基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討補(bǔ)陽(yáng)還五湯防治血栓形成的作用機(jī)制

馮月男 孫思邈 張玉昆

[摘要] 目的 運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法探尋補(bǔ)陽(yáng)還五湯防治血栓形成的活性成分、靶點(diǎn)及信號(hào)通路。 方法 運(yùn)用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)和分析平臺(tái)（TCMSP）檢索藥物，結(jié)合生物利用度和類藥性兩個(gè)藥動(dòng)學(xué)參數(shù)篩選補(bǔ)陽(yáng)還五湯的活性成分及對(duì)應(yīng)作用靶點(diǎn);運(yùn)用Genecard和OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)以血栓形成（thrombosis）為關(guān)鍵詞找尋疾病相關(guān)靶基因，將藥物與疾病靶基因取交集，并用Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行靶點(diǎn)名稱校正，利用Cytoscape軟件構(gòu)建化合物-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)。將所得藥物-疾病靶基因輸入STRING在線數(shù)據(jù)庫(kù)繪制PPI網(wǎng)絡(luò)圖，得出核心基因，進(jìn)行GO及KEGG通路富集分析。 結(jié)果 補(bǔ)陽(yáng)還五湯有61個(gè)有效活性成分，藥物-疾病交集基因63個(gè)，參與作用的生物過(guò)程69個(gè)，作用通路有115個(gè)，主要參與調(diào)控腫瘤壞死因子（TNF）、PI3K-AKt、白細(xì)胞介素（IL）-17、NF-κB信號(hào)通路。 結(jié)論 補(bǔ)陽(yáng)還五湯可通過(guò)調(diào)節(jié)多個(gè)基因調(diào)控多個(gè)信號(hào)通路治療血栓性疾病，體現(xiàn)了中藥復(fù)方多成分、多靶點(diǎn)、多通路的特點(diǎn)。

[關(guān)鍵詞] 補(bǔ)陽(yáng)還五湯;血栓形成;網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué);靶點(diǎn);信號(hào)通路

[中圖分類號(hào)] R285? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A? ? ? ? ? [文章編號(hào)] 1673-7210（2020）10（b）-0017-05

[Abstract] Objective To explore the active components， targets and signal pathways of Buyang Huanwu Decoction in preventing thrombosis by using network pharmacology method. Methods The traditional Chinese medicine system pharmacology database and analysis platform （TCMSP） were used to retrieve drugs， and the active ingredients and corresponding targets of Buyang Huanwu Decoction were selected by combining the two pharmacokinetic parameters of bioavailability and drug-like properties. Genecard and OMIM database were used to find disease-related target genes with the keywords of thrombosis. Drug and disease target genes were intersected， target names were corrected using Uniprot database， and compound-target-disease network was constructed by Cytoscape software. The obtained drug-disease target genes were input into STRING online database to draw PPI network diagram， and the core genes were obtained， and GO and KEGG pathway enrichment analysis were performed. Results Buyang Huanwu Decoction had 61 effective active components， 63 drug-disease intersection genes， 69 biological processes involved and 115 signaling pathways， which were mainly involved in the regulation of tumor necrosis factor （TNF）， PI3K-Akt， interleukin （IL）-17 and NF-κB signaling pathways. Conclusion Buyang Huanwu Decoction can regulate multiple genes to regulate multiple signaling pathways to treat thrombotic diseases， reflecting the characteristics of multiple ingredients， multiple targets and multiple pathways of traditional Chinese medicine compound.

[Key words] Buyang Huanwu Decoction; Thrombosis; Network pharmacology; Target; Signaling pathways

根據(jù)全球疾病負(fù)擔(dān)（the global burden of disease， GBD）研究結(jié)果顯示，腦卒中是全球第二大致死原因[1]，其中缺血性卒中占全部腦卒中的比例為50%～70%。血栓形成是引起缺血性疾病的主要原因，因此血栓的防治在這些疾病的治療過(guò)程中顯得尤為重要。中藥方劑對(duì)于血栓疾病的預(yù)防及治療有著重要的作用，中藥方劑由多味藥組成，其療效是配伍后的有效成分共同發(fā)揮的作用。方劑的多個(gè)有效成分決定了其作用靶點(diǎn)的多樣性，使得每個(gè)復(fù)方對(duì)應(yīng)病癥都有著一個(gè)復(fù)雜但卻獨(dú)特的網(wǎng)絡(luò)，運(yùn)用這個(gè)網(wǎng)絡(luò)來(lái)分析復(fù)方的作用機(jī)制或者配伍規(guī)律使藥物和疾病之間的復(fù)雜關(guān)系更加明了化的方法稱為網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)[3-5]。

