不同孕期胎盤生長因子和血管內(nèi)皮生長因子水平與胎兒生長受限發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)聯(lián)分析

劉兆敏， 蒲元林， 吳慧捷， 李 麗

胎兒生長受限(fetal growth restriction, FGR)是造成胎兒死亡的主要原因之一，在所有新生兒中的發(fā)生率為5%～10%[1-2]。FGR影響胎兒日后的正常生長發(fā)育，如造成神經(jīng)發(fā)育缺陷，增加成年后代謝性疾病和行為失調(diào)疾病的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)等[3-6]。胎盤生長因子(placental growth factor，PlGF)和血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)是重要的促血管生成因子，在胎兒的生長發(fā)育中發(fā)揮重要作用[7-9]。文獻(xiàn)報(bào)道，PlGF和VEGF或許與FGR的發(fā)生和發(fā)展相關(guān)[10]，孕晚期的血漿PlGF表達(dá)水平可能可作為FGR發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)的預(yù)測(cè)標(biāo)志物，注射VEGF可預(yù)防小鼠FGR的發(fā)生[11-12]。本研究擬探討不同孕期孕婦血清PlGF和VEGF的表達(dá)水平及其與FGR發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)聯(lián)分析。

1 對(duì)象與方法

1.1對(duì)象 選取2016年7月—2018年6月在筆者醫(yī)院進(jìn)行產(chǎn)前檢查的326例孕婦作為研究對(duì)象。入組標(biāo)準(zhǔn)：(1)確診妊娠時(shí)間≤8周。(2)年齡20～35歲。(3)同意參與本研究并能進(jìn)行定期復(fù)查。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)患有妊娠期并發(fā)癥，如妊娠期合并慢性高血壓病、糖尿病或腎病。(2)既往生殖系統(tǒng)手術(shù)史、腫瘤或嚴(yán)重感染史。(3)多胎妊娠。本研究經(jīng)筆者醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有受試者均已簽署知情同意書。

1.2樣本采集及檢測(cè) 所有受試者入組后分別于孕早期(妊娠≤13周)的10～13周、孕中期(妊娠14～27周)的19～22周和孕晚期(妊娠≥28周)的33～35周，在孕婦靜息狀態(tài)下采集空腹時(shí)的外周血于真空采血管中。待其凝固后，在4 ℃、2 000 r/min的條件下離心15 min，分離血清，置于-80 ℃保存以待檢測(cè)。采用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)檢測(cè)血清中PlGF和VEGF的表達(dá)水平，每份樣本3孔，單次重復(fù)。PlGF采用人PlGF試劑盒(美國Abcam公司)進(jìn)行檢測(cè)，敏感度2 pg/mL，最低檢出濃度 1.372 pg/mL，批次間差別<12%，批次內(nèi)差別<10%，檢測(cè)波長450 nm，檢測(cè)同批進(jìn)行。另外，VEGF采用人VEGF ELISA試劑盒(美國Abcam公司)進(jìn)行檢測(cè)，敏感度低于5 pg/mL，最低檢出濃度23.4 pg/mL，批次間差別8.1%，批次內(nèi)差別4.7%，檢測(cè)波長450 nm，檢測(cè)同批進(jìn)行。同時(shí)，為了減少樣本放置時(shí)間過長可能帶來的樣本異常從而影響結(jié)果的準(zhǔn)確性，所有樣本為分批次檢測(cè)，每半年1次。

1.3分組 FGR的診斷采用《婦產(chǎn)科學(xué)》第8版教材中的診斷標(biāo)準(zhǔn)[13]。根據(jù)FGR的診斷結(jié)果將受試者分為FGR組和正常妊娠組。

2 結(jié) 果

2.1一般臨床資料 入組孕婦的年齡為(29.8±4.4)歲(18～45歲)，妊娠次數(shù)為(2.5±0.9)次(1～5次)，生產(chǎn)次數(shù)為(1.4±0.5)次(1～3次)，流產(chǎn)次數(shù)(1.1±0.7)次(0～3次)。本研究中肥胖(BMI ≥30 kg/m2)、吸煙以及酗酒的孕婦例數(shù)分別為45例(13.8%)，42例(12.9%)和13例(4.0%)?？傮w新生兒的出生體質(zhì)量為(2 872.3 ± 247.5)g(2 120～3 623 g)，Apgar評(píng)分為(9.2±0.6)(7～10)。

