中草藥對(duì)兔球蟲卵囊體外發(fā)育的影響

方素芳 劉康雅 崔平 蘇杰 褚耀誠 馬利芹 魏香蒲

摘要 ? ?為探討白頭翁、常山、南瓜子、青蒿、柴胡、絞股藍(lán)、秦皮、石榴皮、板藍(lán)根、黃檗、檳榔、馬齒莧等12種中草藥水煎劑對(duì)兔球蟲卵囊孢子化的影響，選用100%、50%、25%不同濃度的單味藥物對(duì)未孢子化的兔球蟲進(jìn)行體外抑制試驗(yàn)，于第3、5天分別計(jì)數(shù)。然后洗去中藥組的藥液，加等量2.5%重鉻酸鉀溶液，繼續(xù)培養(yǎng)3 d，計(jì)算每組卵囊的孢子化率。結(jié)果表明，所選用的12種中草藥中白頭翁、南瓜子、柴胡、絞股藍(lán)的3個(gè)濃度均可以明顯抑制卵囊孢子化;而石榴皮、馬齒莧、板藍(lán)根僅100%濃度對(duì)抑制球蟲卵囊有一定效果;常山、青蒿、秦皮、黃檗、檳榔抑制球蟲卵囊孢子化的作用效果不明顯。洗去中藥后，只有100%、50%濃度的絞股藍(lán)有部分卵囊沒有孢子化，白頭翁、南瓜子、柴胡、馬齒莧組兔球蟲在重鉻酸鉀環(huán)境中仍可繼續(xù)生長，說明單味中藥對(duì)卵囊只能抑制其發(fā)育而不能有效殺滅，即脫離中藥環(huán)境，兔球蟲仍可繼續(xù)發(fā)育。

關(guān)鍵詞 ? ?中草藥;兔球蟲;體外發(fā)育;孢子化;抑制作用

中圖分類號(hào) ? ?S829.1 ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 ? ?A

文章編號(hào) ? 1007-5739（2020）22-0176-03 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）

傳統(tǒng)的兔球蟲病防治方法多為藥物防治，但是面臨日益嚴(yán)重的困難和挑戰(zhàn)，兔球蟲像其他球蟲一樣很容易產(chǎn)生耐藥性蟲株，致使新生產(chǎn)的抗球蟲藥在使用很短的一段時(shí)間后即產(chǎn)生抗藥性而失去使用價(jià)值，抗球蟲藥很難長期占據(jù)市場(chǎng)。藥物的殘留以及對(duì)環(huán)境的污染，給食品工業(yè)安全生產(chǎn)和人民衛(wèi)生健康帶來嚴(yán)重威脅，找到防治球蟲病的新方法是養(yǎng)殖業(yè)者和防制專家共同追求的目標(biāo)。周新銳等[1]、常曉輝等[2]報(bào)道，雞球蟲對(duì)中草藥不易產(chǎn)生耐藥性，毒副作用小，具有廣闊的發(fā)展前景。但是目前中草藥的利用大多數(shù)為體內(nèi)用藥階段，關(guān)于中草藥對(duì)球蟲卵囊體外發(fā)育的影響報(bào)道較少[3]。為此，本研究選取南瓜子、柴胡、白頭翁等12種中藥進(jìn)行體外抑制兔球蟲卵囊孢子化試驗(yàn)，以期為新型兔球蟲消毒劑的研發(fā)及新型抗球蟲中藥的研究提供參考。

1 ? ?材料與方法

1.1 ? ?試驗(yàn)材料

中草藥：白頭翁、常山、南瓜子、青蒿、柴胡、絞股藍(lán)、秦皮、石榴皮、板藍(lán)根、黃檗、檳榔、馬齒莧等12種中草藥，均購自河北祁新中藥顆粒飲片有限公司，采用煎煮法制成含生藥 1 g/mL的提取液，備用。

兔球蟲卵囊：選用孔氏艾美耳球蟲卵囊，由河北北方學(xué)院獸醫(yī)寄生蟲實(shí)驗(yàn)室提供，試驗(yàn)前通過人工感染無球蟲兔進(jìn)行復(fù)壯，獲得新鮮未孢子化球蟲卵囊，備用。

1.2 ? ?試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在光口瓶中分別加入濃度100%、50%、25%的白頭翁、常山、南瓜子、青蒿、柴胡、絞股藍(lán)、秦皮、石榴皮、板藍(lán)根、黃檗、檳榔、馬齒莧等不同濃度的湯劑40 mL。另外設(shè)2瓶2.5%重鉻酸鉀溶液40 mL作為對(duì)照，于每個(gè)光口瓶中均加入4×106未孢子化球蟲卵囊，放入振蕩培養(yǎng)箱（HZQ-F160）中，在27 ℃條件下進(jìn)行培養(yǎng)，于第3、5天分別計(jì)數(shù)。然后洗去中藥組的中藥液，加等量2.5%重鉻酸鉀溶液，繼續(xù)培養(yǎng)3 d，計(jì)算每組卵囊的孢子化率。

