一種快速測定苦丁茶中苦丁茶皂苷A含量的方法

摘 要：建立一種高效液相色譜法快速測定苦丁茶中苦丁茶皂苷A含量，采用Kromasil C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 ?m）;流動相為乙腈-0.1%磷酸水，梯度洗脫;流速為0.8 mL/min;檢測波長226 nm;柱溫30 ℃;進樣量10 ?L。結(jié)果表明，苦丁茶皂苷A在進樣量0.102～3.06 ?g/mL范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系（r=0.999 9），平均回收率為99.6%，RSD為0.86%（n=6）。該方法精密度高，簡便快捷，具有良好的重復性和穩(wěn)定性，可為評價苦丁茶質(zhì)量提供參考。

關(guān)鍵詞：苦丁茶;苦丁茶皂苷A;含量測定

苦丁茶是一種純天然保健茶。冬青科冬青屬植物苦丁的干燥葉，是正品苦丁茶的主要來源，主產(chǎn)于廣東省、廣西壯族自治區(qū)和海南省等地?？喽〔柚兄饕性碥?、黃酮、多酚、氨基酸、揮發(fā)油與多糖等多種化學成分，其中，三萜皂苷類化合物是其主要活性成分，有顯著降低低密度脂蛋白在血管內(nèi)沉積，改善血液微循環(huán)的藥理活性，對降壓、降糖、降血脂、防治動脈粥樣硬化以及由此引發(fā)的心腦血管疾病有積極治療意義[1-2]。目前，苦丁茶的質(zhì)量分析主要集中在測定黃酮、三萜、氨基酸、揮發(fā)性成分等方面[3]。本實驗結(jié)合苦丁茶的功效，選取其中含量高、降血脂活性強的三萜皂苷類成分苦丁茶皂苷A為指標，用高效液相色譜法進行測定，為全面客觀反映苦丁茶的質(zhì)量優(yōu)劣，合理制定苦丁茶等級標準提供參考。

1 儀器與試藥

Agilent 1100 型高效液相色譜儀，Chemstation色譜工作站，Sartorius-BS110S 電子天平（德國賽多利斯科學儀器有限公司），KQ-500DE 型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

苦丁茶皂苷A（kudinoside A）對照品為實驗室自制，經(jīng)HPLC法檢測質(zhì)量分數(shù)在98.0%以上;乙腈為色譜純，水為超純水，其余試劑均為分析純。10批不同等級品次的苦丁茶樣品主要購買收集自廣西、海南、廣東。

2 方法與結(jié)果

2.1 提取條件優(yōu)化

分別從提取方法、提取溶劑、提取時間、固液比4方面進行研究。首先以60%甲醇作溶劑用回流和超聲法進行實驗檢測，顯示回流法提取優(yōu)于超聲法。又考察不同濃度甲醇和乙醇對提取的影響，顯示80%甲醇與60%甲醇對苦丁茶皂苷A的提取率遠高于其他溶劑，從經(jīng)濟上考慮，確定60%甲醇為提取溶劑。進一步考察不同固液比、提取時間的影響，顯示以固液比1∶250，用60%甲醇回流提取1 h，待測成分提取效果最好。

2.2 色譜條件優(yōu)化

為獲得苦丁茶皂苷A的最佳分離效果，實驗考察了4種不同的液相色譜柱、4種不同的流動相、不同的柱溫以及不同流動相的流速等色譜條件。結(jié)果表明：Kromasil 100-5C18柱的分離效果最優(yōu);采用乙腈-0.1%磷酸水為流動相，0.8 mL/min的流速梯度洗脫，柱溫30 ℃，可以使苦丁茶皂苷A的色譜峰保留時間適中，并能與干擾組分的色譜峰良好分離。

2.3 檢測波長的選擇

取苦丁茶皂苷A對照品甲醇溶液進行波長掃描，在226 nm波長處有最大吸收，故確定226 nm作為檢測波長。

2.4 色譜條件

Kromasil 100-5C18（250 mm×4.6 mm，5 ?m）色譜柱。流動相：乙腈（A）-0.1%磷酸水溶液（B），梯度洗脫：0～10 min，15%～30% A;10～30 min，30%～40% A;30～35 min，40% A。體積流量：0.8 mL/min。檢測波長：226 nm。柱溫：30 ℃。進樣量：10 ?L。高效液相色譜圖見圖1。

