不同TERT基因狀態(tài)的肝細(xì)胞癌患者的臨床特征及外泌體mRNA表達(dá)譜探索*

郭 琴，周 娟，李 晉，白 玲，宋佳佳，陸小軍，應(yīng)斌武△

(1.四川大學(xué)華西醫(yī)院實驗醫(yī)學(xué)科,四川成都 610041；2.四川省資陽市第一人民醫(yī)院檢驗科，四川資陽 641300)

端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(TERT)是端粒酶的催化組分，其經(jīng)典功能是以端粒酶RNA組分(TERC)為模板，合成端粒DNA，維持端粒穩(wěn)定性，賦予細(xì)胞無限增殖的潛能。正常情況下，TERT被抑制，伴隨著細(xì)胞復(fù)制周期，端粒逐漸縮短，即發(fā)生衰老[1-3]；既往研究表明，腫瘤發(fā)生時，存在多種TERT再激活機制，如啟動子突變、啟動子甲基化、病毒整合、基因重排等[2]。在肝細(xì)胞癌(HCC)中，發(fā)生于TERT啟動子區(qū)(TERTp)的突變和乙型肝炎病毒(HBV)DNA整合已經(jīng)被反復(fù)檢測到，兩者均可誘導(dǎo)TERT的再激活，并增加TERT mRNA的表達(dá)。TERTp突變和HBV-TERTp整合被認(rèn)為是HCC發(fā)展的驅(qū)動因素。然而兩種基因改變方式對HCC致癌作用及臨床特征的影響是否一致尚不明確。本文通過分析TERT基因狀態(tài)與HCC患者臨床特征、實驗室檢查及外泌體mRNA表達(dá)差異的關(guān)系，以期進(jìn)一步了解不同TERT基因改變在HCC發(fā)生、發(fā)展中的作用。

1 資料與方法

1.1一般資料 隨機納入2019年6-12月于四川大學(xué)華西醫(yī)院肝膽外科初次就診且進(jìn)行肝切除術(shù)的HCC患者36例，其中男31例，女5例，平均年齡(56.22±11.59)歲。采集患者術(shù)前外周血及手術(shù)腫瘤組織。納入標(biāo)準(zhǔn)：初治原發(fā)性肝癌(簡稱肝癌)，經(jīng)病理證實為單純HCC，且無其他部位腫瘤者。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并自身免疫性疾病、免疫缺陷疾病者；已知異體器官移植史和異體造血干細(xì)胞移植史者；1個月內(nèi)有輸血史者；近期注射肝素等抗凝藥物者；不能提供知情同意書或拒絕抽血者。本研究由四川大學(xué)華西醫(yī)院臨床試驗和生物醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，所有研究對象均簽署了知情同意書。

1.2腫瘤基因突變及HBV基因組測序 采用QIAamp DNA Mini Kit(德國凱杰)提取腫瘤新鮮組織DNA，采用QIAamp DNA Mini Blood Kit(德國凱杰)提取白細(xì)胞DNA，利用高通量測序技術(shù)，在Gene+2000平臺(中國吉因加)上對腫瘤組織進(jìn)行雜交捕獲建庫測序，納入白細(xì)胞測序進(jìn)行胚系變異過濾，同時對HBV基因組測序，分析腫瘤TERT基因突變及HBV基因整合情況。

1.3外泌體mRNA測序及差異分析 采用exoRNeasy Maxi Kit(德國凱杰)分離外泌體并提取RNA，使用NEB Next Ultra Ⅱ Directional RNA Library Prep Kit for MGI建庫試劑盒建庫，在Gene+2000測序儀上測序。采用edge R軟件進(jìn)行不同TERT狀態(tài)組間差異分析，以差異的顯著性(P-value)<0.05，差異倍數(shù)(Fold Change)>2作為差異顯著性標(biāo)準(zhǔn)，使用DAVID在線網(wǎng)站對差異基因進(jìn)行基因本體(GO)及京都基因與基因組百科全書(KEGG)富集分析。

1.4實驗室指標(biāo)測定 采用羅氏Cobas e601 電化學(xué)發(fā)光免疫分析儀及配套試劑檢測甲胎蛋白(AFP)、癌胚抗原(CEA)，采用富士G1200 全自動免疫分析儀及配套試劑檢測維生素K缺乏或拮抗劑Ⅱ誘導(dǎo)的蛋白(PIVKA-Ⅱ)，采用希森美康XN1000全自動血液分析儀及配套試劑計數(shù)血小板(PLT)、中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞，并計算中性粒細(xì)胞/淋巴細(xì)胞比值(NLR)，采用希森美康CS5100凝血分析儀及配套試劑檢測纖維蛋白原(Fib)，采用羅氏Cobas8000 c702全自動生化分析儀及配套試劑檢測乳酸脫氫酶(LDH)水平。

