探究ADAMTS1對非小細(xì)胞肺癌血管生成及預(yù)后的影響*

陳大明，王 布，項保利，黃攀登，苑 程，趙建清△

(河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院：1.輸血科；2.呼吸內(nèi)科，河北張家口 075000)

非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)是我國十分常見的惡性腫瘤，具有進(jìn)展快、易轉(zhuǎn)移、病死率高等特點(diǎn)[1]。腫瘤血管生成是腫瘤生長和轉(zhuǎn)移的基礎(chǔ)，有效抑制腫瘤組織的血管生成對控制其復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移具有積極意義[2]。血小板結(jié)合蛋白基序的解聚蛋白樣金屬蛋白酶(ADAMTS)家族屬于分泌型蛋白酶，有19個亞型，參與機(jī)體多種生理及病理過程,包括止血、關(guān)節(jié)炎和腫瘤發(fā)生等[3]。Ⅰ型ADAMTS(ADAMTS1)是ADAMTS家族中的一種亞型[4]。近年來有研究表明，ADAMTS1在結(jié)腸癌等多種腫瘤組織中起了重要作用，具有抗血管生成作用[5]。然而目前關(guān)于ADAMTS1在NSCLC中的表達(dá)情況少有報道。本次筆者就ADAMTS1 mRNA表達(dá)水平對NSCLC血管生成及患者預(yù)后的影響展開研究，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 隨機(jī)選擇本院2014年1—10月因診斷NSCLC并行外科手術(shù)切除的患者68例，其中男性38例，女性30例，年齡37～69歲，平均(53.5±1.5)歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)入組資料完整；(2)均為首發(fā)，術(shù)前未行放、化療；(3)均經(jīng)病理診斷證實。其中鱗狀上皮細(xì)胞癌25例，腺癌22例，大細(xì)胞癌21例；分化類型中，高分化7例，中分化21例，低分化40例；臨床分期Ⅰ～Ⅱ期32例，Ⅲ～Ⅳ期36例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移27例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移41例。所有患者及家屬均簽署知情同意書，自愿入組。

1.2方法

1.2.1標(biāo)本處理 每例患者分別取肺癌組織及距腫瘤切緣>5 cm的癌旁正常肺組織(簡稱癌旁組織)。所有組織均分為2塊，一部分加入Trizol試劑(約每1 mm3組織中加入1 mL Trizol)，置于-80 ℃冰箱保存，另一部分利用石蠟包埋，制成切片。

1.2.2實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(qPCR) 參照Trizol試劑說明書和反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書，將肺癌組織及癌旁組織中的RNA在低溫下提取并反轉(zhuǎn)錄成cDNA。ADAMTS1的上游引物為5′-CCTGGTGGTGGTGA AGAT-3′，下游引物為5′-TTCACCACCACCAGGCTAAC-3′;血管內(nèi)皮生長因子(VEGF) mRNA的上游引物為5′-G GCAGAATCATCACGAAGT-3′，下游引物為5′-CACAGGATGGCTTGAAGAT-3′;選取β -actin作為內(nèi)參，上游引物為5′-AGATCAAGATCATTGCTCCTC-3′，下游引物為5′-ACTCGTCA TACTCCTGCTT-3′。反應(yīng)條件:94 ℃預(yù)變性10 min，94 ℃變性45 s，退火45 s，72 ℃延伸45 s，經(jīng)過35個循環(huán)擴(kuò)增后，72 ℃ 7 min。PCR產(chǎn)物進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳，采用GelPro Analysizer 3.1軟件進(jìn)行半定量分析，計算得到相對表達(dá)量[6-9]。

1.2.3微血管密度(MVD)測定 參照Weidner法[10]，首先在低倍鏡(10×10)下掃描整張切片，找到“熱點(diǎn)區(qū)”，即FⅢ Ag明顯染為棕褐色的微血管區(qū)。然后換為高倍鏡(10×40)下觀察計數(shù)。在腫瘤組織之間及腫瘤組織與周圍結(jié)締組織之間每一個被染為棕褐色的細(xì)胞或細(xì)胞簇計數(shù)為1個血管，最終結(jié)果以3個視野的平均數(shù)表示[11-12]。

