FGF21表達系統(tǒng)中的研究進展

王萌，魏健，王云鵬

（1.長春師范大學，吉林 長春 130032；2.吉林省農(nóng)業(yè)科學研究院，吉林 長春 130033）

成纖維細胞生長因子21能夠刺激脂肪細胞的葡萄糖吸收，降低血漿中葡萄糖和甘油三醋的濃度，從而糾正多種代謝異常。并且FGF21是FGF家族中發(fā)現(xiàn)的唯一沒有促有絲分裂活性的基因，因此大大降低了其臨床用藥的風險，被認為是一種潛在的治療代謝性疾病的新藥。尤其是FGF21與胰島素相比，F(xiàn)GF21具有過量不導致低血糖的優(yōu)點。另外FGF21不具備FGF家族經(jīng)典的促有絲分裂活性，徹底消除了人們對于FGF21致瘤性的擔憂，使得FGF21體內(nèi)用藥治療糖尿病成為可能。FGF21不僅能通過調(diào)節(jié)糖脂代謝有效抑制糖尿病的發(fā)展，針對于多種糖尿病并發(fā)癥也表現(xiàn)出了明顯的抑制作用。由于FGF21作為一種藥用蛋白的獲得途徑十分有限，且價格昂貴，因此而限制了FGF21的臨床研究。

1 FGF21的原核表達系統(tǒng)

大腸桿菌被廣泛地應用到重組蛋白的生產(chǎn)有生產(chǎn)成本低、操作技術(shù)簡單等優(yōu)點，是表達非糖基化重組蛋白的首選，目前FDA批準生產(chǎn)的重組蛋白藥物大約有30%由大腸桿菌表達[1]。然而，大腸桿菌胞內(nèi)表達重組蛋白，具有易被蛋白酶降解、不能形成正確的二硫鍵和錯誤折疊等風險，而導致重組蛋白不表達、表達量低以及錯誤折疊形成包涵體等問題[2]。相對于大腸桿菌細胞質(zhì)細胞周質(zhì)是一個氧化環(huán)境，有利于二硫鍵的正確形成促進蛋白質(zhì)的正確折疊；此外細胞周質(zhì)蛋白酶含量低，重組蛋白不易被降解；同時細胞周質(zhì)蛋白總量低，便于重組蛋白的提取純化，簡化了提純工藝并節(jié)約了生產(chǎn)成本[3]。Sec分泌途徑是大腸桿菌經(jīng)典的依賴于N 端信號肽的轉(zhuǎn)運途徑，已有許多重組蛋白通過Sec分泌途徑成功表達。利用大腸桿菌細胞質(zhì)周質(zhì)已經(jīng)制備出純度在95%以上且具有生物活性的FGF21蛋白。

2 FGF21的畢赤酵母表達系統(tǒng)

與哺乳動物細胞相比，首先畢赤酵母培養(yǎng)條件簡單，適合高密度培養(yǎng)，提高目的蛋白的產(chǎn)量；其次利用甲醇誘導的醇氧化酶Ⅰ啟動子，嚴格控制外源基因的表達，無論是胞內(nèi)、胞外均可實現(xiàn)外源基因的高表達。DNA轉(zhuǎn)化率高，擁有真核蛋白修飾系統(tǒng)，如糖基化、二硫鍵的形成及蛋白酶解加工，并且畢赤酵母自身分泌蛋白水平較低，表達的外源蛋白易于分離純化[4]，尤其適用表達外源蛋白。邵明龍等[5]利用畢赤酵母中表達FGF21，獲得蛋白純度達90%。但在已完成的表達過程中存在表達量較低，且蛋白穩(wěn)定性差，易降解，無法獲得具有完整結(jié)構(gòu)的FGF21等問題

3 FGF21的油體表達系統(tǒng)

植物油體表達系統(tǒng)具有完整的真核表達系統(tǒng)，經(jīng)糖基化、?；?、磷酸化等翻譯后加工過程，可使其表達產(chǎn)物具有與高等動物細胞一致的生物活性。同時，植物油體表達系統(tǒng)表達的外源蛋白利用油體親脂疏水的特性，使轉(zhuǎn)基因植物種子經(jīng)過“粉碎－液體抽提－離心”處理，將融合蛋白從轉(zhuǎn)基因植物種子中分離出來[6]大大簡化了目標蛋白與受體內(nèi)源蛋白的分離和純化工藝，降低了純化成本。目前，已有成功利用油體表達系統(tǒng)生產(chǎn)目標蛋白的先例。

油體表達系統(tǒng)是基于降低某些植物表達蛋白的提取、純化成本而研制的一種新的植物表達體系，其具有以下特點：首先油體基因的表達受激素和發(fā)育的調(diào)控，使油體基因只在種子成熟過程中表達，因此通過外源基因與油體基因進行融合，可以使目的基因在植物的種子中特異表達；其次油體基因的轉(zhuǎn)錄在開花后4～6周，成熟種子中的mRNA急劇降低，因此油體蛋白可在成熟種子中穩(wěn)定存在。目前利用油體表達系統(tǒng)已經(jīng)成功地表達了人胰島素[7]、木聚糖酶等蛋白。本研究的蛋白檢測結(jié)果可以進一步證明利用油體表達系統(tǒng)表達外源基因的可行性。目前，F(xiàn)GF21在微生物中的表達量雖然較高，但一般呈包涵體形式表達，純化及復性成本較高，而且活性不高[8]。FGF21在油菜油體中的表達，增強了其穩(wěn)定性，這將為藥用蛋白FGF21研究奠定基礎(chǔ)。

付宏岐等人初步建立了以PMI為安全篩選標記的擬南芥遺傳轉(zhuǎn)化體系，成功獲得了表達FGF21蛋白的轉(zhuǎn)基因擬南芥株系[9]，并收獲了T1代擬南芥種子；PCR擴增和Southern blot檢測結(jié)果證實，重組FGF21基因以單拷貝和多拷貝2種方式插入到轉(zhuǎn)基因擬南芥基因組中；BandScand 5.0軟件和West-ern blot分析檢測結(jié)果顯示，F(xiàn)GF21融合蛋白約占轉(zhuǎn)基因擬南芥種子可溶性蛋白的3.76%，并具有良好的免疫原性。

植物生物反應器與其他生物反應器如動物反應器、蛋白的原核表達等相比有許多明顯的優(yōu)勢，如低成本、安全、操作簡單、蛋白能正確折疊及得到真核相關(guān)修飾等，已被廣泛研究并應用在藥物蛋白的生產(chǎn)上。目前，已有成功利用番茄穩(wěn)定表達系統(tǒng)生產(chǎn)目標蛋白的先例，如張麗華等[10]利用櫻桃番茄成功遺傳轉(zhuǎn)化了胸腺肽基因。近些年來，隨著基因工程等生物技術(shù)的不斷發(fā)展，以轉(zhuǎn)基因技術(shù)為代表的植物基因工程技術(shù)，為農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展提供了強有力的支持，已有幾十種藥用蛋白或多肽在植物中成功表達[11]。

李海燕等人將FGF21基因轉(zhuǎn)入番茄中[14]，以番茄為生物反應器生產(chǎn)FGF21蛋白，旨在為進一步提高番茄的利用價值及為利用其他植物生物反應器表達FGF21蛋白提供理論參考。