lncRNA HOTAIR和lncRNA UCA1在腎上腺惡性腫瘤中的表達及臨床意義*

孫青風，杜學謙，王曉鵬，郭巖松，梅向楠，姜利寧

(1.河北省滄州市人民醫(yī)院泌尿外科，河北滄州 061001；2.河北省滄州市中心醫(yī)院泌尿外科，河北滄州 061001)

腎上腺腫瘤是泌尿外科常見腫瘤，腎上腺本身的組織學特性和解剖學特點導致其容易被漏診或誤診[1]。大量研究顯示，長鏈非編碼RNA(lncRNA)在多種腫瘤中均有異常表達，提示其與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展關系密切[2]。HOX轉(zhuǎn)錄反義RNA(HOTAIR)是首個被發(fā)現(xiàn)的具有反式轉(zhuǎn)錄調(diào)控基因表達的lncRNA，在肝癌、結直腸癌等癌癥的增殖、浸潤、轉(zhuǎn)移中發(fā)揮作用[3]。尿路上皮癌相關基因1(UCA1)是與泌尿系統(tǒng)相關的lncRNA，最早發(fā)現(xiàn)于膀胱移行細胞癌中，同時在結直腸癌、膀胱癌等癌癥中存在不同程度的高表達[4]。但上述2種lncRNA在腎上腺腫瘤中的表達和臨床意義缺少相關報道，為探究lncRNA HOTAIR、lncRNA UCA1在腎上腺腫瘤中的作用機制，本研究采用實時熒光定量(qPCR)檢測腎上腺癌患者組織中HOTAIR、 UCA1的相對表達水平，分析其相對表達水平與臨床病理的關系，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 組織標本為2016年6月至2019年6月在滄州市人民醫(yī)院及滄州市中心醫(yī)院行手術切除的52例腎上腺癌患者腎上腺癌及配對癌旁組織標本。所有患者在術前均未接受射頻消融、放療、化療等治療，腎上腺癌組織標本經(jīng)病理切片證實含80%以上癌細胞，癌旁組織取自距腎上腺癌組織超過2 cm處，經(jīng)病理切片證實無癌細胞。標本組織切除后15 min以內(nèi)置入液氮中冷凍，-80 ℃保存?zhèn)溆?。本研究?jīng)醫(yī)院倫理委員會審核批準，52例腎上腺癌患者均知情同意且簽署知情同意書。所有患者臨床資料完整，其中男31例，女21例；年齡34～79歲，平均(55.10±6.32)歲；國際抗癌組織(UICC)TNM分期：Ⅰ期11例，Ⅱ期19例，Ⅲ期16例，Ⅳ期6例。

1.2儀器與試劑 SP-756P紫外可見分光光度計(上海光譜儀器有限公司)，ABI 2720 PCR儀(美國應用生物系統(tǒng)公司)，ABI 7500型實時熒光定量PCR系統(tǒng)(美國應用生物系統(tǒng)公司)，ABI life 2720 PCR熱循環(huán)儀(美國應用生物系統(tǒng)公司)，GenoSens 1860凝膠成像分析系統(tǒng)(上海勤翔科學儀器有限公司)，德國SIGMA1-14小型臺式高速離心機(德國Sigma公司)，Trizol RNA提取試劑盒(北京英格恩生物有限公司)，miRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國應用生物系統(tǒng)公司)，miRNA qPCR檢測試劑盒(北京百奧萊博科技有限公司)，其他常規(guī)試劑、儀器及實驗耗材均由醫(yī)院實驗室提供。