2.2孕早期、孕中期和孕晚期孕婦血清PlGF和VEGF的表達(dá)水平 326例孕婦中，孕中期和孕晚期的血清PlGF表達(dá)水平(均P<0.001)和VEGF(均P<0.001)顯著低于孕早期(表1)。

表1 不同孕期PlGF和VEGF表達(dá)水平

2.3孕婦血清PlGF和VEGF表達(dá)水平在不同孕期中的相關(guān)性分析 326例孕婦中，孕婦的孕早期(r=0.227，P<0.001)、孕中期(r=0.288，P<0.001)和孕晚期(r=0.375，P<0.001)血清PlGF與VEGF表達(dá)水平均呈正相關(guān)。

2.4血清PlGF和VEGF表達(dá)水平差別 FGR組的孕早期血清PlGF表達(dá)水平和正常妊娠組中比較，差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.153)；FGR組的孕中期(P<0.001)和孕晚期(P<0.001)PlGF表達(dá)水平均顯著低于正常妊娠組。FGR組孕早期的VEGF表達(dá)水平與正常妊娠組比較，差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.089)，而FGR組孕中期(P<0.001)和孕晚期(P<0.001)的VEGF表達(dá)水平均顯著低于正常妊娠組。另外，采用中位倍數(shù)法分析結(jié)果顯示，F(xiàn)GR組孕中期(P<0.001)和孕晚期(P<0.001)的PlGF水平均顯著低于正常妊娠組；同時(shí)，F(xiàn)GR組孕中期(P<0.001)和孕晚期(P<0.001)的VEGF水平顯著低于正常妊娠組(表2)。

2.5不同孕期PlGF和VEGF表達(dá)水平與FGR發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)聯(lián)分析 ROC曲線分析顯示，孕婦PlGF孕早期表達(dá)水平不能預(yù)測(cè)FGR的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)，但孕中期和孕晚期孕婦的PlGF表達(dá)水平均對(duì)FGR的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)具有較好的預(yù)測(cè)作用，其中孕晚期PlGF的表達(dá)水平對(duì)FGR發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)的預(yù)測(cè)作用最好，AUC分別為0.577(95% CI：0.466～0.688)，0.762(95% CI：0.674～0.850)和0.900(95% CI：0.845～0.955)(圖1A)。孕早期的VEGF表達(dá)水平對(duì)FGR的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)無預(yù)測(cè)作用，但孕中期和孕晚期VEGF表達(dá)水平對(duì)FGR的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)具有較好的預(yù)測(cè)作用，其中孕晚期的預(yù)測(cè)作用最好，AUC分別為0.592(95% CI：0.478～0.705)，0.729(95% CI：0.639～0.819)和0.861(95% CI：0.801～0.920)(圖1B)。

3 討 論

本研究通過檢測(cè)孕婦血清PlGF和VEGF在不同孕期的表達(dá)水平及其表達(dá)水平的關(guān)聯(lián)，分析PlGF和VEGF與FGR發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)聯(lián)，發(fā)現(xiàn)：(1)孕中期和孕晚期孕婦的血清PlGF和VEGF表達(dá)水平均較孕早期低，且PlGF和VEGF表達(dá)水平在孕早期、孕中期和孕晚期均呈正相關(guān)。(2)與正常妊娠者比較，F(xiàn)GR患者孕中期和孕晚期的PlGF和VEGF顯著降低；ROC曲線表明，孕中期和孕晚期的PlGF和VEGF均可以預(yù)測(cè)FGR的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)，其中孕晚期兩者的表達(dá)水平對(duì)FGR的預(yù)測(cè)作用最好。

