiāng) 452700）

0 引言

環(huán)糊精（Cyclodextrin，CD）是直鏈淀粉在環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶（Cyclodextrin Glycosytransferase，CGTase，EC2.4.1.19）作用下生成的一系列環(huán)狀低聚糖的總稱，通常含有6～12 個(gè)D-吡喃葡萄糖單元.工業(yè)上應(yīng)用的主要3 種環(huán)糊精類型為α-CD（含6 個(gè)CDs）、β-CD（含7 個(gè)CDs）和γ-CD（含8個(gè)CDs）[1].環(huán)糊精是略呈錐形的圓筒狀分子，一端大、一端小，使整個(gè)環(huán)糊精分子呈內(nèi)疏水、外親水的結(jié)構(gòu)[2].環(huán)糊精這種特殊的分子結(jié)構(gòu)，使其疏水空洞內(nèi)可以包絡(luò)一些客體分子，形成穩(wěn)定的包合物[3-4]，從而改變客體分子的溶解度、揮發(fā)性和化學(xué)性能等理化性質(zhì)[5].環(huán)糊精的結(jié)構(gòu)不同，性質(zhì)差異也很大，由于β-CD 的分子空腔大小適中（內(nèi)徑70～80 nm）、結(jié)晶性能良好（易于提純）、生產(chǎn)成本低，是目前應(yīng)用范圍廣且生產(chǎn)最多的環(huán)糊精產(chǎn)品[6].

β-環(huán)糊精（β-Cyclodextrin，β-CD）是一種無臭無毒的白色結(jié)晶粉末，它是由7 個(gè)葡萄糖分子組成的環(huán)狀結(jié)構(gòu)化合物，整個(gè)分子具有略呈錐形的中空?qǐng)A筒立體環(huán)狀結(jié)構(gòu).在筒狀結(jié)構(gòu)中，空腔內(nèi)由于C3和C5上的氫原子對(duì)C1上的氧原子的屏蔽作用，使其形成了有C1、C4、C5組成的疏水區(qū).分子空腔外部表面的上端和下端都由羥基（C6伯羥基及C2和C3仲羥基）構(gòu)成，形成親水區(qū)，使分子外部具有親水性.這種結(jié)構(gòu)非常穩(wěn)定，不易受酶、pH、熱等外在條件的影響，利用這個(gè)特殊的筒狀結(jié)構(gòu)，β-CD可與許多無機(jī)、有機(jī)分子結(jié)合成主客體包絡(luò)物[7-8]，并能改變客體分子的理化性質(zhì)，具有保護(hù)、穩(wěn)定、增溶客體分子和選擇性定向分子的特性，β-CD 作為改良劑、穩(wěn)定劑、吸附劑、賦形劑等，在食品[9]、環(huán)保[10]、醫(yī)藥[11]等領(lǐng)域都有廣泛的應(yīng)用.

1 環(huán)糊精的生產(chǎn)及常用菌種

工業(yè)中的環(huán)糊精大多數(shù)是通過生物酶法生產(chǎn)的.化學(xué)合成的方法雖然也可以得到環(huán)糊精[12-13]，但與生物酶法相比，產(chǎn)率低、產(chǎn)物不容易分離提純，只適合在實(shí)驗(yàn)室中做科學(xué)研究.概括起來，工業(yè)上環(huán)糊精的生產(chǎn)主要分為4 個(gè)階段[14]：菌種的選育或構(gòu)建，培養(yǎng)，制備CGTase（分離純化和濃縮干燥[15]），淀粉的CGTase 轉(zhuǎn)化，環(huán)糊精的分離、純化與結(jié)晶.