1.3 ? 中藥制劑制備

稱取白頭翁、常山、南瓜子、青蒿、柴胡、絞股藍(lán)、秦皮、石榴皮、板藍(lán)根、黃檗、檳榔、馬齒莧各40 g制成湯劑。具體方法為：以白頭翁為例，稱取白頭翁40 g，加入350 mL蒸餾水浸泡20 min，文火煮30 min，過濾，濾渣再加350 mL蒸餾水，文火煮30 min，過濾，合并二次濾液，加熱濃縮至40 mL，制成100%中藥湯劑（即1 mL溶液含有1 g干物質(zhì)），高壓滅菌，備用。其他幾種藥液制備方法與白頭翁的制備方法相同。按照試驗(yàn)設(shè)計(jì)，用時(shí)配成不同濃度的湯劑。

1.4 ? ?卵囊孢子化率計(jì)算

分別在培養(yǎng)3、5、8 d后進(jìn)行孢子化卵囊的計(jì)數(shù)，取1滴卵囊和藥液的混懸液在載玻片上并于10×40倍數(shù)的顯微鏡下進(jìn)行觀察，隨機(jī)數(shù)100個(gè)球蟲卵囊，記錄其中已經(jīng)孢子化的卵囊數(shù)量，從而得出其孢子化率。計(jì)算公式如下：

卵囊孢子化率（%）=孢子化卵囊數(shù)/100個(gè)卵囊×100。

2 ? ?結(jié)果與分析

2.1 ? ?單味中藥作用3 d對(duì)兔球蟲卵囊孢子化率的影響

將本試驗(yàn)的12種中草藥制備成3個(gè)濃度的湯劑，研究其對(duì)兔球蟲卵囊孢子化的抑制差異。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，白頭翁、南瓜子、柴胡、絞股藍(lán)的3個(gè)濃度均可以明顯抑制卵囊的孢子化;而石榴皮、馬齒莧、板藍(lán)根僅100%濃度對(duì)抑制球蟲卵囊有一定效果;常山、青蒿、秦皮、黃檗、檳榔抑制球蟲卵囊孢子化的作用效果不明顯（表1）。

2.2 ? ?單味中藥作用5 d對(duì)兔球蟲卵囊孢子化率的影響

不同濃度單味中藥作用5 d對(duì)兔球蟲卵囊孢子化的影響，與不同濃度單味中藥作用3 d對(duì)兔球蟲卵囊孢子化的影響結(jié)果差異不明顯，白頭翁、南瓜子、柴胡、絞股藍(lán)的3個(gè)濃度均可以明顯抑制卵囊的孢子化;石榴皮、馬齒莧、板藍(lán)根僅100%濃度對(duì)抑制球蟲卵囊有一定效果;常山、青蒿、秦皮、黃檗、檳榔對(duì)球蟲卵囊孢子化抑制不明顯（表2）。

2.3 ? ?洗去中藥后兔球蟲卵囊孢子化率的變化

單味中藥作用5 d后，洗去中藥組的中藥液，加等量 2.5%重鉻酸鉀溶液，繼續(xù)培養(yǎng)3 d，計(jì)數(shù)，觀察兔球蟲卵囊的孢子化率。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，具有明顯抑制卵囊孢子化的中藥組，洗去中藥之后，只有100%、50%濃度的絞股藍(lán)有部分卵囊沒有孢子化，白頭翁、南瓜子、柴胡、馬齒莧組兔球蟲在重鉻酸鉀環(huán)境中仍然可以繼續(xù)生長。這說明單味中藥對(duì)卵囊只能抑制其發(fā)育而不能有效殺滅，即脫離中藥環(huán)境，兔球蟲仍然可以繼續(xù)發(fā)育（表3）。

3 ? ?結(jié)論與討論

3.1 ? ?單味中藥抑制兔球蟲卵囊孢子化的效果

本試驗(yàn)設(shè)3個(gè)濃度研究12種中草藥湯劑對(duì)兔球蟲卵囊孢子化的抑制效果。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，白頭翁、南瓜子、柴胡、絞股藍(lán)的3個(gè)濃度均可以明顯抑制卵囊的孢子化，兔球蟲孢子化率為0～7%。劉 ?陽等[4]用100%濃度、50%濃度、25%濃度白頭翁湯劑培養(yǎng)3 d，兔球蟲孢子化率分別為85%、70%、60%;張國[5]用100%濃度、50%濃度、25%濃度白頭翁湯劑培養(yǎng)4 d，兔球蟲孢子化率分別為36%、46%、47%;張文香等[6]用100%濃度、50%濃度、25%濃度白頭翁湯劑培養(yǎng)4 d，雞球蟲孢子化率分別為13%、14%、15%;高俊峰等[7]用100%濃度、50%濃度、25%濃度柴胡湯劑培養(yǎng)，兔球蟲孢子化率分別為32%、33%、35%。

