牛蒡子炮制前后質量標志物的網(wǎng)絡藥理學研究

石 蕓， 毛銀雪， 金俊杰， 高 珣， 唐麗娟， 秦昆明,， 李偉東*

(1.南京中醫(yī)藥大學藥學院, 南京 210023； 2.江蘇海洋大學藥學院, 連云港 222005； 3.南京海源中藥飲片有限公司, 南京 210061)

中藥材牛蒡子為菊科草本植物牛蒡ArctiumlappaL.的干燥成熟果實,味辛、苦,性寒,歸肺、胃二經(jīng),具有疏散風熱、解毒透疹、利咽消腫等功效[1],臨床常需要炒制后使用。牛蒡子中主要含牛蒡苷、牛蒡苷元等木脂素類成分,以及綠原酸、異綠原酸A等酚酸類成分[2]。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)[3],牛蒡子炒制之后綠原酸、牛蒡苷、異綠原酸A含量下降,異綠原酸B、異綠原酸C、牛蒡苷元含量上升。通過液質聯(lián)用技術結合化學計量學方法[4],發(fā)現(xiàn)上述6個成分也是牛蒡子炮制前后的主要差異性成分,且具有一定的藥理作用,可以作為牛蒡子炮制前后的質量標志物成分。

中藥質量標志物是代表某種中藥特征的標志物,其來源明確,與功效用途相關聯(lián),是反映一味中藥質量特征的化合物組合,也是近年來開展中藥質量控制和藥效物質基礎研究的一個重要方向[5]。網(wǎng)絡藥理學是區(qū)別于一般藥理學的研究方法,它是以系統(tǒng)生物學和生物網(wǎng)絡平衡為基礎的藥理學分支學科,通過多途徑調節(jié)信號通路來提高藥物療效,更符合中醫(yī)藥的整體觀,可以揭示中藥“成分-靶點-疾病”之間復雜的網(wǎng)絡關系[6]?，F(xiàn)有研究主要針對牛蒡子炮制前后主要成分變化及藥效作用的改變,尚不清楚這些發(fā)生變化的成分具有哪些藥理活性。采用網(wǎng)絡藥理學方法,對牛蒡子炮制前后的質量標志物成分進行靶標預測、網(wǎng)絡構建和分析,有助于進一步研究揭示牛蒡子炮制機理及其科學內涵。現(xiàn)以牛蒡子炮制前后發(fā)生變化的主要質量標志物成分為研究對象,運用網(wǎng)絡藥理學方法預測作用靶標,闡明“成分-靶點-疾病”之間的關系,為闡明牛蒡子的炮制機理提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)庫與軟件

數(shù)據(jù)庫與軟件包括Open Bable GUI 2.4.1化合物格式轉換軟件、PharmMapper靶點篩選數(shù)據(jù)庫、UniProt數(shù)據(jù)庫中的搜索功能、蛋白質數(shù)據(jù)庫PDB、網(wǎng)絡拓撲數(shù)據(jù)分析軟件Cytoscape 3.6.0、蛋白相互作用平臺STRING、Metascape生物學信息注釋數(shù)據(jù)庫。

1.2 牛蒡子炮制前后質量標志物的選取

課題組前期對牛蒡子炮制前后主要成分進行了液質聯(lián)用分析,通過化學計量學數(shù)據(jù)分析方法,結合文獻數(shù)據(jù)報道[7-8],發(fā)現(xiàn)牛蒡苷、牛蒡苷元、綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸B和異綠原酸C(圖1)可能是炮制前后的質量標志物成分。以這6個成分為研究對象,使用Chemical Book平臺,獲得各成分的mol格式文件。

圖1 牛蒡子炮制前后質量標志物的化學結構

1.3 潛在作用靶點的預測

PharmMapper是一款小分子化合物藥效團匹配與潛在識別靶標平臺,有超過7 000個受體的藥效團模型,能夠基于分子相似性原理預測小分子化合物的作用靶點。本研究將各成分mol格式導入Open Bable GUI 2.4.1 軟件,使用其convert功能,轉換成為標準的SDF格式,將SDF格式文件導入PharmMapper在線靶點篩選平臺,預測各成分作用靶點。

