黃花蒿揮發(fā)油對赤擬谷盜成蟲和幼蟲的生物活性研究

程 昉 邵亞洲 楊盈盈 劉芯瑩 王婧婧 賈凌云 梁俊玉

(西北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，蘭州 730070)

赤擬谷盜Triboliumcastaneum屬鞘翅目擬步甲科，又稱擬谷盜，是一種遍及全世界的重要儲糧害蟲，涉及谷物、油料、中藥材及動物性產(chǎn)品等。它食性廣，壽命長，適應(yīng)性強，繁殖迅速[1,2]。赤擬谷盜主要為害面粉，其有臭腺分泌臭液，使小麥粉等發(fā)生霉腥味(主要使小麥粉水分上升，黏度、蛋白含量下降)，分泌物還包含致癌物苯醌[3]。幼蟲蛀食貯存期的煙葉和茶葉，且導(dǎo)致霉變，也可蛀入糧粒等貯藏物內(nèi)取食，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟損失[4]。

長期、過量使用化學(xué)殺蟲劑容易造成害蟲對此類殺蟲劑產(chǎn)生嚴(yán)重的抗性。同時多種化學(xué)殺蟲劑在使用過程中有殘留，并通過食物鏈和生物富集作用進(jìn)入人體，危害人類健康[5]。植物源殺蟲劑，直接利用或提取植物的根、莖、葉、花、果、種子等或利用其次生代謝物質(zhì)制成具有殺蟲作用的活性物質(zhì)[6,7]。相比之下，植物源殺蟲劑綠色環(huán)保，且用量低、易降解，對哺乳動物危害小，可作為防治倉儲害蟲的措施之一[8,9]。近年來，植物源殺蟲劑的研究和開發(fā)受到越來越多的重視，天然植物精油對部分昆蟲和倉儲害蟲具有驅(qū)避和熏殺作用，可以作為安全低毒的天然驅(qū)避劑和熏殺劑[10-12]。

黃花蒿Artemisiaannua是菊科蒿屬植物，分布于中國全境，以及歐洲、亞洲的溫帶、寒帶和亞熱帶地區(qū)，生境適應(yīng)性強[13-15]。目前國內(nèi)外對黃花蒿的研究涉及抗瘧有效成分—青蒿素[16-18]、黃花蒿的抑菌和抗氧化活性[19,20]以及黃花蒿揮發(fā)油的成分分析及活性測試等。黃花蒿揮發(fā)油主要利用水蒸氣蒸餾法提取，并采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀分析其化學(xué)成分[21]，而黃花蒿揮發(fā)油主要是對植物害蟲(菜蚜等)進(jìn)行生物活性測試[22-23]。本實驗研究了黃花蒿揮發(fā)油的化學(xué)成分及其對赤擬谷盜成蟲和幼蟲的觸殺和驅(qū)避活性，為蒿屬植物揮發(fā)油防治糧食倉儲害蟲提供參考。

1 材料與方法

1.1 植物材料和揮發(fā)油提取

黃花蒿于2017年8月采自甘肅省蘭州市安寧區(qū)(海拔1 503 m，東經(jīng)102° 35′ 58″E，北緯35° 34′ 20″N)。將黃花蒿的新鮮葉片切碎，取500 g放入揮發(fā)油提取器中進(jìn)行提取6 h。油水經(jīng)正己烷(分析純)溶劑萃取，無水硫酸鈉脫水處理后過濾，減壓濃縮至不含溶劑，得到無色揮發(fā)油4.5 mL。將揮發(fā)油放至密封容器中并于4 ℃冰箱中保存。

1.2 試蟲飼養(yǎng)

將赤擬谷盜飼養(yǎng)在小麥粉和酵母粉比例為10∶1，容積為0.5 L的玻璃瓶中，溫度為(29±1)℃，相對濕度為70%～80%。待其羽化為成蟲1～2周后，取出進(jìn)行活性實驗。對于幼蟲，選擇6日齡幼蟲進(jìn)行活性研究。

1.3 揮發(fā)油的GC-MS分析

本實驗采用安捷倫6890 N氣相色譜(FID檢測器)和安捷倫5973 N型質(zhì)譜聯(lián)用分析揮發(fā)油的化學(xué)組分。實驗中采用的色譜柱為HP-5MS型(30 m×0.25 mm×0.25 μm)，升溫程序為60 ℃開始并保持2 min，然后以10 ℃/min速度升到180 ℃并保持1 min，再以20 ℃/min速度升到280 ℃并保持15 min；1 μL樣品(用正己烷稀釋到1%)被注射到氣相色譜儀中，分流比為1∶10；載氣為氦氣，流速為1.0mL/min。通過與NIST數(shù)據(jù)庫對比來鑒定揮發(fā)油中每種組分，其相對百分含量通過面積歸一法獲得[24]。

