姜黃素通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號通路誘導(dǎo)肝癌SMMC-7721細胞凋亡的作用及對細胞活性影響分析

李巖巖 陸淼炯

[摘要] 目的 分析姜黃素通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號通路誘導(dǎo)肝癌SMMC-7721細胞凋亡的作用及對細胞活性影響。方法 選取2017年4月～2018年3月期間為研究時間段，以此期間購置的肝癌SMMC-7721細胞為試驗樣本，利用不同濃度姜黃素處理試驗樣本，先經(jīng)流式細胞儀檢測細胞凋亡情況，后經(jīng)CCK8法分別在試驗開始后24 h檢測其細胞活力，再經(jīng)流式細胞儀檢測肝癌細胞ROS含量。 結(jié)果 姜黃素濃度越高，肝癌細胞存活率呈逐步下降趨勢，同空白對照樣本比較，有顯著性差異（P<0.05）;姜黃素濃度越高，MFI值呈逐步升高趨勢，同空白對照樣本比較，有顯著性差異（P<0.05）;不同濃度姜黃素處理的試驗樣本細胞凋亡率，呈逐漸上升趨勢，與空白對照樣本比較，有顯著性差異（P<0.05）。 結(jié)論 利用姜黃素可有效地抑制肝癌細胞活性，誘導(dǎo)肝癌細胞凋亡。

[關(guān)鍵詞] 姜黃素;內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號通路;肝癌SMMC-7721細胞;細胞凋亡;細胞活性

[中圖分類號] R735.7? ? ? ? ? [文獻標(biāo)識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-9701（2020）22-0041-04

Effect of curcumin on apoptosis of liver cancer SMMC-7721 cells induced by endoplasmic reticulum stress signaling pathway and its effect on cell viability

LI Yanyan? ?LU Miaojiong

Department of Anorectal Surgery， Hangzhou Hospital of Traditional Chinese Medicine， Hangzhou? ?310007， China

[Abstract] Objective To analyze the effect of curcumin on apoptosis of liver carcinoma cell line SMMC-7721 through endoplasmic reticulum stress signaling pathway and its effect on cell viability. Methods The period from April 2017 to March 2018 was selected as the study period. The liver cancer SMMC-7721 cells purchased during this period were used as test samples. The test samples were treated with different concentrations of curcumin， and the apoptosis of cells were first detected by flow cytometry. Then the cell viability was detected by CCK8 method 24 h after the start of the experiment. And the ROS content of liver cancer cells was detected by flow cytometry. Results The higher the concentration of curcumin， the lower the survival rate of liver cancer cells. Compared with that of the blank control samples， the data showed significant difference（P<0.05）. The higher the curcumin concentration， the higher the MFI value. Compared with that of the blank control samples， the data showed significant difference（P<0.05）. The apoptosis rate of the samples treated with different concentrations of curcumin showed a gradual increase trend， which was significantly different from that of the blank control group（P<0.05）. Conclusion Curcumin can effectively inhibit the activity of liver cancer cells and induce apoptosis of liver cancer cells.

[Key words] Curcumin; Endoplasmic reticulum stress signaling pathway; Liver cancer SMMC-7721 cells; Apoptosis; Cell viability