1.4 蛋白相互作用網(wǎng)絡的構建

STRING數(shù)據(jù)庫能夠評估和整合蛋白之間的相互作用,包括蛋白與蛋白的直接和間接關聯(lián)。將預測的靶點上傳至STRING數(shù)據(jù)庫并選擇“Homo Sapiens”為分析的生物體,置信度得分設置為0.700。將得到的蛋白-蛋白相互作用數(shù)據(jù)導入 Cytoscape 3.6.0軟件中構建蛋白-蛋白互作網(wǎng)絡。利用Analyze network工具對網(wǎng)絡進行分析,完善PPI網(wǎng)絡圖。

1.5 構建成分-靶點-疾病網(wǎng)絡

Cytoscape是一款圖形化軟件,可以依據(jù)節(jié)點的網(wǎng)絡關系構建活性成分-作用靶點網(wǎng)絡,并對網(wǎng)絡進行編輯和分析。根據(jù)上述化學成分-作用靶點預測結果,應用Cytoscape軟件構建成化學成分-靶點-疾病(component-target-disease,C-T-D)網(wǎng)絡模型。運用軟件中Network analyer功能,進一步對網(wǎng)絡模型中的相互關系進行分析。

1.6 生物功能與通路富集分析

以標準基因名的形式將活性成分的關鍵靶標基因列表導入Metascape軟件,對作用靶點的GO (gene ontology)注釋和KEGG通路進行富集分析,選取P值排名靠前的20條通路。GO富集分析Ontology勾選“ALL”,對Biological Process、Molecular Function、Cellular Component 3個部分進行富集,預測靶點的功能分布。

2 結果

2.1 牛蒡子質量標志物潛在靶點的預測

利用PharmMapper對牛蒡苷、牛蒡苷元、綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸B和異綠原酸C的潛在靶標進行篩選,然后選擇Norm Fit高于0.5,共有87個靶點,其中牛蒡苷和牛蒡苷元的潛在靶標所占比例最大,這些靶點主要抗腫瘤、抗炎、心臟損傷保護、肝臟疾病治療、抗氧化等方面發(fā)揮作用。牛蒡子主要活性成分潛在作用靶標在靶點總數(shù)中的占比情況如圖2所示。將6個成分潛在作用靶點Fit值排名靠前的20個靶點信息和對應的成分列在表1中。

由表1可知,牛蒡子炮制前后質量標志物的作用靶點中,很多與抗腫瘤作用相關。如腫瘤抑制蛋白p53(Cellular tumor antigen p53)是一種由抑癌基因表達產(chǎn)生,具有抑制DNA 復制及細胞惡性增殖等作用的蛋白質。p53基因突變率20%～50%,突變后p53蛋白則失去阻止癌細胞增殖的作用,引起細胞惡變、轉化或凋亡,并誘發(fā)異常有絲分裂,促進惡性腫瘤發(fā)生。解聚素金屬蛋白酶17(ADAM 17)具有解聚素和金屬蛋白酶的活性,在炎癥和腫瘤組織中均具有一定的作用,與腎癌、非小細胞肺癌、前列腺癌、乳腺癌、結腸癌等都有著密不可分的關系[9],這與牛蒡子抗腫瘤的作用機制相一致。β-半乳糖苷凝集素4(β-galactoside-specific lectin 4)是腫瘤細胞凝集素中的一種,具有抑制體液免疫功能的作用和增強細胞免疫的作用,能夠調節(jié)腫瘤細胞與基質之間、腫瘤細胞之間的黏附,并且參與腫瘤細胞的轉移[10]。此外,RecA蛋白(protein recA)在修復受損DNA的過程中起到抗氧化作用,與牛蒡子抗氧化功能相關[11]。心肌細胞特異性增強因子2A(Myocyte-specific enhancer factor 2A, MEF2A)是心肌細胞特異性增強因子2(Myocyte-specific enhancer factor 2, MEF2)基因家族的成員。人類家系遺傳分析表明突變的MEF2A是冠狀動脈粥樣硬化的致病基因之一,這一致病基因的發(fā)現(xiàn)為研究冠心病的發(fā)病機理,開發(fā)預防和治療冠心病的新藥具有重要價值,這一潛在靶標與牛蒡子治療心血管疾病的功能吻合。

