組織內(nèi)AEG-1表達(dá)情況對葡萄膜黑色素瘤病理特征的影響

楊晉波 鄭增光 楊世峰 鄭林峰

[摘要] 目的 探究組織內(nèi)星形膠質(zhì)細(xì)胞活化基因-1（AEG-1）表達(dá)情況對葡萄膜惡性黑色素瘤（UM）病理特征的影響。 方法 選取2016年3月～2018年8月我院眼科診治的62例（62眼）于病理室存放的UM石蠟組織標(biāo)本納入研究組。并選取同期20例（20眼）因外部原因受傷采取眼球摘除術(shù)但少量UM或絕大部分葡萄膜組織正常的石蠟組織標(biāo)本作為對照組。對比分析兩組患者AEG-1基因表達(dá)情況以及AEG-1表達(dá)情況與UM病理特征的相關(guān)性。 結(jié)果 UM 組織中AEG-1 mRNA相對表達(dá)量為（1.09±0.05），正常葡萄膜膜組織中AEG-1 mRNA相對表達(dá)量為（1.01±0.12），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;研究組62例（62眼）AEG-1陽性表達(dá)為37眼（59.68%），陰性表達(dá)為25眼（40.32%）;對照組20例（20眼）AEG-1均呈陰性表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;腫瘤高度>8 mm、累及睫狀體、侵犯鞏膜導(dǎo)管、眼外生長、視盤受累以及繼發(fā)視網(wǎng)膜脫落與AEG-1高表達(dá)均有明顯相關(guān)性（P<0.05）。結(jié)論 UM高度>8 mm、累及睫狀體、侵犯鞏膜導(dǎo)管、眼外生長、繼發(fā)視網(wǎng)膜脫落及視盤受累病理特征均與AEG-1的高表達(dá)具有密切聯(lián)系，顯著影響UM轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)和預(yù)后，為UM臨床診斷和治療提供有效參考。

[關(guān)鍵詞] 葡萄膜黑色素瘤;星形膠質(zhì)細(xì)胞活化基因-1;基因表達(dá);病理特征

[中圖分類號] R739.7? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] B? ? ? ? ? [文章編號] 1673-9701（2020）22-0139-04

Effect of AEG-1 expression in tissues on pathology features of uveal melanoma

YANG Jinbo? ?ZHENG Zengguang? ?YANG Shifeng? ?ZHENG Linfeng

Pathology Department， Zhejiang Cancer Hospital， Hangzhou? ?310022， China

[Abstract] Objective To explore the effect of astrocyte elevated gene-1（AEG-1） expression in tissues on pathology features of uveal melanoma（UM）. Methods Sixty-two（62 eyes） UM paraffin-embedded tissue specimens stored in the pathology room from patients treated in the department of ophthalmology in our hospital from March 2016 to August 2018 were enrolled in the research group. Twenty（20 eyes） paraffin-embedded tissue specimens from patients treated in the same period who underwent ophthalmectomy for reason of the external injury and had small amount of UM or large amount of normal uveal tissues were selected as the control group. The AEG-1 gene expression and the correlation between AEG-1 expression and pathology features of UM in the two groups were analyzed. Results It was found that the relative expression of AEG-1 mRNA in UM tissues was（1.09±0.05）， and the relative expression of AEG-1 mRNA in normal uveal tissues was（1.01±0.12）， with statistically significant differences（P<0.05）. In the research group（62 eyes）， specimens with positive expression of AEG-1 were 37（59.68%）， and specimens with negative expression of AEG-1 were 25（40.32%）; in the control group（20 eyes）， it was found that all specimens had negative expression. There were statistically significant differences in the two groups（P<0.05）. The high expression of AEG-1 was significantly correlated with tumor height>8 mm， involvement of ciliary body， invasion of sclera duct， extraocular growth， optic disc involvement， and secondary retinal detachment（P<0.05）. Conclusion The pathology features such as UM height>8 mm， involvement of ciliary body， invasion of sclera duct， extraocular growth， optic disc involvement， and secondary retinal detachment are closely related with the high expression of AEG-1， which has a significant effect on the metastasis risk and prognosis of UM， and can provide effective reference for clinical diagnosis and treatment of UM.