原發(fā)性肝癌在臨床上并不少見，由于肝癌早期多無臨床表現(xiàn)，或無特異性臨床表現(xiàn)，故很容易被忽略，往往在體檢中發(fā)現(xiàn)，而一旦出現(xiàn)臨床表現(xiàn)，多已經(jīng)發(fā)展至中晚期，嚴重威脅患者生命安全[1-2]。我國是全世界范圍內(nèi)肝癌發(fā)病的重災(zāi)區(qū)，多經(jīng)手術(shù)治療，但部分患者病情已經(jīng)惡化，發(fā)展至晚期，或因其他原因?qū)е?，無法接受手術(shù)治療，則可采取放療、化療及介入方式[3]進行治療。但小肝癌治療方案現(xiàn)仍存在一定的爭議，而且肝癌治療存在一定的個體化差異。目前，中醫(yī)中藥在肝癌治療方面的作用現(xiàn)已逐步受到臨床醫(yī)務(wù)人員、患者及家屬的重視。姜黃素多源自姜科中藥根莖，色黃味苦，水溶性較差，但能溶于有機溶劑內(nèi)。姜黃素多呈結(jié)晶粉末狀，廣泛用于食品添加及染色產(chǎn)業(yè)中[4]。實驗發(fā)現(xiàn)姜黃素能夠抗炎、抗氧化，而且在動脈粥樣硬化性病變的防控中也能發(fā)揮較好的作用。上世紀末，國外學(xué)者首次提出利用姜黃素治療癌癥，隨后幾十年至今，發(fā)現(xiàn)姜黃素能夠遏制多種癌癥的生長及轉(zhuǎn)移。由于肝癌發(fā)病早期診斷難度較大，且治療性藥物存在毒副作用及耐藥性，故將姜黃素納入肝癌的防控方案相關(guān)研究課題。本次研究以2017年4月～2018年3月期間購置的肝癌SMMC-7721細胞為試驗樣本，分析在不同姜黃素處理下的細胞活性及細胞凋亡情況差異。

1 資料與方法

1.1 一般資料

本次研究選取2017年4月～2018年3月期間為研究時間段，以在此期間購置的肝癌SMMC-7721細胞為試驗樣本，購自中科院上海生物科學(xué)研究院。

1.2 試劑與儀器

本次研究主要試驗儀器及試劑：（1）RPMI 1640培養(yǎng)基，購自上海博升生物科技有限公司。（2）Gibco胎牛血清，購自上海江林生物科技有限公司。（3）elF2α，購自美國Sigma。（4）巴玖SAF-680T型酶標(biāo)儀，購自上海巴玖實業(yè)有限公司。（5）貝克曼庫爾特MoFlo XDP流式細胞儀，來自默瑞上海生物科技有限公司。（6）CCK 8法檢測試劑盒，購自上海翊圣生物科技有限公司。（7）高速冷凍離心機，購自北京時代北利離心機有限公司。（8）超凈試驗臺，購自深圳市金天地實驗室設(shè)備有限公司。（9）姜黃素，購自美國Sigma。（10）DHP-9012恒溫培養(yǎng)箱，來自上海一恒科學(xué)儀器有限公司。（11）PBS緩沖液，購自賽默飛世爾科技中國有限公司。（12）奧林巴斯CX 33顯微鏡，購自成貫儀器公司。

1.3 方法

1.3.1 細胞培養(yǎng)? 將肝癌SMMC-7721細胞試驗樣本、Gibco胎牛血清（10%）、青霉素（濃度100 U/mL）及鏈霉素（100 U/mL）置于培養(yǎng)基內(nèi)，送入恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)，在環(huán)境溫度37℃以及CO2（5%）條件下進行培養(yǎng)，當(dāng)細胞≥80%時，達到后續(xù)試驗使用標(biāo)準(zhǔn)。利用胰酶（0.25%質(zhì)量分數(shù)）對貼壁細胞消化后，傳代與凍存細胞比例為1∶3。

1.3.2 細胞凋亡檢測? 取肝癌SMMC-7721細胞試驗樣本（對數(shù)，且處于生長期內(nèi)）接種在6孔板上，每孔接種細胞數(shù)量控制在106個;送入恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)，在環(huán)境溫度37℃以及CO2（5%）條件下進行培養(yǎng)，過夜后，分組如下：第一組為無姜黃素僅加細胞培養(yǎng)基及培養(yǎng)后肝癌細胞的空白對照樣本，第二組在空白對照樣本基礎(chǔ)上加入姜黃素（濃度25 μmol/L），第三組在空白對照樣本基礎(chǔ)上加入姜黃素（濃度50.0 μmol/L）。PBS預(yù)冷后，洗滌收集好的細胞;加入Annexin V-FIT后，輕搖混勻，在室溫避光條件下進行孵育，將時間控制在15 min;孵育后在1000 r/min條件下送入離心機內(nèi)，離心5 min后，去除上清液，獲取重懸細胞，再次加入預(yù)冷PBS緩沖液及PI染色劑后，輕搖，待混勻后，在環(huán)境溫度4℃及避光條件下保存，利用流式細胞儀對上述混懸細胞液進行檢測;本次試驗重復(fù)3次后，取平均值。