補(bǔ)陽(yáng)還五湯是治療氣虛血瘀證的經(jīng)典名方，具有補(bǔ)氣養(yǎng)血、活血通絡(luò)之功效[6]。現(xiàn)代國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)于補(bǔ)陽(yáng)還五湯對(duì)血栓形成的研究已經(jīng)從宏觀到達(dá)了分子生物學(xué)層次，但對(duì)于補(bǔ)陽(yáng)還五湯具體的作用靶點(diǎn)，參與的生物過(guò)程，調(diào)控多少條通路的系統(tǒng)研究還不太多。本文以補(bǔ)陽(yáng)還五湯為探針，以其對(duì)血栓形成的有效成分-靶點(diǎn)-通路為研究對(duì)象深入探討補(bǔ)陽(yáng)還五湯干預(yù)血栓形成的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 補(bǔ)陽(yáng)還五湯化學(xué)成分的收集與靶標(biāo)基因預(yù)測(cè)

以補(bǔ)陽(yáng)還五湯中黃芪、歸尾、赤芍、地龍、川芎、桃仁、紅花作為關(guān)鍵詞檢索中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)和分析平臺(tái)（TCMSP）得出本方所含化合物及靶基因，以口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%，類藥性（drug-like，DL）≥0.18為篩選條件，通過(guò)Uniprot將中藥對(duì)應(yīng)靶基因進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化匹配。

1.2 血栓形成疾病相關(guān)基因收集

將關(guān)鍵詞thrombosis錄入Genecard和OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)收集合并疾病相關(guān)基因。

1.3 構(gòu)建化合物-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)

利用Cytoscape軟件中的Merge插件將藥物作用靶點(diǎn)與血栓形成相關(guān)基因取交集，構(gòu)建化合物-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)。

1.4 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)（PPI）構(gòu)建

將“1.3”取得的交集基因錄入在線STRING平臺(tái)，構(gòu)建靶點(diǎn)之間的PPI，繪制PPI網(wǎng)絡(luò)圖，利用插件CentiScape得出核心基因，并以PPI中出現(xiàn)次數(shù)最多的前30個(gè)基因?yàn)榭v坐標(biāo)，以在網(wǎng)絡(luò)中出現(xiàn)的次數(shù)為橫坐標(biāo)，繪制柱形圖。

1.5 GO生物功能富集分析與KEGG信號(hào)通路富集分析

利用DAVID在線數(shù)據(jù)庫(kù)將補(bǔ)陽(yáng)還五湯作用血栓形成的靶基因進(jìn)行GO分析與KEGG通路富集分析，利用Omicshare平臺(tái)轉(zhuǎn)換成氣泡圖。

2 結(jié)果

2.1 化合物-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建。

補(bǔ)陽(yáng)還五湯775個(gè)化合物中符合篩選條件的化學(xué)成分共131個(gè)，合并藥味間共有成分，藥物有效活性成分共61個(gè)。七味藥物共5320個(gè)對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)，疾病相關(guān)基因共2423種，共得到63個(gè)疾病與藥物的交集基因。見(jiàn)圖1。

2.2 PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建及核心基因篩選

PPI網(wǎng)絡(luò)包含63個(gè)節(jié)點(diǎn)，544條相互作用關(guān)系（連線）。見(jiàn)圖2。將PPI結(jié)果以TSV形式導(dǎo)出，再導(dǎo)入Cytoscape軟件，根據(jù)“度”“度介中心度”和“接近中心度”分析網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，篩選出核心靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)。其中排在前30位的核心基因結(jié)果見(jiàn)圖3。

2.3 GO生物功能分析和KEGG通路富集分析

經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)共參與生物學(xué)過(guò)程69個(gè)，其中類固醇結(jié)合、細(xì)胞黏附分子結(jié)合、核受體活性等生物過(guò)程與血栓形成有直接關(guān)系，圖4（封三）為評(píng)分最高的前20個(gè)。共獲得了115條信號(hào)通路，其中腫瘤壞死因子（TNF）、PI3K-AKt、白細(xì)胞介素（IL）-17、核因子（NF）-κB信號(hào)通路與血栓形成聯(lián)系緊密。見(jiàn)圖5（封三）。選取與本研究相關(guān)且評(píng)分最高的TNF信號(hào)通路為例，展示以補(bǔ)陽(yáng)還五湯為探針對(duì)血栓形成影響的TNF信號(hào)通路作用圖。見(jiàn)圖6。