圖2 牛蒡子炮制前后質量標志物的作用靶點分布

表1 牛蒡子炮制前后質量標志物的主要靶點信息

2.2 靶點蛋白相互作用PPI網(wǎng)絡構建

將牛蒡子炮制前后質量標志物的關鍵靶點基因導入STRING數(shù)據(jù)庫,在Organism中選擇Homo Sapiens,得到蛋白相互作用關系可視化圖。為了便于后期Cytoscape作圖,對基因進行調整過濾的分值選擇0.9,離散點進行隱藏,導出蛋白相互作用網(wǎng)絡圖，如圖3所示。由圖3可以看出,除了2個靶點外,其他均相互關聯(lián),與牛蒡子的多靶點相互作用機制相吻合。

不同藍色圓點代表不同的靶點,代表著靶點蛋白相互之間的關系；紅色和黃色圓點代表蛋白相互作用網(wǎng)絡中的核心靶點蛋白

在上述核心靶點中,PSMD4(Proteasome 26S subunit, non-ATPase)基因編碼的蛋白可以參與底物識別,從而導致目標蛋白質的選擇性降解。作用于PSMD4的化合物,可以影響肝癌細胞的體外增殖和克隆[12]。RUVBL1蛋白是DNA解螺旋的關鍵酶,抑制該基因的表達,可以有效抑制細胞增殖和遷移,為臨床治療肺癌提供理論基礎[13]。乙酰輔酶A羧化酶(ACACA)是脂肪酸合成和氧化代謝途徑的限速酶,研究表明ACACA在多種腫瘤中顯著高表達,與腫瘤進展及患者預后密切相關[14]。由此可見,牛蒡子炮制前后質量標志物的核心作用靶點均與抗腫瘤相關,說明牛蒡子炮制后具有消腫散結功效,可用于腫瘤治療具有一定的科學意義。

2.3 “成分-靶點-疾病”網(wǎng)絡圖的構建

選擇牛蒡子炮制前后6個質量標志物成分,以及這些成分對應的靶點和靶點對應的主要疾病,運用Cytoscape軟件進行作圖,得到牛蒡子炮制前后質量標志物成分的“成分-靶點-疾病”網(wǎng)絡圖，如圖4所示。圖4中包含了疾病與靶點、靶點與成分、靶點與靶點之間的關系。

藍色線條表示靶點與靶點、疾病與靶點之間的藥效團關系；紅色表示靶點與成分之間的關系

通過“成分-靶點-疾病”網(wǎng)絡圖可以看出一個靶點可能對應多個疾病,而同一個疾病可以通過多個靶點治療達到效果。研究發(fā)現(xiàn)：通過牛蒡子炮制前后6個質量標志性成分篩選出的靶點,與腫瘤(tumour)、肝臟疾病(liver disease)、風濕性關節(jié)炎(arthritis)、心血管疾病(cardiovascular disease)、炎癥(inflammation),糖尿病(diabetes mellitus)等疾病相關,其中,抗腫瘤是牛蒡子最主要的藥理學作用,在網(wǎng)絡中處于比較核心的位置,涉及多個作用靶點。例如,DNA拓撲異構酶I和類蘇氨酸合成酶都與抗腫瘤發(fā)生相關[15]。牛蒡子炮制前后不同的質量標志物可能有相同的作用靶標。如牛蒡苷和牛蒡苷元的重復靶標有類蘇氨酸合成酶(Probable threonine synthase),Acyl CoA結合域蛋白6(Acyl-CoA-binding domain-containing protein 6),胸腺細胞選擇性相關高遷移率族蛋白TOX(Thymocyte selection-associated high mobility group box protein TOX),c-Ets-1蛋白(Protein C-ets-1)和蛋白unc-45同源物A(Protein unc-45 homolog A)。Acyl CoA結合域蛋白6有心肌損傷保護功能,其他4個靶標都有抗腫瘤作用。異綠原酸B和異綠原酸C重復靶標最多,有18個,這些靶標的藥理學作用多為抗腫瘤,例如核孔復合體蛋白nup98-nup96(Nuclear pore complex protein Nup98-Nup96)參與調解T細胞活性,在抗腫瘤、抗炎和治療自身免疫病(如風濕性關節(jié)炎)方面發(fā)生作用；β腎上腺素能受體激酶1(β-adrenergic receptor kinase 1)可以在胰腺癌的臨床病理診斷時作為潛在標志物。由此可見,牛蒡子炮制前后主要質量標志物作用靶點多與抗腫瘤作用相關,進一步驗證了前期研究發(fā)現(xiàn)牛蒡子炮制后抗腫瘤作用增強的研究結論。

