麥芽協(xié)同蛋白酶酶解豌豆蛋白產(chǎn)物的功能特性及抗氧化活性

李俊眾，劉曉蘭,3，鄭喜群,3，王雪源

(1.齊齊哈爾大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，黑龍江 齊齊哈爾 161006； 2.黑龍江省玉米深加工理論與技術(shù)重點實驗室，黑龍江 齊齊哈爾 161006； 3.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué) 食品學(xué)院，黑龍江 大慶 163319；4.山東健源生物工程股份有限公司，山東 煙臺 265400)

豌豆蛋白是一種優(yōu)質(zhì)的植物蛋白，具有營養(yǎng)價值高和致敏性低等特點[1]。但豌豆蛋白含有植酸、單寧和多酚化合物等抗營養(yǎng)因子[2]，導(dǎo)致動物消化利用率低，造成蛋白資源浪費，限制了其在食品行業(yè)的應(yīng)用。

目前，有采用商業(yè)蛋白酶改善豌豆蛋白的加工特性、消化性和生物活性的報道[3-6]。李慧等[7]以DPPH·和·OH清除能力為指標，優(yōu)化中性蛋白酶酶解豌豆蛋白酶解條件，提高了酶解物的抗氧化活性。潘芬等[8]研究發(fā)現(xiàn)豌豆蛋白經(jīng)堿性蛋白酶酶解后，其酶解物具有促進益生菌生長的作用。Klost等[9]用胰蛋白酶酶解豌豆蛋白，發(fā)現(xiàn)可提高豌豆蛋白的溶解性和乳化穩(wěn)定性。Barac等[10]采用木瓜蛋白酶酶解豌豆蛋白，改善了豌豆蛋白的溶解性、乳化性及乳化穩(wěn)定性。

蛋白質(zhì)經(jīng)蛋白酶酶解后，疏水性基團暴露，酶解物呈現(xiàn)苦味，影響其在食品行業(yè)的應(yīng)用。且商業(yè)蛋白酶價格較高，導(dǎo)致酶解物生產(chǎn)成本增加。因此，在保持酶解物生物活性的前提下，如何降低酶解物的苦味和減少生產(chǎn)過程中蛋白酶的添加量，是目前亟需解決的問題。

大麥是生產(chǎn)啤酒的主要原料，含有豐富的酶系，如蛋白酶、淀粉酶和纖維素酶等，且大麥發(fā)芽后氨肽酶和羧肽酶的酶活力增長1.5～2.5倍[11]。氨肽酶[12]和羧肽酶[13]等外切蛋白酶具有降低酶解物苦味的作用?？紤]到控制酶解物的苦味值和生產(chǎn)成本，本文以豌豆蛋白為原料，以低的商業(yè)蛋白酶添加量為原則，用麥芽協(xié)同蛋白酶酶解豌豆蛋白，制備酶解物，研究酶解物的功能特性及抗氧化活性，為豌豆蛋白酶解物在食品行業(yè)的應(yīng)用提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

豌豆蛋白(蛋白質(zhì)含量75.28%)，山東健源生物工程股份有限公司；麥芽，中糧麥芽(大連)有限公司；風(fēng)味蛋白酶(3×104U/g)、中性蛋白酶(20×104U/g)、木瓜蛋白酶(60×104U/g)，食品級，南寧東恒華道生物科技有限公司。

DPPH、菲啰嗪，分析純，生物工程(上海)股份有限公司；精煉一級大豆油，市售；其他試劑均為分析純。

PB-10 pH計，梅特勒-托利多(上海)儀器設(shè)備有限公司；ZNCL-GS 智能磁力攪拌器；TU-1810 紫外可見分光光度計，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 豌豆蛋白酶解工藝

根據(jù)本課題組前期實驗，將含10%蛋白質(zhì)的豌豆蛋白溶液調(diào)節(jié)pH至5.5，加入30%(麥芽粉固形物占蛋白質(zhì)的比例)過80目的麥芽粉作為蛋白酶，于50℃酶解3 h，再分別加入風(fēng)味蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶進行二次酶解，具體酶解條件見表1。酶解一定時間后，沸水浴滅酶10 min，冷卻至室溫，4 000 r/min離心15 min，上清液凍干，得到3種酶解物MFH、MNH、MPH，備用。

