發(fā)光細(xì)菌及其在農(nóng)業(yè)水質(zhì)監(jiān)測(cè)中的應(yīng)用研究綜述

張琳琳 劉剛 方俊

摘要 ? ?由于具有高效、便捷、靈敏和低廉的特點(diǎn)，發(fā)光細(xì)菌已成為水質(zhì)急性毒性快速檢測(cè)的首選，在國內(nèi)外被廣泛應(yīng)用于環(huán)境監(jiān)測(cè)中。本文對(duì)發(fā)光細(xì)菌的特性、種類、發(fā)光機(jī)理及其在農(nóng)業(yè)水質(zhì)檢測(cè)方面的應(yīng)用進(jìn)行了綜述，對(duì)發(fā)光細(xì)菌在農(nóng)業(yè)水源污染檢測(cè)中的前景作了展望。

關(guān)鍵詞 ? ?發(fā)光細(xì)菌;生理特性;發(fā)光機(jī)理;農(nóng)業(yè)用水;應(yīng)用

中圖分類號(hào) ? ?X824 ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 ? ?A

文章編號(hào) ? 1007-5739（2020）20-0162-03 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）

Abstract ? ?Because of its high efficiency， convenience， sensitivity and low cost， luminescent bacteria have become the best choice for rapid detection of acute toxicity of water quality， and were widely used in environmental monitoring at home and abroad. In this paper， the characteristics， types， luminescence mechanism and application of agricultural water quality monitoring of luminescent bacteria were reviewed， and the prospect of luminescent bacteria in agricultural water quality monitoring was prospected.

Keywords ? ?luminescent bacteria; physiological characteristic; luminescence mechanism; agricultural water; application

農(nóng)業(yè)現(xiàn)代化發(fā)展的高速進(jìn)程導(dǎo)致水體中毒性物質(zhì)的物種豐度和種類不斷增加，從而使水體質(zhì)量監(jiān)測(cè)成為了各界焦點(diǎn)?？蒲泄ぷ髡咭验_發(fā)出許多靈敏、有效的水質(zhì)毒性檢測(cè)方法，大體可分為2種，即分析技術(shù)和生物毒性檢測(cè)。分析技術(shù)主要用于檢測(cè)廢水和地表水指標(biāo)，但其不能反映各指標(biāo)由于生物的拮抗、協(xié)同、抑制等相互作用的綜合毒性大小。利用生物學(xué)方法進(jìn)行毒性檢測(cè)越來越普遍，不斷出現(xiàn)新的檢測(cè)手段。在快速生物檢測(cè)方法方面，根據(jù)測(cè)試生物的不同，可以分為微生物、藻類、底棲軟體動(dòng)物、浮游生物和魚類等[1-2]。傳統(tǒng)的生物毒性檢測(cè)以水藻、水蚤類、魚類作為主要測(cè)試對(duì)象，測(cè)試周期較長，工作量較大，對(duì)受試生物的篩選較嚴(yán)格。微生物中的發(fā)光細(xì)菌具有獨(dú)特的生理特性，將其與光電傳感技術(shù)相結(jié)合，形成的發(fā)光細(xì)菌毒性快速檢測(cè)技術(shù)越來越引人注目。將傳統(tǒng)的分析技術(shù)與發(fā)光細(xì)菌毒性檢測(cè)技術(shù)聯(lián)合進(jìn)行水質(zhì)分析，為保障水質(zhì)安全提供了有力支持。發(fā)光細(xì)菌毒性是一種生物毒性，它能客觀分析出逾5 000種有毒物質(zhì)對(duì)周邊環(huán)境以及生物物種的綜合影響。由于高效、便捷、重復(fù)性好等優(yōu)勢(shì)，其在國內(nèi)外被廣泛應(yīng)用于污水、工農(nóng)業(yè)廢水、生活飲用水、大氣污染、土壤污染、食品等方面的檢測(cè)。

1 ? ?發(fā)光細(xì)菌的生理特性及分類

發(fā)光細(xì)菌是指含有l(wèi)ux基因，在正常生理?xiàng)l件下，可發(fā)出波長在450～490 nm范圍藍(lán)綠色可見光的細(xì)菌[3]。它是一種兼性好氧化能自養(yǎng)型細(xì)菌[4]。