1.3術(shù)后隨訪 分別于術(shù)后1個月、3個月、6個月進(jìn)行隨訪，之后每半年隨訪一次，并記錄患者的術(shù)后腫瘤復(fù)發(fā)、死亡等情況，隨訪5年。

2 結(jié) 果

2.1NSCLC原位灶及癌旁組織中ADAMTS1、VEGF mRNA表達(dá)水平及MVD檢測結(jié)果比較 qRT-PCR結(jié)果顯示，NSCLC組織中ADAMTS1 mRNA表達(dá)水平低于癌旁組織， VEGF mRNA表達(dá)水平、MVD高于癌旁組織，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖1。

注：A為NSCLC原位灶與癌旁組織ADAMTS1 mRNA表達(dá)水平比較；B為NSCLC原位灶與癌旁組織VEGF mRNA表達(dá)水平比較；C為NSCLC原位灶與癌旁組織MVD比較。NSCLC原位灶與癌旁組織比較，*P<0.05。

2.2NSCLC原位灶中ADAMTS1 mRNA的表達(dá)水平與VEGF mRNA表達(dá)水平及MVD的相關(guān)性 由相關(guān)性結(jié)果分析可得，NSCLC原位灶中ADAMTS1 mRNA的表達(dá)水平與VEGF mRNA表達(dá)水平及MVD呈負(fù)相關(guān)。NSCLC原位灶中ADAMTS1 mRNA的表達(dá)水平越低，其VEGF mRNA水平越高，MVD測定越多。見圖2。

注：A為NSCLC原位灶中ADAMTS1與VEGF mRNA表達(dá)水平的相關(guān)性；B為NSCLC原位灶中ADAMTS1的表達(dá)水平與MVD的相關(guān)性。

2.3NSCLC原位灶中ADAMTS1 mRNA的表達(dá)水平與NSCLC病理特征的相關(guān)性 ADAMTS1 mRNA在NSCLC原位灶中的表達(dá)水平與患者性別、年齡、吸煙史、腫瘤位置、病理類型、分化程度無相關(guān)性，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 ADAMTS1 mRNA的表達(dá)水平與NSCLC病理特征的相關(guān)性

續(xù)表1 ADAMTS1 mRNA的表達(dá)水平與NSCLC病理特征的相關(guān)性

2.4ADAMTS1 mRNA的表達(dá)水平與TNM分期的相關(guān)性 ADAMTS1 mRNA在NSCLC原位灶中的表達(dá)水平與TNM分期相關(guān)，TNM分期越高，NSCLC患者ADAMTS1低表達(dá)的比例越高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 ADAMTS1 mRNA的表達(dá)水平與TNM分期的相關(guān)性

2.5NSCLC中ADAMTS1 mRNA的表達(dá)水平與患者預(yù)后的相關(guān)性 生存曲線顯示，低表達(dá)水平的ADAMTS1的NSCLC患者生存率下降；Cox比例風(fēng)險模型分析顯示，NSCLC患者原發(fā)灶中ADAMTS1 mRNA的表達(dá)水平是影響患者預(yù)后的危險因素。ADAMTS1 mRNA的表達(dá)水平越低，患者預(yù)后越差。見圖3、表3。

圖3 ADAMTS1 mRNA的表達(dá)水平對NSCLC患者生存率的影響

表3 Cox比例風(fēng)險模型生存分析結(jié)果

3 討 論

ADAMTS家族屬于分泌型蛋白酶，有19個亞型，可由多種細(xì)胞合成和分泌，參與機(jī)體多種生理及病理過程,包括止血過程、器官生成、血管生成、關(guān)節(jié)炎和癌癥等，其與基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)相同，二者均屬于金屬蛋白酶，結(jié)構(gòu)非常相似[13-15]。目前對MMPs在生命活動中的功能已有大量研究，但對ADAMTS家族的研究并未深入[16]。對于ADAMTS結(jié)構(gòu)的研究發(fā)現(xiàn)，ADAMTS家族含有多個結(jié)構(gòu)域，其主要結(jié)構(gòu)特點(diǎn)是C-端含有凝血酶敏感蛋白(TSP)基序[17]。ADAMTS1是ADAMTS家族中的一種亞型[18]。有研究結(jié)果表明，ADAMTS1在多種腫瘤組織中起重要作用，具有抗血管生成作用[19]，但關(guān)于ADAMTS1在NSCLC中的表達(dá)情況少有報道。筆者就ADAMTS1表達(dá)水平對NSCLC血管生成及患者預(yù)后的影響展開本次研究。