[Key words] Uveal melanoma; Astrocyte elevated gene-1; Gene expression; Pathology features

隨著電子產(chǎn)品的普及，眼部疾病的發(fā)病率日益升高，其中葡萄膜惡性黑色素瘤（Uveal melanoma，UM）是一種眼睛內(nèi)部的原發(fā)性惡性腫瘤，其發(fā)病率高、預(yù)后差、轉(zhuǎn)移死亡率較高。占全身黑色素瘤的6%左右，嚴(yán)重影響人類的生命健康[1]。UM的致病原因?yàn)轶w內(nèi)多種基因和信號傳導(dǎo)共同作用，據(jù)研究發(fā)現(xiàn)[2]，星形膠質(zhì)細(xì)胞活化基因-1（Astrocyte elevated gene-1，AEG-1）與多數(shù)腫瘤的發(fā)病和發(fā)展具有密切聯(lián)系。AEG-1是由于人免疫缺陷病毒感染胚胎星形膠質(zhì)細(xì)胞后導(dǎo)致其表達(dá)升高的蛋白質(zhì)之一。已有研究表明，組織內(nèi)AEG-1表達(dá)升高，會強(qiáng)化神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞和黑色素瘤細(xì)胞的非錨定生長能力，使星形膠質(zhì)細(xì)胞的抗凋亡能力增強(qiáng)，但其在UM中的表達(dá)情況未見詳細(xì)研究[3]。因此，探討AEG-1表達(dá)情況對UM病理特征的影響能夠有效改善UM的預(yù)后，為UM治療提供參考依據(jù)。本文就我院2016年3月～2018年8月診治的62例葡萄膜黑色素瘤患者進(jìn)行了回顧分析，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取我院2016年3月～2018年8月眼科診治的62例（62眼）于病理室存放的UM石蠟組織標(biāo)本納入研究組。并選取同期20例（20眼）因外部原因受傷采取眼球摘除術(shù)但少量UM或絕大部分葡萄膜組織正常的石蠟組織標(biāo)本作為對照組。兩組患者一般臨床資料比較見表1?；颊吣挲g、性別比例和患病眼睛等指標(biāo)比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），具有可比性。

1.2 主要設(shè)備和試劑

兔抗人MTDH多克隆抗體ab45338購自美國Abeam公司;AEC顯色試劑盒AEC-0037購自中國泰科蘭薄生物技術(shù)有限公司;免疫組織化學(xué)Elivision ⅢSuper試劑盒購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)公司;Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑和Trizol RNA提取試劑盒購自美國Invitrogen公司;PCR擴(kuò)增和逆轉(zhuǎn)錄等相關(guān)試劑盒購自德國Qiagen公司;AEG-1等相關(guān)引物由上海生工生物公司設(shè)計(jì)合成。

1.3 方法

1.3.1 實(shí)時(shí)熒光定量? PCR術(shù)檢測兩組中AEG-1 mRNA表達(dá)? 選取兩組患者組織，進(jìn)行切碎、研磨等粉碎手段，按照要求加入適量的細(xì)胞裂解液，隨后按照試劑盒說明書提取兩組患者組織中的總RNA，使用分光光度計(jì)測定提取出的RNA質(zhì)量和濃度。采用說明書方法將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀按擴(kuò)增試劑盒說明對引物進(jìn)行擴(kuò)增。加入引物序列，具體為AEG-1：上游：5'-AAG CAGTGCAAAACAGTTCACG-3'，下游：5'-GCACCTTATCACGTTACGCT-3'，擴(kuò)增片段大小為121 bp;內(nèi)參引物為GAODH：上游：5'-TGACTTCAACAGCGACACCC-3'，下游5' -CACCCTGTTGCTGTAGCCAAA-3'，擴(kuò)增片段大小為111 bp。整個(gè)反應(yīng)過程：95℃預(yù)變性30 s，95℃變性5 s，60℃退火延伸30 s，循環(huán)60次。整個(gè)過程中每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)平行反應(yīng)復(fù)孔。采用2-△△Ct法獲得兩組患者組織中AEG-1 mRNA相對表達(dá)量。