發(fā)光細(xì)菌的分類方式多種多樣，包括傳統(tǒng)分類、數(shù)值分類、系統(tǒng)分類等。迄今為止，在全世界范圍內(nèi)發(fā)現(xiàn)的發(fā)光細(xì)菌種類，大致可分為以下種類。一是發(fā)光桿菌屬，包括鰒發(fā)光桿菌和明亮發(fā)光桿菌[5]。其中，明亮發(fā)光桿菌是從海洋中發(fā)現(xiàn)、提取、分離、純化的，在測(cè)試過程中需要另外加入3%氯化鈉才能保持正常的生理狀態(tài)。目前，國內(nèi)應(yīng)用較多的是明亮發(fā)光桿菌T3和T502小種[6]。二是弧菌屬，包括哈維氏弧菌、美麗弧菌、費(fèi)氏弧菌、火神弧菌、東方弧菌、青?；【?。另外，還有人發(fā)現(xiàn)霍亂弧菌和地中海弧菌中的某些菌株也有發(fā)光的現(xiàn)象。其中弧菌屬中的霍亂弧菌和青海弧菌屬于淡水型發(fā)光細(xì)菌。我國的發(fā)光細(xì)菌研究學(xué)者朱文杰教授從青海湖裸鯉魚體表上分離純化出一株淡水型發(fā)光細(xì)菌，命名為青?；【鶴67，是全球唯一一株不具備致病性的淡水發(fā)光細(xì)菌，在使用過程中的調(diào)節(jié)鹽濃度較低，對(duì)樣品的毒性測(cè)定結(jié)果影響較小[7]。三是希瓦氏菌屬，主要為羽田希瓦氏菌。

2 ? ?發(fā)光細(xì)菌的發(fā)光機(jī)理

發(fā)光細(xì)菌的最大特點(diǎn)為在它的生長周期過程中可以發(fā)出可見光，其發(fā)光機(jī)理與螢火蟲相似，但并不完全相同。細(xì)菌自身能夠分泌合成一種稱為細(xì)菌熒光酶的酶，這種酶通過氧化還原型的黃素單核苷酸發(fā)出光子，這個(gè)反應(yīng)過程不產(chǎn)熱。因此，發(fā)光細(xì)菌的發(fā)光過程并不伴隨產(chǎn)熱，是一種“冷”光過程。細(xì)菌發(fā)光的波長范圍為420～670 nm，在490 nm處可以達(dá)到最大發(fā)射波長，其光為藍(lán)綠色。細(xì)菌發(fā)光的簡略反應(yīng)方程式如下：

不僅如此，細(xì)菌在發(fā)光過程中熒光酶還會(huì)涉及相應(yīng)的有氧呼吸作用，人們通常認(rèn)為這是促進(jìn)呼吸作用中電子向氧分子轉(zhuǎn)移的一條代謝信號(hào)通路。氧分子會(huì)促進(jìn)FMNH2反應(yīng)產(chǎn)生中間產(chǎn)物—熒光酶-黃素過氧化物，其氧化降解反應(yīng)的過程中會(huì)產(chǎn)生大量能量（約210 kJ/mol），從而促進(jìn)激發(fā)分子在擊退過程中激發(fā)光子的產(chǎn)生。眾所周知，生物的發(fā)光過程需要能量，而這個(gè)能量來源是來自于O-O鍵的斷裂[8]。

污染物抑制細(xì)菌發(fā)光是主要通過以下2種方式：使參與細(xì)菌發(fā)光反應(yīng)過程中的熒光酶失活;抑制細(xì)菌發(fā)光反應(yīng)過程中相關(guān)的代謝信號(hào)通路。因此，可以根據(jù)細(xì)菌產(chǎn)光強(qiáng)度的變化來測(cè)定這些能夠抑制發(fā)光細(xì)菌呼吸作用、新陳代謝以及生長過程的有毒物質(zhì)毒性的大小[9]。重金屬和有機(jī)污染物類物質(zhì)對(duì)發(fā)光細(xì)菌的毒性最大，對(duì)其發(fā)光過程損傷最嚴(yán)重。通過光學(xué)波長檢測(cè)儀可以檢測(cè)發(fā)光強(qiáng)度的變化，從而可以利用發(fā)光細(xì)菌作為檢測(cè)水體中有毒物質(zhì)的有效手段[10]。

