從物質(zhì)分離到微流控芯片技術(shù)

劉閃閃，魏釗陽,陳硯美，甘喜武，付 軍，張萬舉

(1. 黃岡師范學(xué)院 化學(xué)化工學(xué)院，湖北 黃岡 438000; 2. 黃岡市教育局，湖北 黃岡 438000； 3. 湖北省黃岡中學(xué)，湖北 黃岡 438000)

物質(zhì)的純度是反映物質(zhì)品質(zhì)的一個(gè)重要指標(biāo)，例如生活中離不開的食用級食鹽、實(shí)驗(yàn)室中的分析純化學(xué)藥品、治病所用的醫(yī)學(xué)藥品及生產(chǎn)計(jì)算機(jī)芯片所需的高純硅等都對物質(zhì)的純度有很高要求，因此研究物質(zhì)的分離提純方法具有重要的現(xiàn)實(shí)意義?；谖镔|(zhì)的物理性質(zhì)及生化性質(zhì)的差異對目標(biāo)物進(jìn)行分離提純是中學(xué)化學(xué)科學(xué)實(shí)驗(yàn)探究活動中的一個(gè)重要指導(dǎo)思想，具體的一些分離提純操作包括過濾、滲析、結(jié)晶、萃取、蒸餾等。利用過濾操作，我們可以提純含有少量泥沙的粗鹽；利用重結(jié)晶，我們可以分離含有少量氯化鉀的硝酸鉀粉末；利用萃取操作，我們可以提取碘水中的碘等。在氫氧化鐵膠體的制備實(shí)驗(yàn)中，當(dāng)我們想要除去氫氧化鐵膠體中的未完全反應(yīng)的氯離子時(shí)，可以通過滲析操作，利用半透膜對氯離子的選擇性透過，達(dá)到凈化提純膠體的目的。那如果想要除去一名腎功能惡化的尿毒癥患者的血液中的代謝廢物，可以采取什么辦法呢？血液透析！血液透析就是利用滲析的原理，將血液看做膠體，將血液中的代謝廢物和電解質(zhì)看做可以透過半透膜的小分子或離子，通過滲析操作，將代謝廢物分離并清除，從而發(fā)揮人工腎臟的作用。由此可見，我們看似簡單的化學(xué)知識卻能發(fā)揮治病救人的大本領(lǐng)，為人們的生命健康做出重要貢獻(xiàn)。

提到生命健康，惡性腫瘤總是一個(gè)繞不開的話題。在癌癥治療過程中，腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移是最常見的標(biāo)志病情惡化的醫(yī)學(xué)現(xiàn)象，這個(gè)現(xiàn)象與循環(huán)腫瘤細(xì)胞(Circulating Tumor Cells, CTCs)有密切關(guān)系。CTCs是從原發(fā)腫瘤或轉(zhuǎn)移腫瘤脫離并進(jìn)入到外周血的腫瘤細(xì)胞，是主要的癌癥標(biāo)志物之一[1-2]。而且，CTC的檢測僅需抽取幾毫升血液，檢測方便、無創(chuàng)，成為診斷腫瘤發(fā)生及轉(zhuǎn)移最直接和重要的方法。但是存在于外周血中的CTCs個(gè)數(shù)極少，每105～107個(gè)血細(xì)胞僅含有一個(gè)CTC[3-4]，且經(jīng)歷了上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的CTCs表型蛋白種類復(fù)雜、生命力及轉(zhuǎn)移能力極強(qiáng)，這些特征嚴(yán)重限制了CTCs的識別、富集及檢測。因此，亟待發(fā)展準(zhǔn)確率高的低豐度CTCs分選富集新方法。那么，如何分離富集外周血樣品中的低豐度循環(huán)腫瘤細(xì)胞呢？從中學(xué)學(xué)習(xí)的物質(zhì)分離方法可以找到答案嗎？過濾！我們把外周血看做氯化鈉溶液，將外周血中含有的極少個(gè)數(shù)的CTCs看做泥沙，利用他們尺寸大小的差異達(dá)到分離的目的。但是，泥沙肉眼可見，而CTCs的尺寸只有幾十微米，并且，我們還需要對收集到的細(xì)胞進(jìn)行形態(tài)分析、蛋白質(zhì)組化信息收集、耐藥性研究等后續(xù)操作。單純用簡單的過濾裝置無法滿足我們的需求，因此，科學(xué)家們發(fā)展了諸多分離純化技術(shù)并應(yīng)用于生命體系中雜志物質(zhì)的有效分離和疾病標(biāo)志物的富集檢測，如構(gòu)建微流控芯片分離富集癌癥病人外周血樣品中的低含量循環(huán)腫瘤細(xì)胞。