優(yōu)良菌種是環(huán)糊精生產(chǎn)的關(guān)鍵，優(yōu)良的產(chǎn)β-CD 菌種不僅應(yīng)該產(chǎn)酶量高，而且環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶（CGTase）還要具有很強(qiáng)的選擇降解淀粉的能力，且主要生成或只生成一種CD.現(xiàn)有的資料表明，自然界中產(chǎn)CGTase 的微生物種類眾多，有芽孢桿菌、放線菌、微球菌、短桿菌、曲霉、古細(xì)菌等.工業(yè)化生產(chǎn)中使用的產(chǎn)CGTase 菌種多來自芽孢桿菌屬，主要有嗜熱脂肪芽孢桿菌（B.stearothermophilus）、嗜 堿 芽 孢 桿 菌（B.alcalophilus）、浸麻芽孢桿菌（B.macerans）、凝結(jié)芽孢桿菌（B.coagulans）等少數(shù)幾種.這些菌種分泌的胞外酶[16-17]作用于不同來源的淀粉時(shí)，環(huán)糊精的收率有所不同，大多數(shù)情況下是α、β、γ 3 種環(huán)糊精的混合物.不同來源的酶，生成3 種糊精的先后及比例有所不同，可將CGTase 分為α-CGTase、β-CGTase、γ-CGTase 3 種類型.

2 β-CGTase 研究概況

β-環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶（β-Cyclodextrin Glycosyltransferase，β-CGTase，EC2.4.1.19）屬 于α淀粉酶家族[18]，是一種由5 個(gè)結(jié)構(gòu)域組成的多功能型酶，作用于淀粉后使葡萄糖基發(fā)生轉(zhuǎn)移從而發(fā)生環(huán)化反應(yīng)生成β-CD[19].β-CGTase 是工業(yè)上大量生產(chǎn)β-CD 的專一性酶，但是我國的β-CD 菌種產(chǎn)酶量不高和生產(chǎn)成本過高使產(chǎn)業(yè)化受到限制，因此構(gòu)建具有更高β-CD 特異性的突變體菌株是提高CGTase 活力的關(guān)鍵.

根據(jù)現(xiàn)有的資料報(bào)道，獲得β-CGTase 的途徑主要有3 種：從自然界中篩選野生菌株，根據(jù)基因文庫進(jìn)行克隆表達(dá)和對(duì)已知目的基因片段進(jìn)行蛋白質(zhì)工程改良.其中野生菌株篩選不僅最為直接有效，而且也是后兩種方式的基礎(chǔ).

2.1 誘變育種

從自然界中篩選的野生菌株，很難適應(yīng)工業(yè)化生產(chǎn)的要求.而理想的工業(yè)化菌種必須具備穩(wěn)定的遺傳性狀、無污染、生長迅速、短時(shí)間內(nèi)能生產(chǎn)大量的目標(biāo)產(chǎn)物等特性.要想得到高產(chǎn)量和傳代穩(wěn)定的菌株，一般都會(huì)采用誘變育種的方法.微生物的誘變育種，是用人工手段（理化誘變劑）誘發(fā)微生物的基因發(fā)生突變，染色體結(jié)構(gòu)發(fā)生變異，通過篩選，將少量正突變菌株中的優(yōu)良菌株挑選出來，然后使其在最優(yōu)的發(fā)酵條件下生長并合成出大量的目的產(chǎn)物.目前誘變育種方法主要包括物理誘變、化學(xué)誘變、生物誘變和復(fù)合誘變.根據(jù)報(bào)道，王雁萍等[20-21]利用離子注入的方法對(duì)產(chǎn)β-CGTase 菌株02571 和Bacillus spHA-1 進(jìn)行選育發(fā)酵條件研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其產(chǎn)酶能力提高，酶活分別達(dá)到6 000 U/mL 和6 800 U/mL.何飛燕等[22]對(duì)菌株gxmf1 通過UV 和氯化鋰復(fù)合誘變處理，得到一株產(chǎn)β-CGTase 較高的菌株B15，試驗(yàn)結(jié)果表明，產(chǎn)酶量提高了255%，并且具有良好的傳代穩(wěn)定性.

2.2 CGTase 的定向改變

從野生菌株或者誘變育種中得到的CGTase 往往都具備一定的工業(yè)缺陷，如突變無定向性、酶活低、專一性和穩(wěn)定性差等.為了解決這些問題，可以通過現(xiàn)有的技術(shù)手段對(duì)菌株進(jìn)行改造，使其符合最佳的工業(yè)化生產(chǎn)要求.