1.3.2 免疫組織化學(xué)檢測AEG-1表達(dá)情況? 將兩組石蠟組織進(jìn)行連續(xù)切片各5張，厚度大約為3 μm，選取1張?zhí)K木精-伊紅染色進(jìn)行病理診斷和相關(guān)分類，另選1張作為對照以PBS替代一抗染色，余3張進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色。染色過程：首先采用二甲苯脫蠟處理，采用梯度乙醇梯度水化，用PBS緩沖液重復(fù)沖洗3次，每次3 min。按相關(guān)試劑盒說明書要求加入pH 9.0的EDTA抗原修復(fù)液進(jìn)行微波抗原修復(fù)，緩慢低速滴加3%過氧化氫溶液進(jìn)行阻斷，于室溫條件下孵育15 min;結(jié)束后立即吸去過氧化氫溶液，且采用PBS緩沖液重復(fù)清洗3次，加入兔抗人MTDH（AEG-1）多克隆抗體一抗，比例為1：200，于4℃下過夜孵育，且PBS緩沖液重復(fù)清洗3次，每次3 min。采用HRP法進(jìn)行標(biāo)記，具體方法為采用兔IgG聚合物，于室溫條件下孵育60 min，PBS緩沖液重復(fù)清洗3次，每次3 min;并且在所有切片上滴加新鮮配制AEC溶液，在光學(xué)顯微鏡下控制其顯色;蘇木素試劑復(fù)染5 min，采用HCl溶液分化3 s，PBS緩沖液重復(fù)清洗3次，每次3 min，水性封片劑封片。

1.3.3 免疫組織化學(xué)染色結(jié)果判定? 邀請3名病理科經(jīng)驗(yàn)豐富的專家對檢測結(jié)果進(jìn)行分析。參考文獻(xiàn)[4]，以紅色或粉紅色著色為陽性著色于細(xì)胞核、細(xì)胞膜及細(xì)胞漿等位置進(jìn)行判定。判定標(biāo)準(zhǔn)：①隨機(jī)挑選每張組織切片5個(gè)或以上高倍鏡視野點(diǎn)，統(tǒng)計(jì)染色細(xì)胞，評估陽性細(xì)胞數(shù)占同類細(xì)胞數(shù)的百分比情況，其中≤5%得分為0分，>5%，≤25%得分為1分;>25%，≤50%得分為2分;>50%得分為3分。②染色程度評分標(biāo)準(zhǔn)為無著色得分為0分，弱著色得分為1分，中度著色得分為2分，強(qiáng)著色得分為3分。最終染色結(jié)果得分=每張組織切片染色程度得分與染色細(xì)胞百分比得分之積，其中最終染色結(jié)果得分0～1分為陰性（-），得分2～3分為弱陽性（±），得分4～6分為中等陽性（+），得分>6分為強(qiáng)陽性（++）。本實(shí)驗(yàn)將陰性（-）與弱陽性（±）合記作陰性;中等陽性（+）與強(qiáng)陽性（++）記作陽性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

本研究數(shù)據(jù)采用SPSS23.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析，計(jì)數(shù)資料以[n（%）]表示，采用χ2檢驗(yàn)，計(jì)量資料以（x±s）表示，采用t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組患者AEG-1 mRNA基因表達(dá)比較