3 討論

血栓形成是引起心血管疾病的主要原因之一，而多數(shù)的炎癥信號(hào)通路均通過(guò)組織因子（TF）的表達(dá)、內(nèi)皮細(xì)胞和血小板活化以及聚集加劇血栓形成和發(fā)展[7]。本文通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析得出的通路中TNF、PI3K-Akt、IL-17、NF-κB信號(hào)通路均屬于炎癥信號(hào)通路，且與血栓形成有著密切關(guān)系。

TNF信號(hào)通路：TNF-α是由血管內(nèi)皮細(xì)胞等分泌的炎癥因子。TNF-α通過(guò)對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞刺激使其分泌IL-1，同時(shí)誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞中血小板活化因子（PAF）的生成，增強(qiáng)血小板的促凝功能，與血栓形成呈正相關(guān)[8-9]。TNF-α還可促進(jìn)TF的產(chǎn)生與表達(dá)，抑制血栓調(diào)節(jié)蛋白（TM）的表達(dá)，激活凝血途徑，下調(diào)機(jī)體抗凝功能[10]。TNF家族可使NF-κB通路活化，NF-κB的高度活化能紊亂微血管的纖溶系統(tǒng)，從而導(dǎo)致血栓形成[11-12]。同時(shí)，NF-κB參與重要免疫受體的調(diào)節(jié)，NF-κB的過(guò)度活化又可引起TNF-α、IL-1等致炎癥因子的大量合成和釋放[13-14]，有利于血栓的形成。

PI3K-AKt信號(hào)通路：是誘導(dǎo)血小板內(nèi)顆粒物釋放、激活及黏附的重要信號(hào)通路[15]，PI3K激酶可使血小板顆粒分泌及活化[16]，而血小板活化是引起血栓形成的主要原因之一。PI3K家族中的PI3Kγ和PI3Kβ的雙重激活使TPO通過(guò)TXA2途徑增強(qiáng)血小板功能，導(dǎo)致血管內(nèi)凝血;PI3KC2α能保持血栓在血流中形態(tài);PI3K vps34可通過(guò)影響氮氧化物的組裝調(diào)節(jié)血小板活性[17-18]。PI3K-AKt的激活還可以使下游的IκBKA上調(diào)，從而激活NF-κB通路誘導(dǎo)多種靶基因參與調(diào)控血栓形成。因此研究PI3K-AKt通路對(duì)于研究心血管疾病與血栓生成的關(guān)系具有重要意義。

IL-17信號(hào)通路：IL-17家族是一類炎癥因子，能夠誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞和細(xì)胞間黏附因子的表達(dá)。IL-17A作用于血管和心臟細(xì)胞，可導(dǎo)致炎癥、凝血和血栓形成[22]。IL-17能激活NF-κB通路，調(diào)節(jié)基因黏附分子和炎癥相關(guān)因子VCAM-1、ICAM-1、IL-6等，其中VCAM-1黏附在受損的內(nèi)皮細(xì)胞上可以誘導(dǎo)血小板活化和黏附[23]，IL-6可以誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞產(chǎn)生大量的PAF，PAF在許多心血管疾病發(fā)病過(guò)程中扮演重要角色[24-26]。

通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析顯示，補(bǔ)陽(yáng)還五湯可能以NF-κB通路為核心，通過(guò)TNF、PI3K-AKt、IL-17信號(hào)通路對(duì)抗血栓形成，下一步我們將圍繞著分析結(jié)果進(jìn)行具體的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

[參考文獻(xiàn)]

[1]? 鄧杜萍，范金，謝曉龍，等.調(diào)控缺血性腦卒中小膠質(zhì)細(xì)胞極化的藥物研究進(jìn)展[J].中國(guó)康復(fù)理論與實(shí)踐，2020， 26（5）：559-562.

[2]? Xue T. Studying traditional Chinese medicine [J]. Science，2003，300（5620）：740-741.

[3]? 宋建波，廖暉，李元平.基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討黃芪治療糖尿病腎病作用機(jī)制[J].中草藥，2020，51（11）：2988-2996.

[4]? 冉俊寧，馮君，黃巍，等.基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討柴胡三參湯治療缺血性心律失常的作用機(jī)制[J].中醫(yī)藥學(xué)報(bào)，2020， 48（3）：32-37.