2 結(jié) 果

2.1TERT基因狀態(tài)與臨床特征及實驗室指標(biāo)的相關(guān)性分析 對36例腫瘤組織標(biāo)本進(jìn)行測序分析，根據(jù)TERT基因狀態(tài)將36例患者分為HBV-TERTp整合組(9例)、TERTp突變組(13例)和無TERT基因整合及突變組(14例)。各組臨床資料及實驗室檢查結(jié)果見表1。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在腫瘤最大徑、有無微血管侵犯方面，HBV-TERTp整合組與另兩組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；年齡、性別構(gòu)成、體質(zhì)量指數(shù)、肝硬化背景，以及AFP、PIVKA-Ⅱ、CEA、NLR、PLT、Fib、LDH水平比較，HBV-TERTp整合組與無TERT基因整合及突變組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，因此將HBV-TERTp整合組與無TERT基因整合及突變組合并為非TERTp突變組。分析發(fā)現(xiàn)：與非TERTp突變組比較，TERTp突變組平均年齡更大，AFP水平、AFP陽性率、NLR更低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；而TERTp突變組腫瘤最大徑更小，PIVKA-Ⅱ、PLT、Fib水平更低，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

表1 不同TERT基因狀態(tài)HCC患者的臨床特征及實驗室指標(biāo)的比較

2.2外泌體mRNA差異分析 外泌體差異mRNA富集分析顯示：HBV-TERTp整合組與無TERT基因整合及突變組間差異基因僅富集到核糖核蛋白復(fù)合體；HBV-TERTp整合組與TERTp突變組間差異基因僅富集到神經(jīng)肽信號通路；TERTp突變組與無TERT基因整合及突變組間、TERTp突變組與非TERTp突變組間差異基因均明顯富集到線粒體相關(guān)的生物過程(BP)、細(xì)胞組分(CC)及分子功能(MF)，如氧化磷酸化、呼吸電子傳輸鏈、ATP代謝過程、線粒體ATP合成耦合電子轉(zhuǎn)運等，且TERTp突變組與非TERTp突變組間差異基因富集結(jié)果P值更?。籘ERTp突變組與非TERTp突變組間差異基因的富集分析結(jié)果分別見圖1、圖2。

注：*為參與富集的差異基因數(shù)(P值)。

注：*為參與富集的差異基因數(shù)(P值)。

3 討 論

在全球，HCC是常見惡性腫瘤，占癌癥相關(guān)死因中的第四位[4]。HCC已知的危險因素包括慢性肝炎病毒感染、酗酒、非酒精性肝病、黃曲霉素等[1,5]。多數(shù)HCC患者確診時已處于中晚期，治療選擇有限，使得HCC的病死率與發(fā)病率之比高達(dá)0.95[6]。對HCC發(fā)病機制的分子研究有助于早期診斷或探索更多的治療方式。

本研究納入36例初治并行肝切除術(shù)的HCC患者，通過對腫瘤組織進(jìn)行腫瘤相關(guān)基因及HBV基因組的測序分析，鑒定出HBV-TERTp整合9例，TERTp突變13例，無TERT基因整合及突變14例。TERTp突變與HBV-TERTp整合具有排他性，且發(fā)生突變的患者年齡更大,這與其他報道一致[2,7-9]。

本研究發(fā)現(xiàn)，HBV-TERTp整合組與無TERT基因整合及突變組間的臨床特征及實驗室結(jié)果更為相似，而TERTp突變組與前述兩組多個指標(biāo)比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，因此，將HBV-TERTp整合組與無TERT基因整合及突變組合并為非TERTp突變組進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)TERTp突變組患者AFP水平、AFP陽性率、NLR更低(P<0.05)，腫瘤最大徑、PIVKA-Ⅱ、PLT、Fib水平也表現(xiàn)出更低的趨勢。