微流控芯片的概念起源于1990年瑞士科學(xué)家提出的微全分析系統(tǒng)，是一種在微米級尺度上對微量流體進(jìn)行分析和處理的技術(shù)。微流控芯片以生化分析為基礎(chǔ)，依托微機(jī)電加工技術(shù)和微管道網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，實(shí)現(xiàn)在微小芯片上完成采樣、稀釋、反應(yīng)及檢測等常規(guī)生化實(shí)驗(yàn)[5]。相比較于傳統(tǒng)的物質(zhì)分離富集方法，微流控芯片具有微型化、集成化、自動化及高效率等優(yōu)點(diǎn)，在分析化學(xué)、生命科學(xué)、臨床醫(yī)學(xué)、藥物篩選、食品分析、司法鑒定等領(lǐng)域引起了廣泛的關(guān)注。自2015年美國總統(tǒng)奧巴馬提出“精準(zhǔn)醫(yī)療計(jì)劃”后，微流控芯片在生命科學(xué)領(lǐng)域尤其是細(xì)胞富集檢測的應(yīng)用研究得到了更廣泛的推廣。

1 基于微流控芯片的細(xì)胞富集分離方法

研究物質(zhì)性質(zhì)，探究反應(yīng)規(guī)律，基于此選擇物質(zhì)分離檢測方法。因此，高效分離富集CTCs離不開對其理化性質(zhì)的深度了解。研究對象CTCs與其共存物的主要差異包括兩大方面，物理性質(zhì)和生化性質(zhì)。物理性質(zhì)的主要差異是CTCs比其他共存細(xì)胞如紅細(xì)胞、白細(xì)胞、血小板等的尺寸大，其他密度、力學(xué)、介電性質(zhì)、變形性都有差異。因此根據(jù)物理性質(zhì)的差異，選擇物質(zhì)分離實(shí)驗(yàn)方法，進(jìn)而具體設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)方案，探究實(shí)驗(yàn)結(jié)果。除了物理方法之外，掌握CTCs與正常細(xì)胞的生化性質(zhì)差異也可利于發(fā)展新的分離富集方法。相比于正常細(xì)胞，CTCs細(xì)胞膜表面表達(dá)大量的上表皮粘附因子及細(xì)胞角蛋白等抗原，而正常細(xì)胞則不表達(dá)這些抗原?？乖c抗體可以特異性識別，利用這種差異，在過濾裝置中引入抗體，CTCs就可被抗體牢牢抓住，其他細(xì)胞順利通過芯片通道，從而達(dá)到與其他細(xì)胞正常分離以及富集CTCs的目的。

2 基于物理性質(zhì)差異的分離法

含有循環(huán)腫瘤細(xì)胞的外周血樣品的主要成分包括紅細(xì)胞、白細(xì)胞、血小板和少量CTCs。CTCs的細(xì)胞直徑為13～25 μm，比紅細(xì)胞、白細(xì)胞及血小板的體積大，因此可基于細(xì)胞尺寸的差異，通過在微流控芯片上設(shè)計(jì)孔徑合適的過濾裝置達(dá)到分離富集的效果[6]，實(shí)現(xiàn)低成本、快速、簡便的高通量檢測方法。

Chen等[7]基于PDMS利用光刻蝕技術(shù)設(shè)計(jì)直徑大約18～22 μm, 深度5～8 μm的三維孔洞結(jié)構(gòu)的微流控芯片分離富集外周血樣品中的循環(huán)腫瘤細(xì)胞。但是，體積較小的干擾共存物在重力及渦旋外力的作用下有較大可能優(yōu)先占據(jù)孔洞，從而導(dǎo)致了目標(biāo)細(xì)胞的流失，得到較低純度的目標(biāo)細(xì)胞樣品。為了避免目標(biāo)細(xì)胞的流失，Tan等[8]構(gòu)建月牙形微陣列模式，月牙錯(cuò)位排列，留出5 μm寬度縫隙，從而有效截留大體積的目標(biāo)CTCs細(xì)胞。由于外周血樣品中同樣存在個(gè)別體積較大的白細(xì)胞等，因此該方法截留的目標(biāo)細(xì)胞樣品純度也會受到影響。此外，基于細(xì)胞尺寸大小的多數(shù)過濾式微流控芯片在工作過程中會由于濾膜堵塞及流動壓力而破壞細(xì)胞活性，進(jìn)而影響后續(xù)分析。