表2 FGR組和正常妊娠組不同孕期PlGF和VEGF表達(dá)水平的差別分析

PlGF是VEGF家族的一員，由胎盤滋養(yǎng)層產(chǎn)生，它除了促血管生成作用外，還可以促進(jìn)有絲分裂，是保證胎盤正常發(fā)育的重要物質(zhì)[14-15]。由于PlGF在胎盤發(fā)育和血管生理中的重要作用，參與多種疾病的病理過程[16]。有研究表明，抑制PlGF的表達(dá)水平在多種動(dòng)物模型中(包括視網(wǎng)膜病、脈絡(luò)膜新生血管性疾病和糖尿病動(dòng)物模型)可減少新血管形成和毛細(xì)血管異常[17]。VEGF是重要的促血管生成因子，其在內(nèi)皮細(xì)胞中具有促進(jìn)有絲分裂和抗凋亡的作用。同時(shí)，VEGF還具有增加血管滲透性和促進(jìn)細(xì)胞遷徙的作用[18]。因此，VEGF在多種疾病中發(fā)揮著重要作用，如在多個(gè)腫瘤中作為治療靶點(diǎn)，輔助一些眼科疾病的治療等[19]。

在正常的妊娠過程中，PlGF的表達(dá)水平隨著孕周的增長而增加，到達(dá)峰值后逐漸下降。與PlGF類似，正常妊娠中VEGF的水平也隨著孕周的增加而上升，達(dá)到峰值后下降。以往的一些研究顯示，PlGF與胎兒異常的生長和發(fā)育相關(guān)。一項(xiàng)巢式隊(duì)列研究的結(jié)果表明，孕婦32～35孕周時(shí)較低的血漿PlGF水平與胎兒低出生體質(zhì)量顯著相關(guān)[20]。另外一項(xiàng)回顧性隊(duì)列研究的結(jié)果顯示，孕婦血漿PlGF較低可預(yù)測(cè)孕婦高血壓病、不良的圍產(chǎn)期結(jié)果以及胎兒過低體質(zhì)量[21]。此外，一項(xiàng)大樣本前瞻性隊(duì)列研究顯示，較低的臍帶血PlGF水平(采用中值倍數(shù)法表示)與較低的出生體質(zhì)量、不正常的胎兒生長模式及更高的FGR發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)[22]。另外一項(xiàng)回顧性隊(duì)列研究的結(jié)果表明，與分娩適于胎齡兒和大于胎齡兒的產(chǎn)婦比較，發(fā)生FGR產(chǎn)婦的母血和臍血中的PlGF水平顯著降低，且母血PlGF水平與新生兒出生體質(zhì)量、頭圍、腹圍以及BMI均呈正相關(guān)[23]。VEGF與胎兒的宮內(nèi)生長發(fā)育相關(guān)。一項(xiàng)在靈長類動(dòng)物(狒狒)中進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)表明，胎盤基板的VEGF基因輸送可以促進(jìn)子宮動(dòng)脈重塑，從而促進(jìn)胎兒生長[24]。VEGF/VEGF受體(VEGF receptor，VEGFR)系統(tǒng)在早期胎兒發(fā)育中，或許調(diào)控參與犁鼻器化學(xué)受體前體以及神經(jīng)前體遷移[25]。采用VEGF抑制劑KRN633干預(yù)孕中期的小鼠可以誘發(fā)胎兒小鼠的視網(wǎng)膜血管生長發(fā)育異常[26]。孕婦血清VEGF水平的下降和可溶性FMS樣酪氨酸激酶-1(sFlt-1)水平的上升與更高的胎兒的生長和發(fā)育受限風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)[27]。臍帶血血漿VEGF水平與胎兒出生體質(zhì)量正相關(guān)，而sFlt-1水平與胎兒出生質(zhì)量負(fù)相關(guān)；另外，較高的臍帶血VEGF水平與較低的胎兒產(chǎn)后發(fā)育遲緩發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)，而sFlt-1呈現(xiàn)相反的趨勢(shì)[28]。正常足月妊娠的產(chǎn)婦胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞和血清中的VEGF表達(dá)水平顯著高于FGR的產(chǎn)婦[29]。