2.5 對照品溶液的制備

精密稱取干燥至恒重的苦丁茶皂苷A對照品適量，加入60%甲醇溶解、定容，制成濃度為0.510 mg/mL的對照品儲備液，低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

2.6 供試品溶液的制備

取粉碎、過40目篩并低溫干燥至恒重的苦丁茶粉0.1 g，加入60%甲醇25 mL，稱定質(zhì)量，80 ℃加熱回流60 min，取出，自然放冷至室溫，以60%甲醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，0.22 ?m微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.7 線性關(guān)系考察

精密吸取對照品儲備液1 mL，以60%甲醇定容于5 mL容量瓶中，再分別精密吸取苦丁茶皂苷A對照品溶液（0.051 0 mg/mL）1、5、10、15、20、25 ?L與30 ?L，注入液相色譜儀，記錄色譜峰面積。以進樣量為橫坐標，峰面積為縱坐標，制備標準曲線，得回歸方程為Y=489.55X-0.59，r=0.999 9。

結(jié)果表明苦丁茶皂苷A進樣量在0.102～3.06 ?g/mL時，呈良好的線性關(guān)系。

2.8 精密度試驗

取同一供試品溶液，連續(xù)進樣6次，測定苦丁茶皂苷A峰面積，計算RSD為0.47%，表明本方法精密度良好。

2.9 重復性試驗

取同一批苦丁茶樣品6份，按2.6項下方法平行制備6份供試樣品溶液，分別進樣10 ?L，計算苦丁茶皂苷A的質(zhì)量分數(shù)，平均結(jié)果為2.56%，RSD為1.12%，表明本方法重復性良好。

2.10 穩(wěn)定性試驗

取同一供試品溶液分別于0、2、4、8、12、24 h依次進樣，記錄不同時間的色譜圖，計算苦丁茶皂苷A的峰面積RSD為1.54%，RSD值≤2%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.11 回收率試驗

取廣西大新苦丁茶樣品粉末6份，每份0.05 g，精密稱定，分別精密加入0.051 0 mg/mL的苦丁茶皂苷A對照品甲醇溶液25 mL，按2.6供試品溶液制備方法制備并測定，平均回收率為99.6%（RSD=0.86%）。

2.12 樣品測定

取不同產(chǎn)地與等級苦丁茶樣品，制備供試品溶液。分別精密吸取苦丁茶皂苷A對照品溶液與供試品溶液各10 ?L，注入液相色譜儀，測定峰面積，計算苦丁茶皂苷A含量，見表1。

3 結(jié)果與討論

實驗顯示：①來自3個不同產(chǎn)地、相同等級苦丁茶中指標成分苦丁茶皂苷A的含量差異不大，但是來自同一產(chǎn)地海南、不同等級苦丁茶中指標成分含量有一定差異，從數(shù)據(jù)上可以明顯看出，普通級>一級>特級>極品，這可能與不同等級苦丁茶烘焙加工溫度有密切關(guān)系，隨著烘焙溫度的提高，苦丁茶皂苷A的含量降低，后期需進一步實驗驗證。②茶葉碎屑中含有較多的苦丁茶皂苷A，將苦丁茶冬青葉開發(fā)為新的降血脂藥物而言，茶葉碎屑都可用作原料，利于降低開發(fā)新藥的成本。③苦丁茶冬青老齡葉與嫩葉中指標成分含量差異較大，但老齡葉中所含其他化學成分是否與嫩葉有差異，還有待研究。

本實驗建立的測定方法簡便，準確可靠，重復性好，可考慮作為苦丁茶質(zhì)量優(yōu)劣的檢測控制標準。根據(jù)實驗結(jié)果，若以苦丁茶干燥品計算，其所含主要活性成分苦丁茶皂苷A限度標準可暫定為不低于20 mg/g。

參考文獻

[1]江蘇新醫(yī)學院.中藥大辭典[M].上海：上海科學技術(shù)出版社，1986.

[2]胡婷.苦丁茶中有效成分的分離純化、鑒定及其活性研究[D].廣州：華南理工大學，2013.

[3]樊偉偉，何進武，陳冬梅，等.海南苦丁茶幾種活性成分測定與比較分析[J].食品工程，2017（3）：62-64.

基金項目：國家自然科學基金資助課題（編號：81560643）。

作者簡介：呂華瑛（1971—），女，山東萊陽人，碩士，教授。研究方向：中藥化學成分研究與質(zhì)量控制。