1.3方法 取100 mg凍存組織以Trizol法提取組織總RNA，操作步驟同試劑盒說明書。使用紫外可見分光光度計測定提取RNA的吸光值，并測定濃度。按照miRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒所示操作步驟反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，-20 ℃?zhèn)溆谩ＨDNA進行qPCR檢測HOTAIR和UCA1表達水平。lncRNA HOTAIR正向引物5′-3′:GGTAGAAAAAGCAACCACGAAG；反向引物3′-5′:ACATAAACCTCTGTCTGTGAGTGC。內(nèi)參甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)正向引物5′-3′:AGGACATGCATGGACACAGA；反向引物3′-5′:GGACGGAATCAACTCTGACA。反應條件：95 ℃ 5 s，85 ℃ 10 s，60 ℃ 25 s，共40個循環(huán)；lncRNA UCA1正向引物：5′-ACGCTAACTGGCACCTTGTT-3′；反向引物：5′-TGGGGATTACTGGGGTAGGG-3′。GAPDH正向引物：5′-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3′；反向引物：5′-GAAGATGGTGGGATTTC-3′。反應條件：90 ℃ 10 s，65 ℃ 20 s，75 ℃ 10 s，共45個循環(huán)。根據(jù)PCR擴增曲線得到Ct值，使用2-ΔΔCt法分析lncRNA HOTAIR、lncRNA UCA1基因相對表達水平。ΔCt=CtHOTAIR-CtGAPDH，ΔΔCt=ΔCt癌組織-ΔCt癌旁組織，UCA1同上。根據(jù)lncRNA HOTAIR、lncRNA UCA1基因相對表達水平是否超過相對表達水平平均值，將腎上腺癌組織分為lncRNA HOTAIR高表達組、lncRNA HOTAIR低表達組及l(fā)ncRNA UCA1高表達組、lncRNA UCA1低表達組。

2 結 果

2.1lncRNA HOTAIR、lncRNA UCA1在不同組織中的相對表達水平比較 腎上腺癌組織中l(wèi)ncRNA HOTAIR、lncRNA UCA1相對表達水平顯著高于癌旁組織(P<0.05)，見表1。

表1 lncRNA HOTAIR、lncRNA UCA1在不同組織中的相對表達水平比較

2.2lncRNA HOTAIR在腎上腺癌組織中的相對表達水平與臨床病理特征的關系 對52例腎上腺癌患者癌組織中l(wèi)ncRNA HOTAIR相對表達水平與臨床病理特征進行分析后發(fā)現(xiàn)，lncRNA HOTAIR相對表達水平與腫瘤最大徑、遠處轉(zhuǎn)移、TNM分期有關(P<0.05)，腫瘤最大徑大、發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移、TNM分期晚的患者lncRNA HOTAIR相對表達水平增高；lncRNA HOTAIR相對表達水平與性別、年齡、單發(fā)或多發(fā)、包膜浸潤、分化程度無關(P>0.05)。見表2。

表2 lncRNA HOTAIR在腎上腺癌組織中的相對表達水平與臨床病理特征的關系[ n(%)]

2.3lncRNA UCA1在腎上腺癌組織中的相對表達水平與臨床病理特征的關系 對52例腎上腺癌患者癌組織中l(wèi)ncRNA UCA1相對表達水平與臨床病理特征進行分析后發(fā)現(xiàn)，lncRNA UCA1相對表達水平與腫瘤最大徑、遠處轉(zhuǎn)移、包膜浸潤、TNM分期有關(P<0.05)，腫瘤最大徑大、發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移和包膜浸潤、TNM分期晚的患者lncRNA UCA1相對表達水平顯著增高；lncRNA HOTAIR相對表達水平與性別、年齡、單發(fā)或多發(fā)、分化程度無關(P>0.05)。見表3。

表3 lncRNA UCA1在腎上腺癌組織中的相對表達水平與臨床病理特征的關系[ n(%)]