本研究檢測(cè)不同孕期PlGF在孕婦血清中的表達(dá)水平，并評(píng)估了其與FGR發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)聯(lián)，結(jié)果顯示，孕婦孕中期和孕晚期的血清PlGF表達(dá)水平均低于孕早期。同時(shí)，F(xiàn)GR患者PlGF孕中期和孕晚期的表達(dá)水平與正常妊娠者比較顯著下降，且對(duì)FGR的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)具有較好的預(yù)測(cè)作用，其中孕晚期PlGF表達(dá)水平對(duì)FGR發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)的預(yù)測(cè)作用最好。PlGF可以預(yù)測(cè)FGR發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)的原因可能為：PlGF在胎兒的生長發(fā)育中能促進(jìn)有絲分裂和血管形成，在胎兒的生長發(fā)育中起至關(guān)重要的作用，較低的PlGF水平可能導(dǎo)致胎兒不能及時(shí)完成正常生長發(fā)育，故本研究中孕婦血清PlGF隨著孕期的進(jìn)展而下降。

另外，本研究檢測(cè)了不同孕期VEGF在孕婦血清中的表達(dá)水平及其與FGR發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)聯(lián)，發(fā)現(xiàn)孕婦孕中期和孕晚期的血清VEGF水平顯著低于孕早期，VEGF孕中期和孕晚期的表達(dá)水平在FGR患者中顯著低于正常妊娠者，且對(duì)FGR發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)具有較好的預(yù)測(cè)作用，其中VEGF孕晚期水平對(duì)FGR發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)的預(yù)測(cè)作用最好。關(guān)于VEGF對(duì)FGR的預(yù)測(cè)作用，考慮與以下原因有關(guān)：VEGF可以通過調(diào)節(jié)犁鼻器化學(xué)受體前體以及神經(jīng)前體遷移，促進(jìn)血管生成從而促進(jìn)胎兒的正常生長發(fā)育，因此，F(xiàn)GR患者的血清孕中期和孕晚期VEGF水平顯著低于正常妊娠的孕婦，且孕晚期的VEGF水平對(duì)FGR的發(fā)生具有較好的預(yù)測(cè)作用[24-26]。另外，本研究還發(fā)現(xiàn)，孕婦血清PlGF和VEGF水平在孕早期、孕中期和孕晚期均呈正比。有研究報(bào)道，PlGF可通過促進(jìn)VEGF與Flt-1受體分離，并促進(jìn)VEGF與更強(qiáng)的受體VEGF受體-2(KDR)結(jié)合，從而增強(qiáng)VEGF的信號(hào)傳導(dǎo)，這或許可以解釋為什么本研究中兩者的血清水平在孕早期、孕中期和孕晚期均呈正相關(guān)[15]。另外，關(guān)于孕期其他因素可能對(duì)FGR產(chǎn)生的影響，如妊娠期并發(fā)癥、妊娠期營養(yǎng)素缺乏等，應(yīng)在后續(xù)研究加入分析。

本研究同時(shí)檢測(cè)了兩個(gè)血管生成因子PlGF和VEGF與FGR發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)聯(lián)，且樣本量較大，但同時(shí)也存在一些缺陷：(1)本研究納入的受試者多數(shù)來自中國同一地區(qū)，可能造成結(jié)果的代表性不足。(2)本研究為一項(xiàng)觀察性研究，可能會(huì)產(chǎn)生一些混雜因素，如孕婦的流產(chǎn)史或年齡過大等因素可能會(huì)對(duì)結(jié)果造成影響。(3)本研究采集孕婦的血液樣本進(jìn)行PlGF和VEGF的檢測(cè)，而血液樣本中標(biāo)志物的表達(dá)水平較容易受到其他因素的影響，可能因此導(dǎo)致本研究在評(píng)估孕早期、孕中期和孕晚期的PlGF和VEGF表達(dá)水平之間的關(guān)聯(lián)時(shí)，關(guān)聯(lián)系數(shù)普遍較小。(4)本研究未將孕晚期做更詳細(xì)的劃分，可能造成孕晚期的結(jié)果對(duì)于臨床的指導(dǎo)意義較低。(5)另外，本研究未從不同維度評(píng)估PlGF/VEGF對(duì)FGR發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)的預(yù)測(cè)作用，如孕早期、孕中期和孕晚期PlGF或VEGF表達(dá)水平的變化趨勢(shì)或表達(dá)量差別對(duì)于FGR的預(yù)測(cè)作用。