基于斑馬魚胚胎急性毒性測試預(yù)測食用油毒性可行性研究

朱燕華，王鐘凰，李昱宗，EI-NEZAMI Hani, NORINDER Ulf , COTGREAVE Ian A, DE VITTE Peter, 陳雪平

(1.臺灣食品工業(yè)發(fā)展研究所，臺灣 新竹 30062； 2.長庚學(xué)校財(cái)團(tuán)法人長庚科技大學(xué) 民生學(xué)院保健營養(yǎng)系，臺灣 桃園 33303；3.香港大學(xué) 生物科學(xué)學(xué)院科學(xué)部，香港特別行政區(qū) 999077； 4.卡羅林斯卡學(xué)院 瑞典毒理科學(xué)研究中心，瑞典 斯德哥爾摩 15136； 5.魯汶大學(xué) 制藥和制藥科學(xué)系分子生物發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)室，比利時(shí) 魯汶 3000；6.水中銀(國際)生物科技有限公司，香港特別行政區(qū) 999077)

食用油對維持人體正常的新陳代謝起著極其重要的作用，除為生命體提供能量外，一些重要的脂肪酸(如亞油酸、二十碳五烯酸、二十二碳六烯酸等)是脂溶性維生素的重要載體。一系列食用油污染事件的發(fā)生嚴(yán)重影響消費(fèi)者的健康安全[1-2]。目前對食用油的檢測主要是依賴?yán)砘椒?，如質(zhì)譜、遠(yuǎn)紅外、核磁共振等[3-5]。雖說化學(xué)法檢測食用油具有權(quán)威性和法律效力，但仍有不足[1]。一方面，化學(xué)法只能檢測出已知的有毒物質(zhì)，對未知物質(zhì)的毒性無能為力；另一方面，雖然有些化學(xué)物質(zhì)具有潛在毒性，但由于一些模式生物(如老鼠)生長發(fā)育比較緩慢，短期內(nèi)無法快速有效地預(yù)測食物毒性[6]。因此，亟需研發(fā)一種快速有效的方法用來檢測食用油毒性。

斑馬魚(Danio rerio)擁有人類70%的同源基因以及高達(dá)84%的同源疾病相關(guān)基因,是一個(gè)新的理想的研究人類疾病的模式生物[7]。斑馬魚具有體外受精、產(chǎn)卵量大、胚胎發(fā)育快、通體透明等特點(diǎn),被廣泛應(yīng)用于藥物的毒理評價(jià)和功效預(yù)測[8]。此外，基于斑馬魚胚胎建立的國際經(jīng)濟(jì)合作與發(fā)展組織測試指南236(OECD TG 236)被廣泛用于化學(xué)品的毒性測試和評估[9]。雖然有報(bào)道將油脂注射到斑馬魚胚胎或者用乳化劑處理樣品然后暴露斑馬魚胚胎來檢測油脂的安全性[10]，但是這些方法操作缺乏便利性，不利于大規(guī)模檢測，而且也難保證有毒物質(zhì)被魚胚胎充分吸收。本研究利用斑馬魚胚胎毒性測試來檢測不同來源的豬油(含已知劣質(zhì)油)的毒性，并進(jìn)一步用非靶標(biāo)化學(xué)及計(jì)算分析的方法預(yù)測劣質(zhì)豬油中的毒性成分。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 樣本

7個(gè)豬油樣本來自我國臺灣地區(qū)，包括2個(gè)正常精煉豬油，2個(gè)未精煉地溝豬油，3個(gè)精煉地溝豬油，樣本封樣編號，并匿名提供給實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行單盲提取和斑馬魚胚胎毒性測試實(shí)驗(yàn)，具體樣品名稱和相關(guān)信息在測試完成后提供。樣本采集后在室溫保存。

1.1.2 主要試劑、儀器和軟件

乙腈(CAS No. 75-005-8; 34851，Sigma-Aldrich)、正己烷(CAS No. 110-54-3; 32293, Sigma-Aldrich)、甲醇(CAS No. 67-56-1; 34860, Sigma-Aldrich)，安捷化工(香港)有限公司。

Memmert INE600恒溫培養(yǎng)箱；Millipore Milli-Q Synthesis A10反滲水循環(huán)系統(tǒng)，香港默克公司；96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，美國Corning；XCV-5400氮?dú)飧稍锵到y(tǒng)；Leica MZ 10F體式顯微鏡，香港萊卡公司；高分辨率Q-ExactiveTM復(fù)合四極桿質(zhì)譜儀，美國Thermo Finnigan；Dionex UltiMateTM3000 RS超高效液相色譜(UHPLC)系統(tǒng)，美國Thermo Scientific；Bransonic? 5510超聲儀，香港生物公司；Optima XPN 100離心機(jī)，香港貝克曼庫爾特公司。

CT-link軟件(2017版，http://www.chemotargets.com)；Vega 軟件 (version 1.0.8, http://vega-qsar.eu)的3種不同模式，分別為2.1.12版CAESAR、1.0.6-DEV版SarPy及1.0.0-DEV版Benigni-Bossa Mutagenicity(TOXTREE)，均為在線軟件；Progenesis QI，美國Waters；Ezinfo軟件，瑞典Umetrics。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品處理

