辣椒雄性不育分子標記研究進展

程 翔 湯冰倩 劉 峰 馬艷青

（1.湖南大學研究生院隆平分院， 長沙 410125； 2.湖南農業(yè)大學， 長沙 410128； 3.湖南省農業(yè)農村廳， 長沙 410005）

辣椒具備強雜種優(yōu)勢，雜交后代可明顯改善果實品質，增加經濟產量，并且顯著提高辣椒抗病和耐貯性狀。辣椒雜交育種在20 世紀90 年代便已推廣，但人工去雄耗費大量人力，且種子純度無法保證。因此利用雄性不育系育種成為辣椒新品種選育的重要方式之一。開展辣椒雄性不育系選育，進行辣椒雜種優(yōu)勢利用及雜種技術應用研究受到科研工作者的重視。近年來，形態(tài)特征與生理生化層面的雄性不育有關研究已經取得了一系列的成果，隨著分子技術的進步和儀器水平的提高，分子標記輔助育種已經成為辣椒育種的重要方向。

1 雄性不育

雄性不育性狀受環(huán)境和遺傳因素共同調控，可以通過人工選育出不育性狀穩(wěn)定的雄性不育系（sterility line）。雄性不育材料主要通過自然突變、遠緣雜交、人工誘變等途徑獲得。植物界的雄性不育表現(xiàn)非常復雜，敗育時期也不相同。雄性不育按基因型可分為細胞核不育型和細胞質不育型兩大類。細胞核雄性不育（GMS）分為顯性核不育和隱性核不育，受細胞核基因控制。細胞質雄性不育型（CMS）受細胞質和細胞核基因共同控制，可以被顯性核恢復（restorerfactor，Rf）基因恢復育性，所以細胞質雄性不育型也為核質互作型。通過篩選細胞質雄性不育型的保持系與恢復系，實現(xiàn)“三系配套”，對生產實踐具有重大意義[1-2]。

雜交種已在辣椒生產上占據(jù)了主導地位，主推品種均為一代雜種。在雜交制種與選育時需要去雄授粉，效率低。近年來由于勞動力價格的不斷攀升與對雜交種穩(wěn)定性的需要，辣椒雄性不育基礎研究與實踐應用備受關注。利用辣椒雄性不育系制種可以明顯降低成本，保證純度，同時促進知識產權的保護。據(jù)張銳等[3]統(tǒng)計，已經報道的從事辣椒雄性不育研究的科研單位有三十余家。自20 世紀90 年代以來，利用雄性不育系育種，已經選育出一批市場競爭力強、抗病蟲、耐運儲的新品種。新品種的選育與推廣帶來了巨大的經濟效益與社會效益，其中一些科研單位影響力較大。國內，沈陽市農業(yè)科學院楊世周[4]在1978 年首先發(fā)現(xiàn)辣椒雄性不育現(xiàn)象,之后選育出一批辣椒雄性不育兩用系。沈陽市農業(yè)科學院楊鳳梅等[5-6]利用核不育材料AB14-12 成功選育出沈椒系列與沈研系列辣椒品種，其中代表品種“沈研14 號”熟性早，連續(xù)坐果能力極強，且在抗逆性方面表現(xiàn)優(yōu)異。河北省農林科學院蔬菜花卉研究所范妍芹等[7-8]通過不育系AB91-8 選育出冀研系列品種，其中代表品種“冀研8 號”商品性好，抗病毒病，在生產中大面積推廣。北京市農林科學院蔬菜研究所耿三省等[9]通過辣椒胞質雄性不育材料181A 選育出高抗TMV 的“京辣2 號”，且適于全國各地露地栽培。湖南省蔬菜研究所鄒學校等[10-11]選育了我國第一個通過審定的辣椒核質互作雄性不育系9704A，成功實現(xiàn)了三系配套，在此基礎上育成湘研系列與湘辣系列品種，其中代表品種“湘辣1 號”味辣質脆，滿足嗜辣地區(qū)市場需求，另一代表品種“湘研14 號”也帶來了良好的社會效益。中國農業(yè)大學沈火林等[12]以胞質不育材料S200243A 為母本選育出微辣而果肉脆嫩的“農大082”，并在多地示范推廣。江蘇省農業(yè)科學院趙華侖等[13]采用CMS 三系配套法選育出高產穩(wěn)產的“蘇椒3號”，并在生產上大面積推廣。據(jù)王立浩等[14]統(tǒng)計，“十二五”期間，選育出一批穩(wěn)定的辣（甜）椒雄性不育兩用系和辣椒細胞質雄性不育恢復系。這些雄性不育系的選育為優(yōu)良品種創(chuàng)制打下了堅實的基礎。