1.3.3 肝細胞存活率檢測? 取肝癌SMMC-7721細胞試驗樣本（對數(shù)，且處于生長期內(nèi)）接種在96孔板上，每孔接種細胞數(shù)量控制在5000個，分組試驗，第一組為無姜黃素僅加細胞培養(yǎng)基及培養(yǎng)后肝癌細胞的空白對照樣本，第二組在空白對照樣本基礎(chǔ)上加入姜黃素（濃度25.0 μmol/L），第三組在空白對照樣本基礎(chǔ)上加入姜黃素（濃度50.0 μmol/L）;每組平行孔5個;在環(huán)境溫度37℃，以及5%的條件下進行培育，時間1 d。1 d后，注入CCK8溶液，用量10 μL，在37℃的環(huán)境溫度下孵育，時間1 h;經(jīng)酶標(biāo)儀在波長450 nm條件下對吸光度進行檢測，觀察并記錄A值;本次試驗重復(fù)3次后，取平均值。

1.3.4 細胞ROS含量檢測? 取肝癌SMMC-7721細胞試驗樣本（對數(shù)，且處于生長期內(nèi)）接種在6孔板上，每孔接種細胞數(shù)量控制在106個;送入恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)，在環(huán)境溫度37℃以及CO2（5%）條件下進行培養(yǎng)，過夜后，分組方案如下：分組試驗，第一組為無姜黃素僅加細胞培養(yǎng)基及培養(yǎng)后肝癌細胞的空白對照樣本，第二組在空白對照樣本基礎(chǔ)上加入姜黃素（濃度25 μmol/L），第三組在空白對照樣本基礎(chǔ)上加入姜黃素（濃度50.0 μmol/L）;在無血清培養(yǎng)基內(nèi)加入DCFH-DA（濃度10.0 μmol/L）后，將收集的細胞加入其中，在37℃環(huán)境下進行孵育，時長20 min，經(jīng)PBS漂洗2次后，利用流式細胞儀進行檢測，分析熒光強度;其中，以MFI值表示ROS含量;本次試驗重復(fù)3次后，取平均值。

1.4 觀察指標(biāo)

（1）不同濃度姜黃素條件下細胞凋亡試驗結(jié)果分布，分析不同濃度姜黃素處理的試驗樣本細胞凋亡率差異。（2）不同濃度姜黃素條件下細胞活性檢測結(jié)果分布，即檢測不同濃度姜黃素條件下，肝癌細胞存活率以及MFI值。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理

數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0軟件進行分析，計量資料以（x±s）表示，行t檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度姜黃素條件下肝癌細胞凋亡率比較

姜黃素濃度越高，肝癌細胞存活率越低，同空白對照組比較，組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見表1。

2.2 不同濃度姜黃素條件下肝癌細胞存活率及MFI值比較

姜黃素濃度越高，肝癌細胞存活率呈逐步下降趨勢，同空白對照樣本比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）;姜黃素濃度越高，MFI值呈逐步升高趨勢，同空白對照樣本比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見表2。