豬油與乙腈按體積比1∶3進(jìn)行混合，旋渦振蕩和超聲波處理后5 000g室溫離心10 min。將上清液和正己烷以體積比3∶1進(jìn)行混合，旋渦振蕩和超聲波處理后5 000g室溫離心10 min。上清液于氮?dú)鈿饬飨赂稍锖螅尤胴i油樣本2%體積的甲醇進(jìn)行溶解，得到豬油提取物，-20℃保存?zhèn)溆?。每個(gè)樣本做3次重復(fù)。

1.2.2 魚胚胎急性毒性測試

斑馬魚(AB系)的飼養(yǎng)方法參照OECD TG 236[9]，人工飼養(yǎng)水箱的溫度為(26±1)℃，光周期為14 h光照、10 h黑暗。4～128細(xì)胞期斑馬魚胚胎用于毒理實(shí)驗(yàn)。暴露實(shí)驗(yàn)在96孔板中完成，每個(gè)孔中含有1顆魚胚胎和200 μL不同濃度的豬油提取物或者溶劑對照，每個(gè)濃度用20顆魚胚胎測試。將96孔細(xì)胞板置于26℃恒溫箱中孵育48 h后，于體式顯微鏡下檢查胚胎死亡率并計(jì)算半致死濃度(LC50)。魚胚胎如發(fā)生凝聚，尾部未分離，或者沒有心跳都被判定為死亡。所有實(shí)驗(yàn)和操作都依據(jù)美國國家衛(wèi)生研究院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物指南(No.8023, 1978修訂)并且由香港特區(qū)政府健康署批準(zhǔn)[Refs. (15-10) in DH/HA & P/8/2/5 Pt.3]。

1.2.3 化學(xué)成分分析

豬油提取物成分用高分辨率Q-ExactiveTM復(fù)合四極桿質(zhì)譜儀偶聯(lián)Dionex UltiMateTM3000 RS 超高液相色譜(UHPLC)系統(tǒng)進(jìn)行分析。超高液相色譜系統(tǒng)包括3000 RS泵、WPS-3000 RS 自動(dòng)加樣儀及熱電噴霧(HESI)探針。液相色譜分離使用 Phenomenex Luna? C18色譜柱(150 mm×4.6 mm, 3 μm)，流動(dòng)相A為0.1%醋酸水溶液、流動(dòng)相B為0.1% 醋酸乙腈溶液，洗脫速度200 μL/min。液相色譜梯度洗脫按照如下操作：5%～100% B(0～12 min), 100% B(13～15 min)， 5% B(15～15.1 min)。HESI質(zhì)譜(MS)分析使用氮?dú)庾鳛闅夂煔夂洼o助氣體，正負(fù)離子檢測模式操作參數(shù)為：噴霧電壓3.3 kV; 毛細(xì)管溫度330℃; 輔助氣體加熱溫度60℃, 氣簾氣流速15 mL/min， 輔助氣體流速1 mL/min。質(zhì)譜數(shù)據(jù)取質(zhì)荷比(m/z)100～1 500范圍的數(shù)值，每組數(shù)據(jù)的歸一化碰撞能量分別取35%、70%和100%。液質(zhì)聯(lián)用 (LC-MS) 設(shè)備的分析軟件分別為Progenesis QI和Ezinfo。使用CT-link 軟件預(yù)測有毒成分的結(jié)構(gòu)，用Vega軟件的3種模式(CAESAR，SarPy，Benigni-Bossa Mutagenicity)預(yù)測成分的誘變性。

1.2.4 數(shù)據(jù)分析

斑馬魚胚胎急性毒性測試結(jié)果用Prohibit Analysis軟件計(jì)算LC50(代表樣本急性毒性)。對于化學(xué)成分分析結(jié)果，將各種豬油提取物在同一電荷模式下全質(zhì)譜m/z的分布聚類在一個(gè)圖中，并進(jìn)行多變量成分分析(PCA)。通過PCA散點(diǎn)圖鑒定不同樣本中特定的化學(xué)成分后，用隱結(jié)構(gòu)的正交投影判別分析(OPLS-DA)鑒定高毒性樣本中的特征性m/z離子，有差異的m/z離子被選作相關(guān)S-plot圖(y軸最大值大于0.8)。S-plot的y軸代表組內(nèi)差異標(biāo)記分布的置信值。PCA、OPLS-DA和S-plot軟件為Ezinfo。

2 結(jié)果與分析

2.1 豬油的斑馬魚胚胎急性毒性

豬油樣本經(jīng)過乙腈和正己烷先后提取，用甲醇作為溶劑用于斑馬魚胚胎暴露實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見表1。