1.2.2 水解度的測定

采用pH-stat法[14]測定水解度。

1.2.3 酶解物功能特性的測定

參照文獻[15]的方法測定酶解物的溶解性，參照文獻[16]的方法測定酶解物的持水性和持油性，參照文獻[17]的方法測定酶解物的起泡性和泡沫穩(wěn)定性，參照文獻[18]的方法測定酶解物的乳化性和乳化穩(wěn)定性。

1.2.4 酶解物體外消化性的測定

參照文獻[19-20]的方法，采用一步消化法和兩步消化法評價酶解物的體外消化性。

1.2.5 酶解物抗氧化活性的測定

參照文獻[21]的方法測定酶解物的DPPH·清除能力，參照文獻[22]的方法測定酶解物的·OH清除能力。

1.2.6 酶解物苦味評價

參照文獻[23]的方法測定酶解物的苦味。

1.2.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

每個實驗重復(fù)3次，計算平均值和標準差，結(jié)果表示為“平均值±標準差”；數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析采用SPSS 19軟件，顯著性分析采用Duncan檢驗，P<0.05差異顯著；采用GraphPad Prime 8.0.1和Excel軟件進行圖譜繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 麥芽協(xié)同蛋白酶酶解豌豆蛋白產(chǎn)物的溶解性

溶解性是蛋白質(zhì)的重要功能特性之一，也是蛋白質(zhì)起泡性、乳化性和泡沫穩(wěn)定性等功能特性的基礎(chǔ)[24]。良好的溶解性可使蛋白質(zhì)快速且大量分散到溶液中，有利于蛋白質(zhì)向氣-液和水-油界面擴散，提高其表面活性[24]。豌豆蛋白經(jīng)麥芽分別協(xié)同風(fēng)味蛋白酶、中性蛋白酶和木瓜蛋白酶酶解后， 3種酶解物MFH、MNH和MPH在不同pH條件下的溶解性如圖1所示。

由圖1可知，3種酶解物在pH 2～9范圍內(nèi)的溶解性均高于豌豆蛋白。這與郭興鳳等[25]采用堿性蛋白酶酶解豌豆蛋白的研究結(jié)果一致。由于蛋白質(zhì)酶解后形成小分子肽，而小分子肽含有較多的極性基團，可與水形成氫鍵，提高豌豆蛋白的溶解性。在pH 4時，MFH、MNH和MPH的溶解性分別為73.91%、93.48%和88.04%，由于雙酶分步酶解的酶解效率更高，產(chǎn)生的可溶性蛋白含量高，進而增加了豌豆蛋白的溶解性，所以3種酶解物的溶解性均高于郭興鳳等[25]的研究結(jié)果?？蓪?種酶解物作為輔料添加到酸性食品中，如酸奶、發(fā)酵香腸和酸性飲料等，提高食品的營養(yǎng)價值，進而拓展豌豆蛋白的應(yīng)用范圍。

圖1 3種酶解物在不同pH條件下的溶解性

2.2 MFH、MNH和MPH的持水性和持油性

3種酶解物的持水性和持油性如圖2所示。

注：不同字母(小寫字母表示持水性，大寫字母表示持油性)表示具有顯著性差異，P<0.05。

由圖2可知，MFH、MNH、MPH和豌豆蛋白的持水性分別為0.37、1.15、0.13、7.25 g/g，持油性分別為4.63、3.85、5.26、1.36 mL/g。與豌豆蛋白相比，3種酶解物的持水性顯著降低(P<0.05)，持油性顯著升高(P<0.05)。這與王利國等[26]采用堿性蛋白酶酶解大豆分離蛋白的研究結(jié)果一致。一方面，由于蛋白質(zhì)酶解后蛋白質(zhì)分子的空間結(jié)構(gòu)被破壞，暴露出更多的親脂基團，通過疏水作用增強蛋白質(zhì)與油脂的結(jié)合能力；另一方面，可能是蛋白質(zhì)酶解后粒徑變小，對油脂的物理截留作用減弱，表現(xiàn)為酶解物的持水性較差，持油性較強。