3 ? ?發(fā)光細(xì)菌在農(nóng)業(yè)水質(zhì)毒性檢測(cè)中的應(yīng)用

3.1 ? ?發(fā)光細(xì)菌應(yīng)用于水體抗生素殘留檢測(cè)

由于集約化畜牧業(yè)的飛速發(fā)展，抗生素被廣泛應(yīng)用于生豬養(yǎng)殖業(yè)，造成了抗生素污染水體的嚴(yán)重農(nóng)業(yè)污染。針對(duì)這類問題，我們可以利用發(fā)光細(xì)菌來檢測(cè)養(yǎng)殖基地中所排放的水源中抗生素的急性毒性。曾 ?卓等就以明亮發(fā)光桿菌作為指示菌種，測(cè)定了生豬養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)中常用的包括林可霉素、青霉素G鈉和桿菌肽在內(nèi)的7種獸用抗生素的急性毒性[11]。

然而，傳統(tǒng)的發(fā)光細(xì)菌檢測(cè)方法采用的是天然發(fā)光細(xì)菌，海洋菌在測(cè)試時(shí)需要加入2%～3%氯化鈉來調(diào)節(jié)鹽度，會(huì)對(duì)水樣的毒性測(cè)試結(jié)果產(chǎn)生影響。此外，天然發(fā)光細(xì)菌除了能檢測(cè)重金屬外，還會(huì)對(duì)幾千種污染物質(zhì)有響應(yīng)，不能實(shí)現(xiàn)對(duì)特定污染物的高效識(shí)別。因此，人們?cè)诎l(fā)光細(xì)菌的基礎(chǔ)上，通過基因工程的方法，研發(fā)出了重組發(fā)光細(xì)菌檢測(cè)方法。重組發(fā)光細(xì)菌是通過基因工程技術(shù)將發(fā)光基因重組到對(duì)污染物敏感的受體細(xì)胞所構(gòu)成的基因工程[12]。發(fā)光細(xì)菌的發(fā)光操縱子系統(tǒng)中包括結(jié)構(gòu)基因luxC、luxD、luxA、luxB、luxE和調(diào)節(jié)基因luxI、luxG、luxR等。不同發(fā)光細(xì)菌的發(fā)光基因的拷貝數(shù)和表達(dá)能力不同[13]。為了檢測(cè)環(huán)境中某些特定污染物或其他目標(biāo)特質(zhì)，將lux基因?qū)脒x定的非發(fā)光細(xì)菌，人為構(gòu)建基因工程發(fā)光細(xì)菌[14]，這一研究方向是近年來發(fā)光細(xì)菌研究的熱點(diǎn)。此外，還可以通過基因編輯的手段來構(gòu)建菌株以實(shí)現(xiàn)抗生素毒性的快速評(píng)價(jià)[15]。低濃度的二甲基亞砜可以在不影響青?；【鶴67發(fā)光生理特性的前提下，提高其對(duì)抗生素毒性的檢測(cè)敏感程度，大幅提高了發(fā)光細(xì)菌在抗生素毒性檢測(cè)中的靈敏度以及效率[16]。

3.2 ? ?發(fā)光細(xì)菌應(yīng)用于農(nóng)藥殘留毒性檢測(cè)

發(fā)光細(xì)菌毒性測(cè)試技術(shù)能夠測(cè)試的物質(zhì)范圍廣、靈敏度較傳統(tǒng)的動(dòng)物試驗(yàn)高、相關(guān)性好、重復(fù)性好、反應(yīng)耗時(shí)短，因而在環(huán)境監(jiān)測(cè)中被廣泛應(yīng)用[17]。根據(jù)發(fā)光細(xì)菌發(fā)光的原理，凡是能夠影響發(fā)光細(xì)菌正常新陳代謝的物質(zhì)均能用發(fā)光細(xì)菌發(fā)光強(qiáng)度變化的方法來進(jìn)行定性或定量的測(cè)定。近年來，利用發(fā)光細(xì)菌來進(jìn)行農(nóng)業(yè)廢水中農(nóng)藥殘留安全監(jiān)測(cè)越來越廣泛[18]。