3 討 論

腎上腺是人體最重要的內(nèi)分泌腺體之一，分泌皮質(zhì)醇類、兒茶酚胺類、醛固酮類等多種具有重要調(diào)節(jié)功能的激素[5]。遺傳、基因突變等原因能夠?qū)е履I上腺癌變，由于患者可表現(xiàn)為不同類型的臨床癥狀和體征，診斷難度顯著提高。隨著影像學技術的不斷發(fā)展和應用，腎上腺癌診斷成功率大幅增加，但是該病起病隱匿，早期缺乏特異性癥狀，尤其是惡性嗜鉻細胞瘤，其癥狀、體征、影像學檢查、實驗室檢查等方面檢查結果均與腎上腺良性腫瘤相似[6]，多數(shù)腎上腺癌患者一般發(fā)現(xiàn)已經(jīng)處于中晚期，已經(jīng)失去最佳治療時機，且中晚期患者治療效果不佳，復發(fā)率高，易發(fā)生轉(zhuǎn)移，5年生存率較低[7]。因此，早期診斷和治療對于腎上腺癌患者意義重大。癌癥屬于多因素、多階段發(fā)生、發(fā)展的疾病，目前對于腎上腺癌的確切發(fā)病機制尚未完全明確。腫瘤抗原和異位激素是目前常用的腫瘤標志物，然而傳統(tǒng)的腫瘤標志物存在靈敏度和特異度不高，漏診和誤診概率較大等不足。尋找一個腫瘤早期診斷、預后判斷及治療的新的分子標志物是臨床研究的熱點。

lncRNA是一類轉(zhuǎn)錄本長度超過200個核苷酸的RNA分子[8]，自身缺乏編碼蛋白的能力，定位于細胞核和/或細胞質(zhì)[9]。最初缺乏對lncRNA數(shù)量、種類和功能的了解，將其稱之為基因組轉(zhuǎn)錄的“噪音” “暗物質(zhì)” “垃圾DNA”等[10]。隨著對lncRNA的研究不斷深入，研究顯示其廣泛參與多種生物學過程，并能夠通過信號、分子誘餌、支架、導向等多種機制調(diào)控下游靶基因的表達[11]。研究表明，lncRNA在腫瘤發(fā)生及進展的過程中扮演著重要的角色，已經(jīng)成為新的腫瘤標志物的關注焦點[12-13]。

HOTAIR是一種與腫瘤發(fā)生密切相關的lncRNA，其DNA序列位于人類第12號染色體H0xC11基因與H0xC12基因之間[14]。HOTAIR與多種腫瘤的發(fā)生與發(fā)展存在密切聯(lián)系，周懌等[15]研究發(fā)現(xiàn)其在胃癌患者病灶中的表達上調(diào)，張蔚等[16]研究發(fā)現(xiàn)其在婦科癌癥組織中的表達顯著高于正常組織，但在腎上腺癌中的表達研究較少。本研究顯示，腎上腺癌組織中l(wèi)ncRNA HOTAIR相對表達水平顯著高于正常癌旁組織，且lncRNA HOTAIR高表達與腫瘤最大徑、遠處轉(zhuǎn)移、TNM分期有關，提示lncRNA HOTAIR能夠促進腎上腺癌細胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移。UCA1也是一種lncRNA，在膀胱癌、黑色素瘤、結腸癌等惡性腫瘤中被證實表達異常[17-18]。有研究認為，UCA1可以通過mTOR-STAT3 通路或抑制miR-143上調(diào)HK2的表達參與糖代謝的調(diào)節(jié)[19]。本研究證實，lncRNA UCA1在腎上腺癌組織中高表達，且與腫瘤最大徑、遠處轉(zhuǎn)移、包膜浸潤、TNM分期有關，提示UCA1與腎上腺癌的發(fā)生、發(fā)展存在一定的關系，可能能夠作為腎上腺癌生物標志物，為后續(xù)的研究提供一定的試驗基礎。

4 結 論

lncRNA HOTAIR、lncRNA UCA1在腎上腺癌患者癌組織中表達上調(diào)，其相對表達水平與腫瘤大小、轉(zhuǎn)移和分期有關，可能成為腎上腺癌診斷和治療新的分子標志物。檢測lncRNA HOTAIR、lncRNA UCA1在腎上腺癌患者癌組織中相對表達水平有助于腎上腺癌的早期診斷、預后判斷及治療，但尚需更多樣本量的臨床研究證據(jù)對本結論予以佐證。