2.3 MFH、MNH和MPH的起泡性和泡沫穩(wěn)定性

3種酶解物的起泡性和泡沫穩(wěn)定性如圖3所示。由圖3可知，MFH、MNH、MPH和豌豆蛋白的起泡性分別為34.09%、28.90%、37.79%和29.76%，泡沫穩(wěn)定性分別為34.98%、30.35%、34.32%和53.02%。與豌豆蛋白相比，MFH和MPH的起泡性顯著升高(P<0.05)，MNH的起泡性無顯著差異，3種酶解物的泡沫穩(wěn)定性均顯著降低(P<0.05)。由于MNH的水解度(10.93%)大于MFH(5.05%)和MPH的(2.81%)，導(dǎo)致MNH的起泡性和泡沫穩(wěn)定性最低。因為起泡性受溶液表面張力的影響，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)適度酶解后，酶解物中的小分子肽能夠降低溶液黏度與表面張力，使MFH和MPH的起泡性優(yōu)于豌豆蛋白；當(dāng)水解度過高時，酶解物中短肽含量較高，使溶液的黏度和表面張力過低，不利于泡沫的形成以及維持泡沫的穩(wěn)定性，所以MNH的起泡性和泡沫穩(wěn)定最低。因此，可根據(jù)實際需求將蛋白質(zhì)進行適度酶解，獲得具有良好起泡性質(zhì)的蛋白酶解物，將其添加到泡沫型食品中，增添食品的風(fēng)味，減少化學(xué)起泡劑的使用。

注：不同字母(小寫字母表示起泡性，大寫字母表示泡沫穩(wěn)定性)表示具有顯著性差異，P<0.05。

2.4 MFH、MNH和MPH的乳化性和乳化穩(wěn)定性

3種酶解物的乳化性和乳化穩(wěn)定性如圖4所示。

注：不同字母(小寫字母表示乳化性，大寫字母表示乳化穩(wěn)定性)表示具有顯著性差異，P<0.05。

由圖4可知，MFH、MNH、MPH和豌豆蛋白的乳化性(OD500)分別為0.23、0.44、0.64和0.52，乳化穩(wěn)定性分別為56.03%、58.90%、74.82%和61.84%。MPH的乳化性和乳化穩(wěn)定性高于豌豆蛋白，由于酶解物中疏水性殘基暴露較多，蛋白質(zhì)與油的結(jié)合能力增強，促進肽在水-油界面遷移形成內(nèi)聚膜[27]，表現(xiàn)為MPH的乳化性和乳化穩(wěn)定性最好。而MNH和MFH的乳化性及乳化穩(wěn)定性低于MPH，因為 MNH和MFH的水解度高于MPH的水解度，MFH和MNH中小分子肽含量高于MPH，溶液黏度和界面張力降低，使得MFH和MNH的乳化性和乳化穩(wěn)定性較差。

2.5 MFH、MNH和MPH的體外消化性

3種酶解物的體外消化性如圖5所示。

注：不同字母(小寫字母表示一步消化，大寫字母表示兩步消化)表示具有顯著性差異，P<0.05。

由圖5可知，與豌豆蛋白相比，經(jīng)一步消化3種酶解物的體外消化性顯著提高(P<0.05)。經(jīng)兩步消化，3種酶解物體外消化性整體提高，其中MPH提高顯著。酶解后的蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量變小，形成許多肽段，使酶解物溶解性增強，體外消化性提高。另外，酶解物經(jīng)酶解消化后結(jié)構(gòu)被破壞，使更多消化酶的酶切位點暴露，提高了消化酶的效率。因此，經(jīng)蛋白酶酶解可增強豌豆蛋白消化性，利于人體吸收。

2.6 MFH、MNH和MPH的抗氧化活性

2.6.1 MFH、MNH和MPH的DPPH·清除能力

3種酶解物的DPPH·清除能力如圖6所示。

注：不同字母表示具有顯著性差異，P<0.05。下同。

由圖6可知，蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度在2～10 mg/mL范圍內(nèi)，酶解物的DPPH·清除能力均顯著高于豌豆蛋白(P<0.05)，且酶解物的質(zhì)量濃度與DPPH·清除能力呈正相關(guān)。大分子蛋白由于空間位阻的影響不易接近自由基，當(dāng)豌豆蛋白經(jīng)酶解后釋放出具有供電子性質(zhì)的肽段或氨基酸，這些小分子化合物更易接近自由基并與之結(jié)合生成穩(wěn)定的化合物。而隨質(zhì)量濃度的增加，具有抗氧化活性的小分子肽數(shù)量增多，與DPPH·單電子配對機會增加，所以酶解物的DPPH·清除能力逐漸增強。相同蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度時(2～10 mg/mL)，MFH的DPPH·消除能力最強。分析原因，可能與蛋白酶的酶切位點不同，產(chǎn)生的肽段大小和氨基酸組成不同有關(guān)，經(jīng)風(fēng)味蛋白酶酶解，所得MFH中的疏水性氨基酸含量較高，能夠更好地與脂溶性的DPPH·結(jié)合，增強其對DPPH·的清除能力。通過SPSS 19軟件的計算，MFH、MNH和MPH的DPPH·清除能力IC50值分別為5.64、7.22、8.95 mg/mL(以蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度計)。