2.4 基因功能與通路富集分析

將目標成分預測出的87個主要靶點導入Metascape平臺進行GO 注釋分析和KEGG pathway分析,設置閾值P<0.01,獲取通路富集結果，如圖5所示。通路注釋分析結果顯示,目標成分預測出的16條主要信號通路，如表2所示。結果顯示，小分子代謝過程(small molecule catabolic process)是最顯著的生物過程,該過程涉及10個作用靶點,可能是牛蒡子抗腫瘤作用最重要的生物過程。其他生物過程包括干擾素-γ應答(response to interferon-gamma)、有機磷化物生物合成過程(organophosphate biosynthetic process)、磷酸核苷代謝過程(nucleoside phosphate metabolic process)、免疫系統(tǒng)細胞因子信號(cytokine signaling in immune system)和α-氨基酸代謝過程(α-amino acid metabolic process)等。

圖5 牛蒡子炮制前后質量標志物作用通路富集分析圖

通過對相關通路進一步分析發(fā)現(xiàn),嘌呤代謝(purine metabolism)有4個作用靶點參與,嘌呤代謝發(fā)生紊亂后會引起痛風性關節(jié)炎或腎炎,通過調控該條信號通路,可能是牛蒡子發(fā)揮抗炎作用的主要途徑。胰島素信號通路(insulin signaling pathway)是機體調控血糖的重要途徑,該條通路發(fā)生紊亂,可以導致血糖異常,牛蒡子通過作用于該條信號通路,對血糖進行調節(jié),與文獻[16]報道牛蒡子具有調節(jié)血糖作用相一致。

3 結論

通過網(wǎng)絡藥理學方法揭示了牛蒡子炮制前后質量標志物的潛在作用靶標,利用PharmMapper對牛蒡苷、牛蒡苷元、綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸B和異綠原酸C的潛在靶標進行篩選,證實了牛蒡子具有抗腫瘤、抗氧化、心肌損傷保護等藥理作用。如牛蒡苷元的潛在作用靶標谷胱甘肽還原酶對維持胞內高比率GSH/GSSG及植物細胞的氧化還原平衡有重要意義。綠原酸的潛在作用靶標心臟脂肪酸結合蛋白(fatty acid-binding protein, heart)是一種可溶性蛋白質,但當機體出現(xiàn)心肌損傷時,該蛋白的含量會顯著上升,敏感性和特異性較高,這就驗證了牛蒡子治療心血管疾病的作用。異綠原酸B潛在作用靶標刺猬蛋白(protein hedgehog, HH)不僅與胚胎的生長發(fā)育、成人組織再生以及修復相關,而且與多種腫瘤的發(fā)生和轉移有相關性,這就為牛蒡子的抗腫瘤作用提供依據(jù)。

牛蒡子通過加熱炒制后減少其寒涼成分,緩和藥性,從而突出其抗炎、抗腫瘤等方面的作用。研究揭示了牛蒡子炮制后主要質量標志物都具有抗腫瘤作用,且主要作用靶標與牛蒡子的潛在藥理活性是具有相關性的,也在一定程度上驗證了中藥的傳統(tǒng)的功效。通過對潛在靶標以及“成分-靶點-疾病”網(wǎng)絡的研究可以看出,牛蒡子炮制前后質量標志物中不同成分的作用靶點各不相同,但不同的信號通路存在相互聯(lián)系。同時,研究也進一步揭示了,牛蒡子炮制前后功效改變與這6個質量標志物成分的作用密切相關。在下一步的研究中,將應用傳統(tǒng)藥理學方法,對牛蒡子炮制前后不同組合的質量標志物進行藥效學驗證,從而進一步闡明牛蒡子炮制機理。

表2 牛蒡子炮制前后質量標志物的相關通路信息