研究結(jié)果顯示，UM 組織中AEG-1 mRNA相對表達(dá)量為（1.09±0.05），正常葡萄膜膜組織中AEG-1? mRNA相對表達(dá)量為（1.01±0.12），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=4.217，P=0.000）。

2.2 AEG-1于兩組組織標(biāo)本中表達(dá)情況比較

據(jù)文獻(xiàn)研究表明[5]，AEG-1被染色后一般為紅色或粉紅色顆粒，位置分布在UM細(xì)胞核周、細(xì)胞膜和細(xì)胞漿周圍。對比分析AEG-1于兩組組織標(biāo)本中表達(dá)情況。本研究結(jié)果顯示，研究組62例（62眼）AEG-1陽性表達(dá)為37眼（59.68%），陰性表達(dá)為25眼（40.32%）;對照組20例（20眼）AEG-1均呈陰性表達(dá)，兩組相比具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05）。見表2。

2.3 AEG-1表達(dá)情況與UM病理特征相關(guān)性分析

對比分析AEG-1表達(dá)情況與UM病理特征的相關(guān)性，不同影響因素下AEG-1表達(dá)見封三圖4～6。結(jié)果顯示，腫瘤高度>8 mm、累及睫狀體、侵犯鞏膜導(dǎo)管、眼外生長、視盤受累及繼發(fā)視網(wǎng)膜脫落均有明顯相關(guān)性（P<0.05）。見表3。

3 討論

UM作為成人眼部的腫瘤之一，具有轉(zhuǎn)移速度快、惡性程度高、發(fā)病率高及預(yù)后差等特點(diǎn)，嚴(yán)重影響患者的生命健康。據(jù)研究發(fā)現(xiàn)，因其轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)尚未明確，且轉(zhuǎn)移較為隱匿，早期不易被發(fā)現(xiàn)，其死亡率高達(dá)50%[6]。因此，需對影響UM患者預(yù)后的相關(guān)因素進(jìn)行進(jìn)一步分析。近年來，有學(xué)者[7]調(diào)研發(fā)現(xiàn)，AEG-1為引發(fā)腫瘤細(xì)胞侵襲、抗凋亡和轉(zhuǎn)移的蛋白質(zhì)之一，其中，AEG-1在UM中高表達(dá)，且與UM的預(yù)后具有相關(guān)性，但其與UM病理特征的相關(guān)性尚未有明確定論。