2.2.1 物理化學(xué)手段

在CGTase 研究初期，DNA 重組技術(shù)還未誕生，為了分析CGTase 的性質(zhì)，通常利用一系列可以與特定氨基酸殘基發(fā)生反應(yīng)的化學(xué)試劑對(duì)酶進(jìn)行修飾，再通過產(chǎn)物的變化進(jìn)行表征.利用這種方法能粗略地分析出CGTase 中有催化功能的氨基酸殘基，這樣經(jīng)修飾后的CGTase 活性及性質(zhì)都有不同程度的變化，如Alcalde 等[23-24]對(duì)Thermoanaerobacter sp.501 菌株進(jìn)行了45%氨基酸琥珀?；蚅ys 側(cè)鏈乙酰化修飾，分別表現(xiàn)為轉(zhuǎn)糖基作用增強(qiáng)和水解活性增強(qiáng).

2.2.2 分子生物學(xué)手段

自人類首次成功獲得Bacillus macerans 中的CGTase 基因片段至今，約38 種不同來源的CGTase基因片段相繼得到證實(shí).隨著分子生物學(xué)的迅猛發(fā)展，人們開始從酶的化學(xué)修飾轉(zhuǎn)向了更為精確的分子水平（基因的定向改造）.通過基因工程技術(shù)手段對(duì)β-CGTase 進(jìn)行體外定點(diǎn)改造來獲取高專一性、強(qiáng)適應(yīng)性的β-CGTase.

通過對(duì)CGTase 與底物結(jié)合的機(jī)制分析，改變酶蛋白中底物結(jié)合位點(diǎn)處的氨基酸，可提高酶的催化活性.先鎖定與亞位點(diǎn)處結(jié)合的關(guān)鍵氨基酸殘基，再運(yùn)用基因改造的手段替換關(guān)鍵位點(diǎn)的氨基酸殘基，分析產(chǎn)物特異性的變化.由于活性催化區(qū)域的氨基酸殘基數(shù)目較大，因此所選突變氨基酸殘基的對(duì)象相對(duì)集中在位于保守性較差的亞位點(diǎn)處[25]，如Bacillus circulans（strain 251）中的亞位點(diǎn)-3，-7[26].迄今為止，已經(jīng)完成10 種不同來源CGTase 的定向改造工作，如 Shim 等[27]對(duì)Alkalophilic Bacillus sp.I-5 菌株89 或100 位點(diǎn) 進(jìn)行改造，使原殘基Y 突變?yōu)镕 殘基，結(jié)果β-CD 產(chǎn)量增加.Li 等[28]對(duì)P.macerans JFB05-01 菌株47位點(diǎn)進(jìn)行改造，使原殘基K 突變?yōu)镽，H，T，S，L 殘基，結(jié)果α-CD 產(chǎn)量下降，β-CD 產(chǎn)量增加.

3 β-CD 的應(yīng)用

3.1 β-CD 在醫(yī)藥行業(yè)的應(yīng)用

β-CD 空腔大小適中，包合能力強(qiáng)，作為一種新型的藥物包合材料，與小分子藥物制成β-CD 包合物后，能顯著改善藥物的理化性質(zhì)并且安全無毒，所以β-CD 經(jīng)常用作藥品的賦形劑.

3.1.1 增加藥物的穩(wěn)定性

有不少藥物的活性成分易受熱、光、空氣和化學(xué)環(huán)境的影響[29]而失去藥效，如將這些揮發(fā)性成分采用β-CD 包封，可防止其逸散，即使溫度、pH 等外部條件發(fā)生改變，仍能保持藥物的穩(wěn)定性，從而提高藥物的療效.孟慶剛等[30]試驗(yàn)表明，咳喘寧膠囊中揮發(fā)油β-CD 包合物的穩(wěn)定性明顯高于物理混合物，β-CD 可有效防止揮發(fā)油的揮發(fā)，提高其穩(wěn)定性.