本研究結(jié)果顯示，ADAMTS1 mRNA在NSCLC原位灶與癌旁組織中存在差異性表達(dá)。ADAMTS1 mRNA在NSCLC原位灶中的表達(dá)水平遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于癌旁組織，且VEGF mRNA表達(dá)水平及MVD高于癌旁組織。該結(jié)果提示ADAMTS1的低表達(dá)水平可能與NSCLC的發(fā)生有關(guān)，表明ADAMTS1是一個腫瘤生長抑制因子。相關(guān)性分析指出，NSCLC原位灶中ADAMTS1 mRNA的表達(dá)水平與VEGF mRNA表達(dá)水平及MVD呈負(fù)相關(guān)，低表達(dá)水平的ADAMTS1可能促進(jìn)腫瘤組織中血管的生成，高表達(dá)水平可能會抑制血管的生成，表明ADAMTS1也是一個腫瘤血管生成抑制因子，這與很多研究報道中結(jié)果相一致。有研究報道指出，在體外試驗中，ADAMTS1 C-末端TSP1基序能夠結(jié)合內(nèi)皮生長因子，從而抑制VEGF 165達(dá)到抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖的作用; 另外ADAMTS1也可與成纖維細(xì)胞生長因子-2(FGF2)共同作用，導(dǎo)致FGF2裂解，產(chǎn)生TSP，釋放出具有抗血管生成片段，該片段同樣通過抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖，達(dá)到抑制血管新生的作用[20-21]。本研究推測ADAMTS1是通過抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖從而抑制新生血管生成，低表達(dá)水平的ADAMTS1對新生血管的抑制作用降低，從而表現(xiàn)出NSCLC原位灶中ADAMTS1 mRNA的表達(dá)水平與VEGF mRNA表達(dá)水平及MVD呈負(fù)相關(guān)。

本研究證明了ADAMTS1 mRNA的表達(dá)水平與肺癌患者病理特征和TNM分期的相關(guān)性。研究結(jié)果顯示，ADAMTS1 mRNA的表達(dá)水平與肺癌患者病理特征無關(guān)，而與TNM分期相關(guān)。腫瘤血管生成是腫瘤生長和轉(zhuǎn)移的基礎(chǔ)，這與上述結(jié)果相互印證。目前有研究表明，腫瘤在頭頸部癌轉(zhuǎn)移灶中ADAMTS1 mRNA的表達(dá)水平高于原發(fā)癌灶，且ADAMTS1在經(jīng)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移后的病灶中的表達(dá)水平高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及原發(fā)灶，對于其具體機(jī)制目前研究尚不十分清楚，這與本研究中ADAMTS1 mRNA的表達(dá)水平與TNM分期相關(guān)相吻合[22]。目前研究發(fā)現(xiàn)ADAMTS1與多種腫瘤組織預(yù)后相關(guān)，如：結(jié)腸癌等[23]。本研究通過Cox分析顯示，NSCLC患者原發(fā)灶中ADAMTS1 mRNA的表達(dá)水平是影響患者預(yù)后的危險因素。 ADAMTS1 mRNA的表達(dá)水平越低，患者預(yù)后越差。生存曲線顯示低表達(dá)水平ADAMTS1的NSCLC患者生存率下降。該結(jié)果表明ADAMTS1 mRNA表達(dá)水平與NSCLC患者預(yù)后呈負(fù)相關(guān)。該結(jié)果表明，ADAMTS1是影響NSCLC患者預(yù)后的重要因素之一，其主要機(jī)制或與ADAMTS1抑制腫瘤中血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖，抑制新生血管的生成有關(guān)。

4 結(jié) 論

ADAMTS1可能是一種NSCLC生長抑制因子，低表達(dá)水平的ADAMTS1可能促進(jìn)NSCLC組織中血管生成，是患者預(yù)后不良的重要影響因素，其機(jī)制可能與抑制NSCLC組織中血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖及新生血管的生成有關(guān)。ADAMTS家族在機(jī)體生命活動中所產(chǎn)生的作用及其作用機(jī)制目前尚不清楚，對于ADAMTS1在NSCLC的病理病程中的作用機(jī)制尚需進(jìn)一步探討。