2 分子標記技術

分子標記是直接反映DNA 水平遺傳多態(tài)性的新型標記。相對于形態(tài)、細胞和生化標記，分子標記不僅在任何發(fā)育時期及各個部位均可檢測，而且標記數(shù)量極多。第一代分子標記技術以分子雜交為基礎，有RFLP（限制性片段長度多態(tài)性標記）；第二代以聚合酶鏈式反應為核心，有RAPD（隨機擴增多態(tài)性標記）、AFLP（擴增片段長度多態(tài)性標記）、SSR（微衛(wèi)星重復序列）；第三代以DNA 已知特定序列為基礎的技術，有SNP（單核苷酸多態(tài)性）、InDel（插入缺失標記）、EST（表達序列標簽）。其中SSR 標記因其穩(wěn)定性好，成本較低，目前應用最為廣泛。InDel 在DNA 中分布密度大于SSR，具有與SSR 相似的共顯性好及相對穩(wěn)定的優(yōu)點。SNP 為單個堿基的差異，在基因組中分布最廣泛，但其成本較高。隨著測序技術的發(fā)展，InDel 標記與SNP 標記已經逐漸應用于基因定位和分子標記育種領域。分子標記輔助育種可以定向改良作物性狀，加快育種進程,相對于傳統(tǒng)育種具有較強的優(yōu)越性。吳俊等[15]利用分子標記輔助選擇技術，育成了兩系雜交中稻新組合Y兩優(yōu)7 號，超高產條件下產量達12 t/hm2，產量增加顯著。周屹峰等[16]通過分子輔助育種技術，培育出低直鏈淀粉含量的不育系浙農3A，有效改良了稻米品質。除此之外，遺傳多樣性分析、圖譜構建、QTL 定位、基因克隆和基因的表達調控等研究都離不開分子標記技術。

3 辣椒雄性不育分子標記的研究進展

在過去的二十年間，雄性不育相關基因研究取得了階段性的進展，相當數(shù)量的分子標記被開發(fā)。相對于水稻、番茄等作物，辣椒基礎研究相對滯后，辣椒基因組信息于2014 年才公布。辣椒遺傳群體多態(tài)性低也限制了標記開發(fā)進程，從而實用標記不足成為應用的瓶頸。在知網上以“分子標記輔助育種研究進展”為關鍵詞進行搜索，可查閱到大豆、小麥、水稻等作物有一定數(shù)量的文獻，但分子標記輔助育種技術在辣椒領域的應用相對較少，目前未有系統(tǒng)報道。與“導入外源基因”的轉基因不同，分子標記輔助選擇技術是在充分地發(fā)揮了種內基因多態(tài)性的資源。這不僅能夠將過去難以著手的優(yōu)良數(shù)量性狀進行整合，還規(guī)避了安全隱患問題與社會道德倫理的問題，對辣椒產業(yè)具有重大意義，會成為未來育種趨勢。隨著辣椒基因組信息公布，大量標記的開發(fā)成為可能。當前開發(fā)的標記中SSR 標記和Indel 分子標記較多，隨著技術與設備的發(fā)展，SNP 標記開發(fā)會逐漸走向成熟，為辣椒分子標記輔助育種提供保障。

3.1 辣椒核雄性不育分子標記的研究進展

3.1.1 國內辣椒核雄性不育分子標記的研究進展

GMS 受細胞核內一對基因控制，相對于CMS，兩系配套選育過程復雜，但恢復資源多。據(jù)Dhaliwal等[17]統(tǒng)計，在辣椒中約20 個獨立遺傳的核不育系基因已被發(fā)現(xiàn)，但國內開發(fā)出的相關基因分子標記并不多。孟雅寧等[18]運用BSA 法與全基因組重測序技術，以甜椒細胞核雄性不育兩用系AB91 為材料，開發(fā)了2 個標記，經鑒定AB91 核不育基因與甜椒核雄性不育基因連鎖的位點標記為H12、H24，與不育基因msms 的連鎖距離分別為0.29 cM、0.00 cM，為進一步克隆甜椒核雄性不育基因提供了理論依據(jù)。李國琴等[19]采用cDNA-AFLP 方法，從辣椒雄性不育兩用系HW58 的可育株花蕾與不育株花蕾中獲得陽性差異TDF，通過電子克隆獲得865 bp 的cDNA 序列，其與煙草CP26 基因序列的同源性高達90%，并命名為CaCP26。嚴慧玲等[20]以甜椒細胞核雄性不育兩用系AB91 為材料，篩選了225對SRAP 引物組合及1 393 對EcoR Ⅰ和Mse Ⅰ引物組合，確定了標記 E37M39（200 bp）與育性基因的遺傳距離6 cM 和標記E44M93（500 bp）與育性基因的遺傳距離12 cM。程青等[21]通過重測序，確定Capana02g002096 為強候選基因，開發(fā)一個名為Indel-12 的Indel 標記，與msc1 基因連鎖，通過基因鑒定確認，標記Indel-12 與msc1 位點在所有群體中共分離。