由表1可知，正常精煉的豬油(LN1, LN2)毒性比較低，半致死濃度 (LC50) 大于173.3 mL/L, 而未精煉地溝豬油(LT1，LT2)毒性較高，LC50均小于14.3 mL/L，精煉地溝豬油(LT3, LT4, LT5)毒性介于前兩者之間，LC50為21.7～48.3 mL/L。研究表明，LC50值與斑馬魚骨骼畸形、神經(jīng)缺陷、形體非正常等發(fā)育密切相關(guān)，而且與老鼠LD50值呈正相關(guān)，被廣泛用作毒理評價(jià)指標(biāo)[9,11-13]。因此，本研究結(jié)果顯示未精煉地溝豬油和精煉地溝豬油LC50明顯小于正常精煉豬油，意味著地溝油中可能存在有毒物質(zhì)。

表1 豬油樣品的斑馬魚胚胎急性毒性測試結(jié)果

2.2 豬油中潛在有毒物質(zhì)的分析

為了進(jìn)一步闡述不同豬油表現(xiàn)出來的斑馬魚胚胎毒性，我們利用非靶標(biāo)高分辨率LC/MS和多因素分析方法研究低毒樣本(LN1, LC50>173.3 mL/L)、中毒樣本(LT5, LC50=48.3 mL/L)和高毒樣本(LT1, LC50<14.3 mL/L)豬油提取物的化學(xué)成分，結(jié)果見圖1。

圖1 不同斑馬魚胚胎毒性(LC50)的豬油提取物在正、負(fù)離子模式下高分辨LC/MS所得m/z值的PCA

由圖1可以看出，PCA的m/z信號結(jié)果顯示3種豬油提取物存在著明顯的差異。另外從高毒性豬油樣本(LT1)中鑒定出16個(gè)(正離子模式7個(gè)，負(fù)離子模式9個(gè))強(qiáng)度在293.210 9～445.278 6的特征性m/z信號作進(jìn)一步鑒定，結(jié)果見表2。

表2 不同毒性的豬油提取物中的特征性質(zhì)荷比對應(yīng)的潛在化學(xué)物質(zhì)

由表2可知，LT1的相對信號強(qiáng)度在(3.32E+05)%～(1.75E+06)%之間，相比之下，LT5和LN1的相對信號強(qiáng)度分別為10.4%～101.1%和0.6%～16.6%，且LN1的相對信號強(qiáng)度和空白對照比較相似。這些結(jié)果意味著候選m/z表達(dá)特征很可能是高毒樣本中的潛在有毒成分。

2.3 豬油中潛在有毒物質(zhì)的鑒定

我們進(jìn)一步用ChemSpider軟件分析這些候選特征性m/z信號，發(fā)現(xiàn)大部分信號(除了m/z354.285 0和353.229 9)都可以和一些已知的物質(zhì)相匹配，非靶標(biāo)化學(xué)分析顯示一些脂肪酸的衍生物是這些高毒性豬油中的特異性成分(表2)。負(fù)離子模式中，CT-link 軟件分析預(yù)測m/z為311.221 4、309.205 7和329.231 9的3種物質(zhì)最有可能分別是8-{3-[(1E)-3-羥基-1-辛烯-1-醇]-2-環(huán)氧乙烷基}辛酸(表3，圖2A)、9-羥基-11-(3-戊基-2-環(huán)氧乙烷基)-7，10-十一烷二酸(表3，圖2B)或9，10，13-三羥基-11-十八烯酸(表3，圖2C，異構(gòu)體)和乙基 (6R)-6-羥基-6-{(2R,5R)-5-[(1S)-1-羥基己基]4氫-2-呋喃}己酸(表3，圖2D)，這幾種化合物均為脂肪酸的氧化產(chǎn)物。Vega軟件預(yù)測這些脂肪酸氧化產(chǎn)物可能會(huì)削弱線粒體功能，具有細(xì)胞毒性。之前的研究表明一些源自氧化產(chǎn)生的環(huán)氧化合物具有毒性，這些環(huán)氧化合物通過本身的化學(xué)活性或者通過干擾花生四烯酸信號影響細(xì)胞分裂來發(fā)揮其毒性作用[14-16]。因此，地溝油中存在的脂肪酸氧化物可能是影響其毒性的主要物質(zhì)。

表3 豬油提取物中導(dǎo)致斑馬魚胚胎死亡的潛在的毒性成分和結(jié)構(gòu)

圖2 豬油樣本中潛在有毒物質(zhì)的化學(xué)結(jié)構(gòu)

3 結(jié) 論

本研究運(yùn)用斑馬魚胚胎單盲測試不同來源和加工方式程度的豬油樣本的急性毒性，測試結(jié)果LC50值直觀反映出地溝豬油的毒性比較大，其次是精煉的地溝豬油，正常精煉豬油的毒性則比較小。進(jìn)一步非靶標(biāo)高分辨率LC/MS分析找出高毒性樣本的特征性m/z信號，進(jìn)一步由ChemSpider和CP-link軟件分析證實(shí)潛在毒性成分主要為脂肪酸氧化物。因此，本研究建立的用乙腈和正己烷聯(lián)合提取并結(jié)合斑馬魚胚胎測試可以有效地檢測食用油的生物毒性，為食用油的安全性檢測提供了一個(gè)新的解決方案。