以AFP大于20 ng/mL為陽性判斷標(biāo)準(zhǔn)[10]，AFP陽性率在不同TERT基因狀態(tài)HCC患者中存在顯著差異，TERTp突變組AFP陽性率僅為30.8%，明顯低于非TERTp突變組(73.91%)，這表明AFP作為啟動子突變HCC患者的腫瘤篩查指標(biāo)時，更容易漏檢。AFP不僅是腫瘤診斷標(biāo)志物，亦被認(rèn)為在肝癌發(fā)展過程中對血管生成和細(xì)胞侵襲起調(diào)節(jié)作用，AFP可以通過Fas/FasL，Caspase-3和PI3K/AKT信號通路促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖并調(diào)節(jié)肝癌細(xì)胞的凋亡，沉默AFP基因可導(dǎo)致血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、金屬蛋白酶的表達(dá)量顯著下調(diào)[11-12]，AFP水平與不良預(yù)后相關(guān)[10]。PIVKA-Ⅱ又叫異常凝血酶原(DCP)，其結(jié)構(gòu)中包含兩個環(huán)形結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域與肝細(xì)胞生長因子相似，可通過激活DCP-Met-JAK1-STAT3信號通路刺激HCC生長[13-14]，PIVKA-Ⅱ還可誘導(dǎo)表皮生長因子受體(EGFR)和VEGF在人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)中的過表達(dá)，提高肝癌組織周圍的成血管作用[15-16]。中性粒細(xì)胞能夠參與腫瘤微環(huán)境的調(diào)節(jié)，增強腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移、血管生成及細(xì)胞外基質(zhì)重塑；PLT可以為中性粒細(xì)胞的募集提供趨化信號，并為腫瘤的擴散提供黏著位點，保護腫瘤細(xì)胞免受免疫攻擊[17]，術(shù)前外周血PLT計數(shù)與HCC患者預(yù)后呈負(fù)相關(guān)[18]；Fib可以轉(zhuǎn)化為纖維蛋白，與PLT、腫瘤細(xì)胞一起形成微血栓，并覆蓋在腫瘤細(xì)胞外，以對抗宿主免疫監(jiān)視[19]。TERTp突變組與非TERTp突變組間的臨床及實驗室結(jié)果差異，預(yù)示TERTp突變HCC侵襲性更弱，也提示不同TERT狀態(tài)HCC的致癌機制可能存在差異。

為進(jìn)一步探究不同TERT基因改變在HCC發(fā)生、發(fā)展過程中的潛在作用差異，本課題組對患者外周血外泌體內(nèi)的mRNA進(jìn)行了測序分析。外泌體是最大徑為30～100 nm的由胞吐作用釋放到細(xì)胞外的脂質(zhì)雙層囊泡，含有其起源細(xì)胞的各種分子，包括蛋白質(zhì)和核酸等，可反映其來源細(xì)胞的分子特征,也可作為細(xì)胞間信息交流的載體[20]，外泌體已被證實廣泛參與免疫抗原呈遞、腫瘤的生長與遷移、組織損傷的修復(fù)等過程[21]。本研究外泌體mRNA表達(dá)譜發(fā)現(xiàn)，TERTp突變組與非TERTp突變組間的差異基因主要富集到線粒體氧化磷酸化等生物過程，參與富集的基因在TERTp突變組上調(diào)，提示TERTp突變組HCC患者線粒體相關(guān)代謝活動增加。文獻(xiàn)報道，TERT也存在于線粒體內(nèi)，TERT能增加腫瘤細(xì)胞的適應(yīng)能力，提高線粒體活性，并對抗凋亡[3]，線粒體TERT可以通過結(jié)合線粒體DNA發(fā)揮保護功能，從而增加呼吸鏈活動并防止氧化應(yīng)激引起的損害[22]。TERT還可以通過增加還原型谷胱甘肽與氧化型谷胱甘肽的比例，將氧化的過氧化物酶還原成其非氧化形式，增強細(xì)胞抗氧化防御系統(tǒng)，減輕細(xì)胞水平，并賦予癌細(xì)胞逃避死亡刺激的能力[23]。因此，推測TERTp突變驅(qū)動肝癌發(fā)生可能是通過增強線粒體代謝等方式獲能以促進(jìn)腫瘤增殖，抗氧化治療可能是TERTp突變肝癌患者有效的治療途徑，但具體機制尚不清楚，還需進(jìn)一步研究。

4 結(jié) 論

TERTp突變與非TERTp突變患者的臨床特征存在顯著差異，TERTp突變患者年齡更大，且具有更溫和的實驗室特征；TERTp突變患者AFP陽性率低，采用AFP作為腫瘤篩檢指標(biāo)，可能會造成漏檢；TERTp突變可能通過增強線粒體代謝等方式獲能以促進(jìn)腫瘤增殖，抗氧化治療可能是TERTp突變肝癌患者有效的治療途徑。