1.4 觸殺活性

根據(jù)參考文獻(xiàn)[25,26]的方法測定黃花蒿揮發(fā)油對赤擬谷盜的觸殺活性。將成蟲或幼蟲放在培養(yǎng)皿中置于冰袋上，然后用移液槍取0.5 μL樣品的正己烷稀釋液滴于停止行動的試蟲前胸背板上(幼蟲直接滴于其背上)，處理后放入直徑2.5 cm，高5.5 cm的玻璃瓶中。正己烷為空白對照組，除蟲菊素(純度27%，質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.2%、0.1%、0.05%、0.025%、0.012 5%)和阿維菌素(純度99.2%，質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為15%、3%、0.6%、0.12%、0.024%)分別作為成蟲和幼蟲的陽性對照組，各樣品設(shè)置5個質(zhì)量分?jǐn)?shù)梯度(成蟲：5.2%、7.9%、11.8%、17.9%、26%、40%；幼蟲：5.9%、8.88%、13.3%、20%、30%)，每個質(zhì)量分?jǐn)?shù)重復(fù)5次，每次重復(fù)試蟲10頭。處理后置于溫度(29±1)℃，相對濕度為70%～80%的恒溫培養(yǎng)箱中暗培養(yǎng)24 h，觀察記錄死亡情況，并計算死亡率與校正死亡率。采用 SPSS22.0統(tǒng)計軟件分析計算半致死劑量LD50(μg/頭)。

死亡率=(死蟲數(shù)/試蟲數(shù))×100%

校正死亡率=[(處理組死亡率-對照組死亡率)/(1-對照組死亡率)]×100%

1.5 驅(qū)避實驗

根據(jù)參考文獻(xiàn)[27,28]方法測定黃花蒿揮發(fā)油對赤擬谷盜的驅(qū)避活性。用正己烷溶解揮發(fā)油，將黃花蒿揮發(fā)油制成5個連續(xù)濃度(0.5%、0.1%、0.02%、0.004%、0.000 8%)梯度的溶液。取與培養(yǎng)皿(直徑9 cm，高1.9 cm)底相同直徑的濾紙，沿中線對半剪開，一半滴加500 μL稀釋溶液，另一半滴加等量正己烷做為空白對照。等溶劑自然揮發(fā)后，立即用固體膠將處理過的濾紙相向緊貼在培養(yǎng)皿底部，注意粘牢不留縫隙，以防止試蟲鉆到濾紙下面，影響觀察。將20頭試蟲從培養(yǎng)皿中央投入，迅速蓋上培養(yǎng)皿蓋子并密封。不同濃度的樣品同法處理5個平行樣。同時以避蚊胺(DEET，純度99%，濃度分別為78.63、15.73、3.15、0.63、0.13 nL/cm2)作為陽性對照。在2、4 h后觀察統(tǒng)計出現(xiàn)在不同區(qū)域內(nèi)的試蟲數(shù)量，計算驅(qū)避率。

驅(qū)避率(PR)用下列方程式計算：

PR=[(Nc-Nt)/(Nc+Nt)]×100%

其中，Nc為出現(xiàn)在陰性對照區(qū)域的試蟲數(shù)量，Nt為出現(xiàn)在實驗組區(qū)域的試蟲數(shù)量，計算出PR的平均值。

1.6 數(shù)據(jù)分析

校正死亡率的數(shù)據(jù)利用Abbott公式計算出。采用SPSS V22.0統(tǒng)計軟件分析計算觸殺的半數(shù)致死量。在驅(qū)避實驗中，斜率和標(biāo)準(zhǔn)誤的值由 Excel 2007軟件計算得出。

2 結(jié)果與分析

2.1 黃花蒿揮發(fā)油的化學(xué)組分

從黃花蒿揮發(fā)油中鑒定出31種化合物，其主要組分為蒿酮13.2%，β-芹子烯12.3%，樟腦12.2%，桉葉油醇10.3%，結(jié)果見表1。

表1 黃花蒿揮發(fā)油化學(xué)組分及其相對含量

續(xù)表

據(jù)報道，江西永修野生黃花蒿花揮發(fā)油的得率為0.98%，其化學(xué)成分主要為桉油精(18.86%)、樟腦(16.55%)、α-愈創(chuàng)木烯(6.82%)、大根香葉烯(6.74%)、石竹烯(5.97%)、順式-乙酸菊花烯酯(5.45%)[29]。河南省黃花蒿采于8月，其揮發(fā)油得率為0.46%，主要成分為蒿酮(46.654%)、桉油精(13.422%)、樟腦(9.648%)[30]。在智亞楠的研究中黃花蒿采于8月，與本實驗樣品幾乎同期，但是其得率遠(yuǎn)低于本實驗黃花蒿。因此推測，黃花蒿揮發(fā)油含量與其生長環(huán)境密切相關(guān)。河南省黃花蒿揮發(fā)油與本實驗的黃花蒿揮發(fā)油的主要成分大致相同，但成分的含量有明顯的差異。江西永修野生黃花蒿揮發(fā)油與本實驗的黃花蒿揮發(fā)油的主要成分相差較大。由此可見，不同產(chǎn)地黃花蒿揮發(fā)油主要成分及含量均有一定的差異，說明地域因素對黃花蒿揮發(fā)油化學(xué)成分有較大的影響。