3.1.2 國外辣椒核雄性不育基因分子標記的研究進展 目前利用的辣椒核不育分子標記較多為國外研究人員所開發(fā)，但也僅ms1、ms3、ms8 和ms10 基因有定位進展報道。Lee 等[22-24]開發(fā)了一個與ms1 基因連鎖的SCAR 標記。篩選出1 個擴增514 bp 片段的AFLP 標記E-AGC/M-GTG，通過對比分析，開發(fā)出了一種共顯性MS1-SCAR 標記。此外，確定了3 個與ms3 基因緊密連鎖的AFLP 標記（Eagg/Mccc276、Eagc/Mctt178 和Ecag/Mtgc204），并 將AFLP 標 記Ecag/Mtgc204 轉 化CAPS 標 記GMS3-CAPS。之后還開發(fā)了1 個與msk 基因連鎖的GMSK-CAPS 標記，其研究在辣椒雄性不育領域較為深入。共分離標記可以有效提高辣椒分子標記輔助育種的準確度。Jeong 等[25]首次精細定位辣椒核不育基因。其開發(fā)出的HRM 標記（32187928-HRM）與表型共分離，通過精確定位與功能預測，發(fā)現(xiàn)雄性不育的發(fā)生可能與CA05g06780 基因功能障礙有關。Heung-Ryul Lee[26]利用BSA 和AFLP開發(fā)了1 個AFLP 標記，之后擴增并重新設計引物進行高分辨率熔解曲線分析（HRM），開發(fā)出1個與甜椒中新不育源連鎖的GMSE 標記。Aulakh 等[27]將ms10 基因定位于1 號染色體上，并開發(fā)了與其連鎖的SSR 標記AVRDC-PP12 和AVRDC_MD997，與ms10 位點的連鎖距離分別為7.2 cM 和 20.8 cM。Bartoszewski 等[28]通過RAPD-BSA 技術，鑒定了7 個與ms8 位點相關的標記，將ms8 定位在了第4 號染色體上，并開發(fā)了與ms8 基因連鎖的2個標記SCAR-P2 和RAPD Z05-760，遺傳距離分別為34.5 cM 與4.6 cM。這些標記為將來育種應用打下了堅實基礎。

Naresh 等[29]通過序列分析鑒定SNP 標記，之后采用BSA 方法，在1 號染色體上鑒定出4 個與ms3 基因共分離的SNPs，且在5 號染色體上鑒定出1 個與msw 基因共分離的SNPs。開發(fā)了2 個與ms3基因相關的標記，分別命名為HPGMS2（CAPS）和HPGMS3（dCAPS）。同時開發(fā)了與msw 基因相關的dCAPS 標記（SPGMS1）。經檢測確認，這些標記可以應用于苗期鑒定核不育單株，從而推動雜交種生產。

3.2 辣椒胞質雄性不育分子標記的研究進展

3.2.1 國內辣椒胞質雄性不育分子標記的研究進展

目前雄性不育研究中，胞質雄性不育分子標記相對較多，且應用更加廣泛。鑒定出材料的細胞質類型，在整個辣椒胞質雄性不育三系雜交系統(tǒng)中是非常重要的一環(huán)。采用分子標記鑒定細胞質類型，更有目的地配制雜交組合，可以減少工作量，特別對保持系的選育意義重大。葉青靜等[30]以胞質雄性不育系131BC5A 與恢復系139D-21-3 材料,采用 CAPS、SSR 及SCAR 方法，構建包含210 個F2單株的定位群體，開發(fā)出連鎖標記14 個，有利于分子標記輔助育種的應用。魏兵強等[31]利用近等基因系原理和 RAPD 標記技術獲得BH19-S900，并將其轉化為共顯性的SCAR 標記SS730，還獲得不育保持基因標記H7F850，并轉化為SCAR 標記SF640，有利于分子標記鑒定不育系的推進。張強 等[32]根據(jù)細胞質育性標記SCAR130 的序列多態(tài)性位點設計KASP 標記引物，使其轉化為KASP130分子標記。KASP 標記適用于高通量檢測，有利于提高不育系和保持系選擇效率。張正海等[33]研究中發(fā)現(xiàn)了1 個新的辣椒細胞質雄性不育恢復候選基因CA00g82510（CM334，Capsicum annuum L.），并利用CA00g82510 在親本間差異 SNP 位點開發(fā)了5 個多態(tài)性KASP 標記。王鵬等[34]通過比較線粒體基因組，認為orf300a 和orf314a 是不育系138A中控制不育的強候選基因，并開發(fā)了1 個與不育共分離的標記orf300a。楊娟等[35]首次采用SSR 標記手段進行辣椒恢復基因定位，成功將恢復基因定位在第6 號染色體上，通過175 對SSR 引物篩選材料，發(fā)現(xiàn)AF208834 與恢復基因連鎖且遺傳距離為20.8 cM。并首次結合SSR 標記與SCAR 標記，可顯著提高辣椒雄性不育系恢復系的選擇效率。李怡斐 等[36]篩選出3 個與Rf 基因緊密連鎖的分子標記，分別為CRF-SCAR、PR-CAPS 和OPP13-CAPS，并對CRF-SCAR 標記進行驗證,結果表明育種實際應用中可以利用標記CRF-SCAR 篩選含恢復基因材料，對提升育種效率有顯著幫助。