2.6.2 MFH、MNH和MPH的·OH清除能力

3種酶解物的·OH清除能力如圖7所示。

圖7 3種酶解物的·OH清除能力

由圖7可知，在0.125～4 mg/mL范圍內(nèi)，酶解物的蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度與·OH清除能力呈量效關(guān)系。這與鄭志強等[28]采用堿性蛋白酶等蛋白酶酶解小麥蛋白的研究結(jié)果一致。隨著質(zhì)量濃度的增加，酶解物中提供質(zhì)子的供體增多，將溶液中更多的·OH從高度氧化態(tài)還原成更穩(wěn)定的羥基化衍生物，更有利于抑制自由基的鏈式反應(yīng)。通過SPSS 19軟件的計算，MFH、MNH和MPH的·OH清除能力IC50值分別為1.45、2.19、2.04 mg/mL(以蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度計)，MFH的·OH清除能力最強。中性蛋白酶和木瓜蛋白酶都是內(nèi)切酶，可從肽鏈內(nèi)部酶解肽鍵產(chǎn)生活性肽段，而風(fēng)味蛋白酶是內(nèi)切酶和外切酶的復(fù)合物，能從肽鏈內(nèi)部酶解肽鍵，也能從肽鏈的末端切下一個氨基酸，使MFH中含有活性肽段和更多的游離氨基酸。這些游離氨基酸與肽鏈相比，能夠更快地與·OH結(jié)合，抑制自由基鏈式反應(yīng)[29]。因此，從提高豌豆蛋白·OH清除能力的角度分析，將風(fēng)味蛋白酶用作二次酶解酶是制備高抗氧化活性豌豆蛋白酶解物的最佳用酶。

2.7 MFH、MNH和MPH的苦味評價

由于蛋白質(zhì)經(jīng)蛋白酶酶解后疏水性基團的暴露，酶解物呈現(xiàn)苦味，限制了生物活性肽的應(yīng)用范圍[30]。通常通過測定酶解物的苦味對酶解物進行評價。酶解物的苦味評價如表2所示。

由表2可知，相同質(zhì)量濃度下，豌豆蛋白的苦味最低，麥芽協(xié)同中性蛋白酶酶解物的苦味略低于僅采用中性蛋白酶酶解豌豆蛋白產(chǎn)物的苦味。在完整蛋白質(zhì)中，大部分疏水性氨基酸側(cè)鏈包裹在蛋白質(zhì)內(nèi)部，不與味蕾接觸，感覺不到苦味[23]。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)酶解后，蛋白質(zhì)中的疏水性氨基酸暴露，使酶解物產(chǎn)生苦味。并且疏水性氨基酸處于肽鏈末端時，苦味比處于中間時強。而先加入麥芽酶解豌豆蛋白，能將在末端的色氨酸、苯丙氨酸和丙氨酸等疏水性氨基酸酶解下來，減少疏水性氨基酸在多肽鏈末端的可能，從而降低酶解物的苦味。麥芽協(xié)同風(fēng)味蛋白酶脫除苦味效果較差，麥芽協(xié)同木瓜蛋白酶脫除苦味效果不明顯，具體原因還需要進一步研究。

表2 酶解物的苦味評價

3 結(jié) 論

將麥芽分別與3種蛋白酶(風(fēng)味蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶)協(xié)同酶解豌豆蛋白，并對3種酶解物的功能特性和抗氧化活性進行測定。結(jié)果表明：采用麥芽協(xié)同低加酶量(≤1.25%)的蛋白酶酶解豌豆蛋白后，豌豆蛋白的溶解性、持油性和體外消化性提高；酶解物抗氧化能力均高于豌豆蛋白，且麥芽協(xié)同中性蛋白酶酶解物的苦味較低。說明與豌豆蛋白相比，酶解后的豌豆蛋白在功能特性上有所改善，并且在一定程度上能夠清除自由基，提高豌豆蛋白的抗氧化活性。