2.2 觸殺活性

黃花蒿揮發(fā)油對赤擬谷盜成蟲和幼蟲的觸殺活性的結(jié)果見表2。由表2可知，黃花蒿揮發(fā)油對赤擬谷盜成蟲和幼蟲的LD50分別為37.32 μg/頭和70.34 μg/頭。與陽性對照相比，黃花蒿揮發(fā)油對赤擬谷盜成蟲的LD50是除蟲菊素的149.53倍，對赤擬谷盜幼蟲的LD50是阿維菌素的12.33倍。黃花蒿揮發(fā)油對赤擬谷盜成蟲的LD50明顯小于對幼蟲的LD50，因此，黃花蒿揮發(fā)油對赤擬谷盜成蟲的觸殺效果較幼蟲的強。

表2 黃花蒿揮發(fā)油對赤擬谷盜成蟲和幼蟲的觸殺活性

研究表明，赤擬谷盜幼蟲對揮發(fā)油觸殺作用的敏感性隨日齡的增加而增加：12日齡的赤擬谷盜幼蟲對揮發(fā)油毒性的敏感性要弱于成蟲，但是，14～16日齡的赤擬谷盜幼蟲對揮發(fā)油毒性具有與成蟲相同的敏感性[31]。這與本實驗所得的結(jié)論相符：黃花蒿揮發(fā)油對赤擬谷盜幼蟲的觸殺效果較成蟲的弱。與其他基于相同作用方法的植物源揮發(fā)油的生物活性測試相比，黃花蒿揮發(fā)油對赤擬谷盜成蟲的觸殺作用較強。如鞠克升[32]的研究發(fā)現(xiàn)，珠光香青揮發(fā)油對赤擬谷盜成蟲的觸殺LD50為41.25 mg/頭；吳彥等[33]的研究發(fā)現(xiàn)，側(cè)柏葉揮發(fā)油對赤擬谷盜成蟲觸殺的LD50為48.59 μg/頭。本實驗發(fā)現(xiàn)赤擬谷盜幼蟲對黃花蒿揮發(fā)油的敏感性較成蟲弱，這與韓群鑫等[34]的研究發(fā)現(xiàn)赤擬谷盜對丁香酚幼蟲比成蟲更敏感有所不同。

2.3 驅(qū)避活性

黃花蒿揮發(fā)油對赤擬谷盜成蟲和幼蟲的驅(qū)避作用見圖1、圖2。由圖1、圖2可見，黃花蒿揮發(fā)油對赤擬谷盜成蟲具有一定的驅(qū)避活性。黃花蒿揮發(fā)油對赤擬谷盜成蟲在高劑量(78.63、15.73 nL/cm2)下作用2 h和4 h后的驅(qū)避效果與避蚊胺相似，在0.63 nL/cm2下的驅(qū)避效果均弱于避蚊胺，在0.13 nL/cm2下作用2 h的效果反而強于避蚊胺。在作用2 h后，在5個測試濃度下，黃花蒿揮發(fā)油對赤擬谷盜幼蟲的驅(qū)避活性低于避蚊胺活性，作用4 h后，在高劑量(78.63、15.73 nL/cm2)下黃花蒿揮發(fā)油對赤擬谷盜幼蟲的驅(qū)避活性高于避蚊胺活性；而在3.15 nL/cm2下，黃花蒿揮發(fā)油對赤擬谷盜幼蟲的驅(qū)避活性低于避蚊胺活性。這個結(jié)果表明，黃花蒿揮發(fā)油與陽性對照避蚊胺對赤擬谷盜幼蟲具有相近的驅(qū)避作用。由此可見，黃花蒿揮發(fā)油對赤擬谷盜成蟲的驅(qū)避作用比對幼蟲的驅(qū)避作用強。

3 結(jié)論

本實驗通過 GC/MS 分析了黃花蒿揮發(fā)油成分及含量，并通過生物活性篩選發(fā)現(xiàn)黃花蒿揮發(fā)油對赤擬谷盜成蟲和幼蟲均具有良好的觸殺活性和驅(qū)避作用。

雖然黃花蒿揮發(fā)油的作用效果均弱于或相似于陽性對照，但作為糧食倉儲害蟲防治劑，具有對有害生物高效、對非靶標(biāo)生物安全、易分解、綠色無污染等特點，且提取方法簡單，出油率高，資源豐富，在害蟲防治中可作為較理想的化學(xué)農(nóng)藥替代品之一。另外，關(guān)于黃花蒿揮發(fā)油對赤擬谷盜卵的生物活性，對成蟲產(chǎn)卵行為的干擾作用，對害蟲種群的抑制作用以及對赤擬谷盜成蟲和幼蟲的作用機理仍需要進(jìn)一步深入研究，進(jìn)而從根本上解決糧食倉儲害蟲防治的問題。