本文中石榴皮、馬齒莧、板藍(lán)根僅100%濃度對(duì)抑制球蟲卵囊有一定效果，兔球蟲孢子化率為3%～53%。劉 ?陽等[4]用100%濃度、50%濃度、25%濃度石榴皮湯劑培養(yǎng)3 d，兔球蟲孢子化率分別為75%、81%、80%。

文中常山、青蒿、秦皮、黃檗、檳榔對(duì)抑制球蟲卵囊孢子化作用效果不明顯，兔球蟲孢子化率為87%～98%。不同濃度單味中藥作用3、5 d對(duì)兔球蟲卵囊孢子化的影響結(jié)果差異不明顯。劉 ?陽等[4]用100%濃度、50%濃度、25%濃度青蒿湯劑培養(yǎng)3 d，兔球蟲孢子化率分別為76%、83%、76%;用100%濃度、50%濃度、25%濃度秦皮湯劑培養(yǎng)3 d，兔球蟲孢子化率分別為49%、61%、55%。張國[5]用100%濃度、50%濃度、25%濃度青蒿湯劑培養(yǎng)4 d，兔球蟲孢子化率分別為60%、64%、72%;用100%濃度、50%濃度、25%濃度秦皮湯劑培養(yǎng)4 d，兔球蟲孢子化率分別為63%、65%、68%。張文香等[6]用100%濃度、50%濃度、25%濃度常山湯劑培養(yǎng)4 d，雞球蟲孢子化率分別為26%、29%、40%;用100%濃度、50%濃度、25%濃度秦皮湯劑培養(yǎng)4 d，雞球蟲孢子化率分別為12%、14%、16%;用100%濃度、50%濃度、25%濃度青蒿湯劑培養(yǎng)4 d，雞球蟲孢子化率分別為13%、19%、24%。高俊峰等[7]用100%濃度、50%濃度、25%濃度常山湯劑培養(yǎng)，兔球蟲孢子化率分別為35%、37%、39%;用100%濃度、50%濃度、25%濃度青蒿湯劑培養(yǎng)，兔球蟲孢子化率分別為37%、42%、45%。

本研究結(jié)果與劉陽、高俊峰等的結(jié)果存在差異，分析原因可能是所用的兔球蟲蟲種不同。同時(shí)，中草藥能抑制卵囊孢子化過程，使其孢子化率降低或延遲其孢子化時(shí)間，原因可能是因?yàn)橐恍┲胁菟幍乃幬锍煞帜艽┩嘎涯冶谝鹨种?、殺滅作用，或是球蟲卵囊對(duì)部分藥性成分敏感因而致孢子化率降低[8]。中草藥對(duì)兔球蟲卵囊的作用機(jī)理仍有待研究。

3.2 ? ?單味中藥殺滅兔球蟲卵囊的效果

單味中藥作用5 d后，洗去中藥液，加等量2.5%重鉻酸鉀溶液，繼續(xù)培養(yǎng)3 d。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，只有100%、50%濃度的絞股藍(lán)有部分卵囊沒有孢子化，白頭翁、南瓜子、柴胡、馬齒莧組兔球蟲在重鉻酸鉀環(huán)境中仍可繼續(xù)發(fā)育，這說明單味中藥對(duì)卵囊只能抑制其發(fā)育而不能有效殺滅。葛 ?凱等[9]選用23味不同濃度的中草藥與未孢子化卵囊進(jìn)行培養(yǎng)，在不同時(shí)間觀察卵囊孢子化率，洗去藥物進(jìn)行培養(yǎng)，結(jié)果表明，商陸具有較好的抑制作用，隨著時(shí)間延長，球蟲卵囊孢子化率呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，且藥物濃度越高，抑制效果越好。孟新宇[10]研究發(fā)現(xiàn)，珍珠草、川楝子和青蒿抑制卵囊孢子化作用最為明顯，在與卵囊作用1、5、10 h后均能明顯抑制孢子化程度，但隨著作用時(shí)間的延長其卵囊孢子化率無顯著差異。王璽德等[11]報(bào)道石榴皮水提物對(duì)離體培養(yǎng)兔球蟲卵囊的殺滅作用藥效很好。我國中草藥資源豐富，但中草藥的活性成分和藥理作用非常復(fù)雜，篩選出具有抗球蟲活性的單味中草藥是研制抗球蟲中草藥復(fù)方制劑的必要環(huán)節(jié)。

4 ? ?參考文獻(xiàn)

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