腫瘤的發(fā)生及發(fā)展是因?yàn)榇蚱屏思?xì)胞增生和凋亡之間的動態(tài)平衡所導(dǎo)致的，一旦體內(nèi)細(xì)胞凋亡受到阻礙或是無限增生出現(xiàn)問題，即發(fā)生腫瘤[8]。在UM中存在著大量抗細(xì)胞凋亡的基因和相應(yīng)參與調(diào)節(jié)的基因，AEG-1為其一。本研究采用PCR技術(shù)對比UM組織和正常葡萄膜組織中AEG-1 mRNA表達(dá)量，結(jié)果顯示，UM 組織中AEG-1 mRNA相對表達(dá)量為（1.09±0.05），正常葡萄膜膜組織中AEG-1 mRNA相對表達(dá)量為（1.01±0.12），兩組具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05）。該研究表明，AEG-1在正常葡萄膜組織中mRNA表達(dá)量顯著小于UM組織中，且在UM中呈現(xiàn)為高表達(dá)，與文獻(xiàn)結(jié)果一致[9]。另外，有相關(guān)研究認(rèn)為[10]，AEG-1作為腫瘤生物標(biāo)記物，其于視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤和神經(jīng)母細(xì)胞瘤中普遍呈現(xiàn)高表達(dá)狀態(tài)，與本研究結(jié)果一致。本文證實(shí)AEG-1高表達(dá)與是否出現(xiàn)繼發(fā)視網(wǎng)膜脫落具有顯著相關(guān)性（P<0.05）。此外，本文探究組織內(nèi)AEG-1表達(dá)情況對UM的病理特征的影響，結(jié)果顯示，AEG-1的表達(dá)情況與UM的預(yù)后具有密切關(guān)聯(lián)，與上述結(jié)果一致。首先，研究發(fā)現(xiàn)年齡、性別比例、患病眼睛、腫瘤直徑和腫瘤類型等指標(biāo)比較均未見明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05），與文獻(xiàn)結(jié)果不一致[11]。其他相關(guān)研究結(jié)果得出高齡、腫瘤直徑和腫瘤細(xì)胞類型與UM患者存在一定的相關(guān)性，導(dǎo)致該結(jié)果的原因?yàn)楸狙芯繕颖玖窟^小。同時(shí)，為分析AEG-1于UM中的表達(dá)情況與其臨床病理特征的相關(guān)性，將腫瘤高度、是否累及睫狀體、是否侵犯鞏膜導(dǎo)管、是否眼外生長、是否繼發(fā)視網(wǎng)膜脫落以及視盤是否受累等因素進(jìn)行對比分析。結(jié)果表明，當(dāng)腫瘤高度>8 mm時(shí)，腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移率相較于≤8 mm細(xì)胞更高，且AEG-1陰性表達(dá)率明顯較高（P<0.05），相關(guān)文獻(xiàn)結(jié)果一致[12]。該結(jié)果證實(shí)腫瘤細(xì)胞高度影響AEG-1陽性表達(dá)，并且隨著腫瘤高度的增加，轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)增大。當(dāng)葡萄膜黑色素瘤擴(kuò)散至睫狀體時(shí)，多數(shù)患者存在虹膜新生血管生成情況，其會導(dǎo)致腫瘤轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)不斷增加[13-15]。本研究結(jié)果顯示，是否累及睫狀體與AEG-1表達(dá)情況具有密切聯(lián)系，且具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05）。由此證明，AEG-1在UM組織中高表達(dá)與腫瘤累及睫狀體相關(guān)性顯著，且與其轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)。另外，UM按照其病理細(xì)胞形態(tài)被分為上皮樣細(xì)胞性、混合細(xì)胞型和上皮樣或混合細(xì)胞型三種，相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)[16-18]，混合細(xì)胞型的預(yù)后與上皮樣細(xì)胞的比例具有聯(lián)系，且AEG-1表達(dá)與UM細(xì)胞類型具有顯著相關(guān)性，該結(jié)果與本文結(jié)果不同。表明本研究因樣本量較小具有一定的局限性，后期需擴(kuò)大樣本量作進(jìn)一步證實(shí)。本研究結(jié)果顯示，腫瘤細(xì)胞眼外生長亦為影響腫瘤轉(zhuǎn)移的影響因素，出現(xiàn)該現(xiàn)象的原因?yàn)槟[瘤細(xì)胞生長于眼外，易通過血管和淋巴管，亦或是直接擴(kuò)散到體內(nèi)其他器官，導(dǎo)致腫瘤轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)加大[19-20]。本文對AEG-1表達(dá)情況與是否眼外生長進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩者顯著相關(guān)（P<0.05）。由此說明，腫瘤眼外生長不僅與AEG-1高表達(dá)相關(guān)，且影響UM預(yù)后。

綜上所致，UM腫瘤高度>8 mm、累及睫狀體、侵犯鞏膜導(dǎo)管、眼外生長、繼發(fā)視網(wǎng)膜脫落及視盤受累均與AEG-1的高表達(dá)具有顯著的相關(guān)性，明顯影響UM轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)和預(yù)后，為UM臨床診斷和治療提供有效參考。但由于本研究樣本量有限，且并未對AEG-1是否改變UM生物學(xué)行為和相關(guān)其他基因表達(dá)進(jìn)行深入研究，因此，今后仍需采用生物學(xué)實(shí)驗(yàn)對本研究結(jié)果進(jìn)行證實(shí)。

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（收稿日期：2019-10-30）