Zhou等[9]構(gòu)建雙層過濾芯片(圖1)，精細(xì)設(shè)計(jì)孔洞大小、排列間距及層間隙，使得小體積的白細(xì)胞、紅細(xì)胞等物質(zhì)通過小規(guī)格孔洞進(jìn)入層間隙，從而與大體積循環(huán)腫瘤細(xì)胞分離，層間空隙的存在極大的減小了芯片中通過的液體縮產(chǎn)生的壓力，進(jìn)而有效保護(hù)截留的循環(huán)腫瘤細(xì)胞的活性。

圖1 微流控芯片裝置橫切圖及單元模型三維視圖Fig. 1 Crosscutting diagram of microfluidic chip device and three-dimensional view of unit model

Loutherback等[10]基于流體力學(xué)設(shè)計(jì)了確定性側(cè)向位移芯片(圖2)，在左側(cè)入口處注入外周血樣品，各成分沿通道從左向右移動，在移動過程中，不同尺寸的細(xì)胞受到的阻力和側(cè)向位移力不同。在這些力的綜合作用下，較大體積的細(xì)胞橫向移動到通道一側(cè)，較小體積的紅細(xì)胞及白細(xì)胞沿著流體方向正常移動，最終實(shí)現(xiàn)分離富集CTCs的目的。此外，利用不同成分的介電常數(shù)性質(zhì)的差異，在外電場作用下也可以實(shí)現(xiàn)CTCs的分離富集。

圖2 基于確定性側(cè)向位移構(gòu)建微流控芯片原理圖Fig. 2 Schematic diagram of microfluidic chip based on deterministic lateral displacement

上述這些工作都是利用CTCs的物理性質(zhì)差異進(jìn)行分離富集，但是通過對實(shí)驗(yàn)過程的把控和得到的結(jié)果的分析對比，總結(jié)出了利用物理性質(zhì)差異進(jìn)行分離的兩個(gè)固有缺點(diǎn)：一是外周血樣品中存在的白細(xì)胞往往體積也較大，其細(xì)胞直徑范圍與CTCs常有重疊，因此僅通過細(xì)胞尺寸大小差異設(shè)計(jì)芯片截留的細(xì)胞樣品純度難以保證；二是CTCs 的變形性大，在外力作用下極有可能發(fā)生變形從而通過小孔道流失，造成假陰性結(jié)果?；谏鲜鼋Y(jié)果的分析討論，我們可以得出結(jié)論，單純利用物理性質(zhì)差異分離富集的效果有待提高。為了提高分離的準(zhǔn)確率和收集的細(xì)胞樣品純度，我們需要在過濾裝置中錨定具有特異性識別和捕獲能力的物質(zhì)，利用細(xì)胞表面表達(dá)蛋白的特殊性進(jìn)行分選。

3 基于生物性質(zhì)的親和分離法

從腫瘤組織脫落而進(jìn)入到外周血的循環(huán)腫瘤細(xì)胞與正常細(xì)胞相比，細(xì)胞膜表面表達(dá)較多的上表皮粘附因子(Epithelial Cellular Adhesion Molecule, EpCAM)，外周血中白細(xì)胞表現(xiàn)CD45高表達(dá)[11]，因此可基于這些標(biāo)志物的表達(dá)差異對CTCs進(jìn)行有效分選。