早有試驗(yàn)對(duì)發(fā)光細(xì)菌在農(nóng)業(yè)廢水中農(nóng)藥殘留檢測(cè)相關(guān)領(lǐng)域的監(jiān)測(cè)應(yīng)用情況進(jìn)行了評(píng)估，同時(shí)還監(jiān)測(cè)了多種農(nóng)藥的毒性變化。結(jié)果表明，在對(duì)水質(zhì)的監(jiān)測(cè)和評(píng)估過程中，單獨(dú)采用化學(xué)參數(shù)的指標(biāo)測(cè)試是不全面的，應(yīng)該配合生物毒性測(cè)試手段進(jìn)行多方面的水質(zhì)監(jiān)測(cè)[19]。有研究通過與化學(xué)檢測(cè)的比較，對(duì)大型溞、斜生柵藻、費(fèi)舍爾弧菌進(jìn)行毒性檢測(cè)效應(yīng)評(píng)估，發(fā)現(xiàn)發(fā)光細(xì)菌對(duì)農(nóng)藥廠污染水源毒性的敏感性最高[20]。而對(duì)農(nóng)藥廠污染地土壤浸出液的毒性檢測(cè)試驗(yàn)表明，與其他毒性檢測(cè)生物相比，發(fā)光細(xì)菌試驗(yàn)周期更短。但這些受試生物的毒性效力都隨著時(shí)間的增加而增加[21]。楊麗芳等針對(duì)食品蔬菜中的農(nóng)藥殘留，使用發(fā)光細(xì)菌進(jìn)行有機(jī)磷農(nóng)藥毒性的快速檢測(cè)[22]。

4 ? ?結(jié)語

綜上所述，發(fā)光細(xì)菌法的生物毒性檢測(cè)技術(shù)在農(nóng)業(yè)水質(zhì)污染監(jiān)測(cè)等方面已發(fā)揮出重要的作用。作為一種輔助監(jiān)測(cè)手段，克服了理化監(jiān)測(cè)的局限性和連續(xù)取樣的繁瑣，縮短了試驗(yàn)時(shí)間、簡化了操作過程，經(jīng)過不斷發(fā)展，應(yīng)用會(huì)越來越廣泛。

然而，通過國家水站大數(shù)據(jù)平臺(tái)和現(xiàn)場調(diào)研得知，在國內(nèi)以發(fā)光細(xì)菌法為主的水質(zhì)生物綜合毒性分析儀在水站運(yùn)行過程中還存在一些問題。一是荷蘭TOX-control菌種價(jià)格昂貴，運(yùn)輸周期較長，海關(guān)開箱安檢會(huì)造成菌干粉的批次質(zhì)量不一致，無法保證現(xiàn)場水站持續(xù)正常運(yùn)行，運(yùn)行率僅14%。二是部分國內(nèi)廠家儀器使用的是明亮發(fā)光桿菌，與弧菌相比，桿菌本身活動(dòng)性較弱，易發(fā)生沉淀，造成光路檢測(cè)下降，不同批次細(xì)菌靈敏度差異較大，重現(xiàn)性差。三是國產(chǎn)費(fèi)氏弧菌凍干粉的研制大多停留在實(shí)驗(yàn)室階段，穩(wěn)定性、使用周期尚未達(dá)到進(jìn)口設(shè)備要求。要解決這些問題，需要在細(xì)菌的質(zhì)量控制與保證體系上進(jìn)行大量現(xiàn)場應(yīng)用研究（研制出可替代進(jìn)口的費(fèi)氏弧菌干粉），形成統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，保證現(xiàn)場監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確、可靠，起到真正意義上的水質(zhì)預(yù)警監(jiān)測(cè)作用。

5 ? ?參考文獻(xiàn)

[1] 王曉輝，金靜，任洪強(qiáng)，等.水質(zhì)生物毒性檢測(cè)方法研究進(jìn)展[J].河北工業(yè)科技，2007（1）：58-62.

[2] 彭強(qiáng)輝，陳明強(qiáng)，蔡強(qiáng)，等.水質(zhì)生物在線監(jiān)測(cè)技術(shù)研究進(jìn)展[J].環(huán)境監(jiān)測(cè)管理與技術(shù)，2009（4）：12-16.