3.2.2 國外辣椒胞質雄性不育分子標記的研究進展

部分國外研究者在辣椒胞質雄性不育分子標記領域研究成果較為系統(tǒng)與深入，為辣椒雄性不育系的分子標記輔助選擇育種提供了理論參考。Jo等[37-38]開發(fā)出1 個標記accD-U，用此標記對不育系與保持系篩選，發(fā)現(xiàn)僅在不育系中擴增出片段，應用性較強。之后運用BSA-AFLP 技術，在與Rf 位點共分離的基因組區(qū)域中發(fā)現(xiàn)了1 個強候選恢復基因，編碼PPR 蛋白的CaPPR6，為首個細胞核內分離并克隆的Rf 基因。與此同時開發(fā)出1 個最接近此基因的共顯性分子標記Co1Mod1-CAPS，此標記適用性強，有利于推動辣椒育種的應用。Lee 等[39]采 用 BSA-AFLP 方法以87 株F2單株為定位群體，篩選到2 個與部分恢復基因pr 緊密連鎖的多態(tài)標記E-AGC/MGCA122 和E-TCT /M-CCG116。并將E-AGC/MGCA122 轉化成1 個應用于辣椒育性篩選的PR-CAPS 標記，其遺傳距離為1.8 cM。苗期對植株進行恢復基因的鑒定可減少測交工作量，縮短恢復系的選育時間，提高選擇效率的同時加速恢復基因精細定位與克隆。

為了構建遺傳圖譜，Min 等[40]以“Buja”和“Tamna”的F2群體為材料，構建了Rf-BSA、rf-BSA 和4 個重組子池，用于AFLP 標記分析，鑒定并篩選出3 個Rf 連鎖分子標記AFRF1、AFRF3 和AFRF4。在甜椒方面，Mulyantoro 等[41]利用 CMS 相關標記，首次將甜椒 NMS 轉化為CMS，為提高甜椒雜交制種產量奠定基礎。Kim 等[42]利用2 個 RAPD 標記 OP131400（0.37 cM）、OW18800（8.12 cM）和1 個CAPS 標記AFRF8CAPS（1.8 cM）對Rf 基因進行了定位。之后 Kim 等[43]發(fā)現(xiàn)的apt6 和orf456 基因為辣椒雄性不育的強候選基因。orf456 為coxII 基因的3'端的線粒體新開放閱讀框，在不育系中高表達，但在恢復系中該蛋白的表達水平明顯降低。通過農桿菌介導法將該基因導入擬南芥，發(fā)現(xiàn)轉化群體有45%表現(xiàn)為雄性不育，有力證明orf456 是不育強候選基因，同時可以用來鑒定辣椒胞質不育的不育表型。

4 展望

在核雄性不育系研究中，重點在于開發(fā)緊密連鎖的標記，依靠分子標記輔助培育核雄性不育系可避免傳統(tǒng)回交繁雜且耗時長的缺點。在胞質雄性不育系研究中，由于恢復基因資源少，選育周期長，細胞質雄性不育恢復系的選育一直是三系配套的難點，這個問題在甜椒中尤為突出。分子標記的開發(fā)有望解決這一困難，通過緊密連鎖恢復基因的分子標記進行快速篩選，減少傳統(tǒng)測交工作量。細胞質雄性不育系的應用因相關基因的標記逐步開發(fā)與恢復基因的定位，使得更多“三系配套”的開發(fā)與應用成為可能。但目前報道的一些標記存在數(shù)量較少與連鎖距離較遠等問題，還需要進一步開發(fā)出便于應用且連鎖緊密的分子標記。隨著辣椒基因組和線粒體基因組的公布，將加速相關基因緊密連鎖遺傳圖譜的構建、不育相關標記的克隆開發(fā)與恢復主效基因的轉育，進一步利用基因工程技術，構建全新雄性不育系用于辣椒的雜種優(yōu)勢。