3.1.2 提高藥物的溶解度及生物利用度

難溶性的藥物與β-CD 包合后，由于β-CD 的親水性可以提高藥物在水中的溶解度，特別是增加一些脂溶性化合物在水中的溶解性，從而提高藥物的吸收效果.如果包合常數(shù)大小合適，β-CD也可提高包合物制劑的生物利用度[31]、增強(qiáng)藥效和減少不良反應(yīng).Wei 等[32]的試驗(yàn)表明，魚腥草素經(jīng)β-CD 包合后，溶解度增大了11.4 倍，溶出速度大大加快，并且有效掩蓋了魚腥味，從而提高了藥物的生物利用度.

3.1.3 控制藥物的釋放速度

β-CD 與藥物以物理形式或者共價(jià)鍵的方式結(jié)合，包合后可以改變藥物的釋放行為，也就是能控制藥物的釋放，還可以提高親脂性藥物在毫微囊中的載藥量[29]，從而達(dá)到緩控釋給藥的目的，并提高藥效.Ungaro F 等[33]考察了β-CD 與藥物nicardipine（NIC）的釋放行為.試驗(yàn)表明:藥物釋放速度隨β-CD 與藥物物質(zhì)的量的比的增大而減慢，β-CD 的存在減小了NIC 的有效擴(kuò)散，從而延長了藥物的作用時(shí)間.

3.1.4 掩蓋苦味和異臭

有些藥物（特別是中草藥）味道苦澀，刺激性氣味強(qiáng)烈，患者難以服用，如果用β-CD 進(jìn)行包合，可避免藥物與味蕾直接接觸，減少苦味，也能掩蓋藥物的不良?xì)馕?侯曙光等[34]在酸性和堿性環(huán)境中，用β-CD 將鹽酸雷尼替丁制成了包合物，有效掩蓋了藥物的不良?xì)馕?

3.2 β-CD 在食品行業(yè)的應(yīng)用

β-CD 可以作為食品和食品成分的穩(wěn)定劑（防揮發(fā)、抗氧化），用來保護(hù)芳香物質(zhì)和保持色素穩(wěn)定[35]，還可除去異味和苦味（如海產(chǎn)品，乳制品）.食品中的活性成分（如維生素）與β-CD 形成包絡(luò)物，可以鈍化光敏性和熱敏性.Chen 等[36]用β-環(huán)糊精制備蝦青素的包合物，蝦青素自身的水溶性小于0.15 mg/mL，而制備的包合物不但提高了蝦青素的水溶性，而且大大提高了蝦青素對(duì)溫度和光照的穩(wěn)定性.

3.3 β-CD 在環(huán)保行業(yè)的應(yīng)用

3.3.1 農(nóng)藥污染物治理、農(nóng)藥殘留檢測

隨著科技的進(jìn)步，農(nóng)藥在農(nóng)業(yè)上得到了廣泛應(yīng)用，但多數(shù)農(nóng)藥具有疏水性，易被土壤膠體吸附，導(dǎo)致其在土壤中傳輸、降解困難，從而造成農(nóng)藥的積累和殘留[37].Kamiya M 等[38]研究發(fā)現(xiàn)，β-CD在含有腐殖酸的水溶液中可促進(jìn)光誘導(dǎo)自由基的生成，并對(duì)其具有包結(jié)作用，從而引發(fā)農(nóng)藥光降解反應(yīng).

3.3.2 污水處理和土壤改性

近年來，由于環(huán)境污染和工業(yè)廢水排放，使土壤中沉積了大量濃度高且成分復(fù)雜的有害重金屬離子，嚴(yán)重降低了土壤質(zhì)量.隨著工業(yè)的發(fā)展，重金屬離子對(duì)水體的污染也日益嚴(yán)重，這些污染已經(jīng)影響到工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)，如果不及時(shí)處理，最終將會(huì)危害人類健康.β-CD 在一定條件下可以直接和重金屬離子配位生成多核金屬化合物，開辟了解決此問題的一種全新的途徑.Ehsan 等[39]研究表明，β-CD 與乙二胺四乙酸二鈉聯(lián)合作用可以去除土壤中鎘、鉻、銅、錳等多種重金屬離子.