Adams等[12]利用修飾了羧酸基團(tuán)的甲基丙烯酸甲酯制備表面粗糙的芯片基底，通過酰胺縮合反應(yīng)連接anti-EpCAM抗體制備高通量微流控芯片，當(dāng)外周血樣品經(jīng)過微流控芯片時(shí)，芯片上修飾的anti-EpCAM抗體與液體樣品中表達(dá)了EpCAM抗原的細(xì)胞識別并結(jié)合，從而實(shí)現(xiàn)對腫瘤細(xì)胞的分選富集。該法的細(xì)胞分離效果明顯高于單純利用細(xì)胞尺寸差異的分離方法，但外周血樣品流經(jīng)芯片時(shí)，受外力作用，部分細(xì)胞會處于中流層更甚者于上層，處于中流層及上流層的細(xì)胞將難以于芯片上的抗體接觸，無法被芯片表面抗體順利捕獲，這將顯著降低CTCs的回收率。為了提高捕獲率，Wang等[13]利用氫氟酸刻蝕工藝制備硅納米孔基底，在硅納米柱上修飾anti-EpCAM抗體，增加抗體與細(xì)胞的接觸機(jī)率，從而達(dá)到分選富集的目的。相比較于平板硅片基底，該方法中的納米柱基底對細(xì)胞的捕獲效率增加了十倍左右。Stoot[14]等構(gòu)建魚骨形芯片，利用非對稱通道及非均勻深度溝壑產(chǎn)生的渦流增加細(xì)胞與抗體的接觸機(jī)率，達(dá)到93%的回收率。

利用細(xì)胞表面的EpCAM與芯片修飾的抗體的特異性識別進(jìn)行實(shí)際樣品檢測時(shí)，通常會存在假陰性現(xiàn)象。由于腫瘤細(xì)胞在入侵血管和淋巴系統(tǒng)時(shí)，會經(jīng)歷上皮-間葉轉(zhuǎn)換(Epithelial Mesenchymal Transitions，EMT)過程，使得細(xì)胞表面的上皮組織標(biāo)志物下調(diào)或者缺失，取而代之的是更多表達(dá)間葉組織標(biāo)志物，因此單純利用EpCAM與抗體識別作用的捕獲效果嚴(yán)重受限。為了解決這一現(xiàn)實(shí)問題，研究學(xué)者們巧妙利用了核酸適配體設(shè)計(jì)微流控芯片。核酸適配體(Aptamer)是一種具有高親和力可特異性識別目標(biāo)物的寡核苷酸單鏈，它具有合成簡單、性質(zhì)穩(wěn)定、與目標(biāo)物結(jié)合力強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)。Sheng 等[15]在微流控芯片通道中連接修飾了核酸適配體的金納米顆粒用于捕獲CTCs, 得到了高于90%的分選富集效率。Sheng等[16]在含有59000個(gè)以上的微米柱的基底材料上修飾核酸適配體捕獲CTCs，目的細(xì)胞的捕獲率達(dá)到95%(圖3)。

圖3 基于核酸適配體的微流控芯片的構(gòu)建Fig. 3 Schematic diagram of microfluidic chip based on aptamer

微流控芯片在分離富集及檢測外周血中循環(huán)腫瘤細(xì)胞方面發(fā)揮著重要的作用，這也已經(jīng)成為檢測循環(huán)腫瘤細(xì)胞的最可靠方法之一。微流控芯片是一種重要的新一代生物醫(yī)學(xué)技術(shù)，特別是在生物傳感、藥物篩選、組織工程、人體器官修復(fù)、靶向治療等領(lǐng)域發(fā)揮越來越大的作用。

4 總結(jié)與展望

循環(huán)腫瘤細(xì)胞的分離富集對癌癥的無痛檢測、預(yù)后分析和個(gè)性化治療具有重要意義。結(jié)合循環(huán)腫瘤細(xì)胞的理化性質(zhì)和分離純化技術(shù)，本文列舉了微流控芯片在循環(huán)腫瘤細(xì)胞分選富集方面的突出成果及研究進(jìn)展。微流控芯片如同一個(gè)根據(jù)目標(biāo)物的特殊性質(zhì)而設(shè)計(jì)的結(jié)構(gòu)精細(xì)、功能多樣化的微量自動化過濾裝置，科研工作者們從問題出發(fā)，分析目標(biāo)物的理化性質(zhì)，基于此對微流控芯片進(jìn)行的巧妙設(shè)計(jì)，從而在人類生產(chǎn)、生活和生命醫(yī)學(xué)研究中發(fā)揮更大作用，推動化學(xué)科學(xué)在人類健康方面展現(xiàn)重要價(jià)值。