[3] 崔曉.淺談發(fā)光微生物[J].科技信息（科學(xué)教研），2008（18）：322-323.

[4] 李再興，尹青，越俊娜，等.發(fā)光細(xì)菌法測(cè)定水質(zhì)急性毒性研究進(jìn)展[J].河北科技大學(xué)學(xué)報(bào)，2014，35（5）：480-486.

[5] 朱文杰.發(fā)光細(xì)菌與環(huán)境毒性檢測(cè)[M].北京：中國輕工業(yè)出版社，2009.

[6] 杜宗軍，王祥紅，李海峰，等.發(fā)光細(xì)菌的研究和應(yīng)用[J].高技術(shù)通訊，2003，13（12）：103-106.

[7] German version EN ISO 11348-1：1998.water quality-determination of the inhibitory effect of water samples on the light emission oft vibrio fischeri（luminescent bacteria test）[S].出版者不詳，1998.

[8] 水質(zhì)-急性毒性的測(cè)定-發(fā)光細(xì)菌法：GB/T15441-1995[S].北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，1995.

[9] ISO/TC147.ISO11348-2007.Water quality-Determination of the inhibitory effect of water samples on the light emission of Vibrio fischeri（Luminescent bacteria test）[S].出版者不詳，2007.

[10] VAN DER MEER J R，BELKIN S.Where microbiology meets microengineering：design and applications of reporter bacteria[J].Nature Reviews Microbiology，2010，8（7）：511-522.

[11] 曾卓，施城，施一妃，等.養(yǎng)豬業(yè)常用抗生素的發(fā)光細(xì)菌急性毒性研究[J].中國沼氣，2018，36（3）：3-8.

[12] CHO J C，PARK K J，IHM H S，et al.A novel continuous toxicity test system using a luminously modified freshwater bacterium[J].Biosensors &Bioelectronics，2004，20（2）：338-344.

[13] PREMKUMAR J R，ROSEN R，BELKIN S，et al.Sol-gellu-minescence biosensors：Encapsulation of reoombinant E，coli reporters in thick silicate films[J].Analytica Chimica Acta，2002，462（1）：11-23.

[14] 王習(xí)文.luxCDABE發(fā)光細(xì)菌的構(gòu)建及在抗生素藥效評(píng)價(jià)和腦膜炎感染機(jī)制研究中的應(yīng)用[D].北京：軍事科學(xué)院，2018.

[15] 吳曉壬，羅劍飛，朱興江，等.DMSO脅迫提高發(fā)光細(xì)菌毒性實(shí)驗(yàn)敏感度的研究[J].現(xiàn)代食品科技，2017，33（5）：298-304.

[16] 黃新新，何苗，羅虹，等.pUCD-recA重組發(fā)光菌構(gòu)建及對(duì)遺傳毒性污染物響應(yīng)作用[J].環(huán)境科學(xué)，2009（6）：1722-1726.

[17] 劉允，解鑫.水體生物毒性檢測(cè)技術(shù)研究進(jìn)展綜述[J].凈水技術(shù)，2013（5）：5-10.

[18] 王兆琴，王芹，丁長春.發(fā)光細(xì)菌法監(jiān)督工業(yè)廢水綜合毒性[J].儀器儀表與分析監(jiān)測(cè)，2002（1）：33-35.

[19] 吳淑杭，周德平，徐亞同，等.18種農(nóng)藥對(duì)發(fā)光細(xì)菌的急性毒性研究[J].農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào)，2007（6）：2267-2270.

[20] 宋曉威，徐建，張孝飛，等.廢棄農(nóng)藥廠污染場地淺層地下水生態(tài)毒性診斷研究[J].農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào)，2011，30（1）：42-48.

[21] 許霞，薛銀剛，劉菲，等.廢棄農(nóng)藥廠污染場地土壤浸出液的急性毒性和遺傳毒性篩查[J].生態(tài)毒理學(xué)報(bào)，2017， 12（6）：223-232.

[22] 楊麗芳，龍晶.蔬菜中有機(jī)磷農(nóng)藥殘留快速檢測(cè)技術(shù)及應(yīng)用[J].中國農(nóng)業(yè)信息，2016（15）：85.