3.4 β-CD 在分析化學(xué)上的應(yīng)用

在分析化學(xué)方面，由于β-CD 是有手性中心的手性分子，對(duì)有機(jī)分子有識(shí)別和選擇的能力，可應(yīng)用于柱色譜分離[40]或者電泳分離[41]；β-CD 的空腔易與客體分子形成包合物從而影響客體分子的光譜性質(zhì)，因此可應(yīng)用于分析檢測[42]和痕量金屬含量的測定[43]等方面.

4 β-CD 的改性及其衍生物的研究概況

由于β-CD 在水中的溶解度較小[44]和包合能力有限，使其在工業(yè)應(yīng)用上有一定的局限性.因此，人們開始對(duì)β-CD 母體進(jìn)行改性，以改變?chǔ)?CD的理化性質(zhì)，推出新型功能材料并提高其應(yīng)用效果.

β-CD 改性就是指在β-CD 母體結(jié)構(gòu)骨架不變的基礎(chǔ)上引入一些官能團(tuán)，進(jìn)行修飾，使其成為具有不同性質(zhì)或功能的產(chǎn)物，從而優(yōu)化β-CD 分子的性能.改性后的β-CD 也叫β-CD 衍生物.目前，β-CD 改性主要有化學(xué)法和酶工程法，其中化學(xué)法改性主要是對(duì)β-CD 空腔外表面上的羥基通過酯化、醚化、去氧化等加以修飾，目前化學(xué)改性效果優(yōu)良的方法主要是烷基化改性和羥烷基化改性，而酶工程法一般是通過特定的酶（CGTase 或普魯蘭酶）將單糖或者寡糖結(jié)合到β-CD 上.現(xiàn)有的資料表明，β-CD 衍生物比天然β-CD 具有更優(yōu)良的特性，改性后的環(huán)糊精的增溶性、穩(wěn)定性、生物酶性、識(shí)別選擇性、光電化學(xué)性能等均大大提高.如曹新志等[45]采用相溶解度法測定了黃酮在不同濃度甲基-β-CD 與β-CD 的增溶效應(yīng)，甲基-β-CD衍生物的增溶作用明顯強(qiáng)于母體β-CD.而且甲基-β-CD 包合黃酮的能力也比母體β-CD 強(qiáng).有些CD 衍生物主要應(yīng)用于仿生學(xué)分子識(shí)別、模擬酶與生物膜功能的研究，這方面的研究有巨大的誘人前景.如宋發(fā)軍等[46]利用雙[6-氧-（丁烯二酸-1，4-單酯-4）]β-CD·Fe3+·H2O2同時(shí)模擬葡萄糖氧化酶（GOD）和過氧化物酶（POD）來催化測定葡萄糖含量.

5 結(jié)論與展望

β-CD 是客體分子的理想載體分子，是一種新型的包合材料.由于β-CD 經(jīng)修飾后具有更好的包合效果和包合率，所以β-CD 衍生物無可爭議地成為新一代的高級(jí)載體材料，尤其是2-羥丙基-β-CD 已顯示出了巨大的應(yīng)用價(jià)值，這也是近幾年β-CD 研究的趨勢和熱點(diǎn).由于β-CD 獨(dú)特的優(yōu)良性質(zhì)使其在工業(yè)應(yīng)用上有著激動(dòng)人心的想象空間，然而，由于受目前研究技術(shù)所限，其在有些領(lǐng)域還不能廣泛應(yīng)用.對(duì)β-CD 研究停滯不前的主要原因歸根結(jié)底是對(duì)CGTase 產(chǎn)物專一性機(jī)理的認(rèn)識(shí)不足，這也是目前首要解決的難題和面臨的挑戰(zhàn).解決這一問題需要對(duì)CGTase 的空間結(jié)構(gòu)及氨基酸功能有更為深刻、全面的認(rèn)識(shí)和分析，還要進(jìn)一步闡述CGTase 的詳細(xì)催化機(jī)理.這一技術(shù)瓶頸一旦突破，我們就可以采用遺傳工程的方法，得到高產(chǎn)、專一性強(qiáng)的產(chǎn)CGTase 的菌株，以適應(yīng)大規(guī)模的工業(yè)生產(chǎn).因此，通過新的研究方法來對(duì)CGTase 進(jìn)行定向改造是未來研究的重點(diǎn).

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