3 討論

3.1 肝癌的診斷及治療

肝癌在我國發(fā)病率較高，這與國內(nèi)乙肝群體數(shù)量較高有關(guān)[5-6]。肝癌惡化程度多較高，且病情發(fā)展速度較快，患者生存時間較短，治療難度較大，嚴重威脅患者生命安全。到本世紀初，全世界范圍內(nèi)的肝癌患者超過一半在中國。肝癌在臨床上的診斷及治療方案諸多，但以病理作為診斷金標(biāo)準(zhǔn)[7-8]，而治療方案除放化療及手術(shù)治療以外，還包括介入治療、免疫治療[9]及靶向治療[10]等。手術(shù)治療主要包括肝部分切除、肝移植等。而介入治療是微創(chuàng)治療方法的一種，現(xiàn)已證實該方案在抑制腫瘤生長、延長患者生存時間、提高其生存率方面，能夠發(fā)揮良好的臨床效果。介入方法主要包括兩大類型，其一為血管介入方法，其二為非血管介入方法。血管介入方法以肝動脈化療栓塞方法及肝動脈灌注化療方案為代表性方案，適用于無法接受手術(shù)治療的肝癌患者，或不能經(jīng)手術(shù)切除的患者，比如小肝癌。而且，在肝動脈化療栓塞方案中，化療藥物在肝組織局部緩慢釋放，能夠產(chǎn)生化療的效果，適用于中晚期患者。非血管介入方法則以局部消融方案[11]為代表方案，即經(jīng)皮穿刺后，將導(dǎo)管送至肝腫瘤，再利用物理及化學(xué)方法對瘤體進行破壞，比如無水乙醇注射，或局部熱消融治療方案，或125I放射粒子植入治療[12]。

3.2 姜黃素

姜黃素屬于一種色素，脂溶性較好，能夠清除肝組織內(nèi)的氧自由基，同時對肝組織內(nèi)的炎性反應(yīng)具有一定的抑制作用[13-14]。姜黃素主要產(chǎn)自姜黃，而莪術(shù)及郁金等其他藥材內(nèi)同樣含有姜黃素。在傳統(tǒng)中醫(yī)理論中，姜黃功效主要包括溫經(jīng)行氣、破血止痛。目前，姜黃素已經(jīng)成為相關(guān)醫(yī)學(xué)領(lǐng)域研究的重點課題。其中姜黃素的藥理作用[15]主要包括：（1）抗腫瘤，抗腫瘤增生，提高機體對腫瘤細胞的敏感度，通過對腫瘤組織轉(zhuǎn)錄因子及生長因子等靶點的作用效果，發(fā)揮其抗腫瘤及殺滅腫瘤細胞的作用，或通過抑制MMP-2的表達，或腫瘤組織內(nèi)VECF及bFGF的表達，發(fā)揮其降低腫瘤擴散的作用;誘導(dǎo)癌癥細胞凋亡，比如激活Caspase-8/9/3[16]，提高ADP活性，誘導(dǎo)癌細胞凋亡，降低NF-等因子表達。（2）抗炎，減低巨噬細胞活性，促使蛋白激酶的激活，同時抑制促炎反應(yīng)活性酶活性，適用于風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、急性肺損傷等疾病的治療。（3）其他作用，比如抗氧化作用，抗病毒作用，保護神經(jīng)及抗纖維化作用。

3.3 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)

利用藥物作用、氧化應(yīng)激反應(yīng)等多種因素，導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)，進而可致使內(nèi)環(huán)境紊亂、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能失調(diào)。而內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)的通路較多，而通過激發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)，可誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡[17-18]。本次研究中，姜黃素濃度越高，肝癌細胞存活率呈逐步下降趨勢，同空白對照樣本比較，有顯著性差異（P<0.05）;姜黃素濃度越高，MFI值呈逐步升高趨勢，同空白對照樣本比較，有顯著性差異（P<0.05）;不同濃度姜黃素處理的試驗樣本細胞凋亡率，呈逐漸上升趨勢，與空白對照樣本比較，有顯著性差異（P<0.05）。研究證實[19-20]，姜黃素濃度越高，肝癌細胞活性越差，肝癌細胞凋亡率越高，姜黃素可有成效抑制肝癌細胞活性，誘導(dǎo)肝癌細胞凋亡。但本次研究存在一定的局限性，比如研究時間較短，未與臨床病理結(jié)合等，如有需要，可延長研究時間，或與臨床病理結(jié)合進行研究。

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（收稿日期：2019-10-15）