[5]? Tao L，F(xiàn)an FT，Liu YP，et al. Research development on the integration effect of traditional Chinese medicine and its prescriptions [J]. Chin Pharmacol Bull，2013，29（2）：153-156.

[6]? 牛雯穎，袁茵，鄧思瑤，等.補(bǔ)陽(yáng)還五湯對(duì)氣虛血瘀模型大鼠血小板生物學(xué)指標(biāo)的影響[J].中華中醫(yī)藥雜志，2019， 34（7）：3261-3265.

[7]? 顧燕妮，謝春毅.深靜脈血栓形成炎癥信號(hào)通路研究進(jìn)展[J].中國(guó)免疫學(xué)雜志，2020，36（1）：113-118.

[8]? 王澤琴，米秀娟，陶文強(qiáng)，等.刺血醒腦法對(duì)急性腦梗死患者血清IL-1β、hs-CRP、TNF-α的影響[J].中國(guó)中醫(yī)急癥，2019，28（11）：1970-1972，1979.

[9]? Lacerda DR， Soares DD， Costa KA，et al. Mechanisms underlying fat pad remodeling induced by fasting：role of PAF receptor [J]. Nutrition，2020，71：110616.

[10]? 章平衡，劉健，談冰，等.基于Act1/NF-κB信號(hào)通路探討類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者血瘀狀態(tài)的機(jī)制及新風(fēng)膠囊對(duì)其影響[J].中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合雜志，2016，36（8）：922-928.

[11]? 陳麗萌，李學(xué)旺，林嘉友，等.洛伐他汀對(duì)高糖時(shí)人腎小管上皮細(xì)胞核因子-κB和組織纖溶酶原激活物及其抑制物的作用[J].中華腎臟病雜志，2001（6）：399-403.

[12]? 祁燕，萬(wàn)春平，李小絲，等.潰結(jié)康對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎小鼠腸黏膜炎證因子及腸屏障功能相關(guān)蛋白的影響[J].中藥藥理與臨床，2017（6）：120-124.

[13]? Lei Q，Gu H，Li L，et al. TNIP1-mediated TNF-α/NF-κB signalling cascade sustains glioma cell proliferation [J]. J Cell Mol Med，2020，24（1）：530-538.

[14]? 卞敬琦，馮月男，牛雯穎，等.血小板活化信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制研究進(jìn)展[J].天津醫(yī)藥，2018，46（1）：99-103.

[15]? Durrant TN，Hers I. PI3K inhibitors in thrombosis and cardiovascular disease [J]. Clin Transl Med，2020，9（1）：8.

[16]? 吳明娟，費(fèi)洪新，田明，等.二氫槲皮素對(duì)異丙腎上腺素所致急性心肌缺血大鼠心肌磷脂酰肌醇3-激酶/糖原合成酶激酶-3β信號(hào)通路的影響[J].中國(guó)醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2020，17（2）：15-19.

[17]? O′Brien KA，Stojanovic-Terpo A，Hay N，et al. An important rolefor Akt3 in platelet activation and thrombosis [J]. Blood，2011，118：4215-4223.

[18]? Mountford JK，Petitjean C，Putra HW，et al. The class ⅡPI3-kinase，PI3KC2，links platelet internal membrane structure to shear-dependent adhesive function [J]. Nat Commun，2015，6：6535.

[19]? 張孝麗，車立群，吳紅敬，等.FOXO3a通過(guò)PI3K/AKT信號(hào)通路介導(dǎo)炎癥因子TNF-α抑制滋養(yǎng)細(xì)胞的增殖、侵襲及促進(jìn)細(xì)胞發(fā)生凋亡[J].免疫學(xué)雜志，2020，36（6）：482-489.

[20]? 王峰，甄雅楠，劉曉鵬，等.慢性血栓栓塞性肺動(dòng)脈高壓患者血管平滑肌細(xì)胞中FoxO3a和MMP2表達(dá)升高[J].基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床，2019，39（5）：652-656.

[21]? 蘇紹紅，張琳，張俊峰.白芍總苷對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化大鼠TNF-α/P38MAPK/NF-κB/RBP4信號(hào)通路及其血清IL-17，IL-27，IL-33影響的研究[J].新中醫(yī)，2019，51（7）：18-21.

[22]? Robert M，Miossec P. Effects of Interleukin 17 on the cardiovascular system [J]. Autoimmun Rev，2017，16（9）：984-991.

[23]? 孫欣，武艷強(qiáng).血清內(nèi)臟脂肪素、核因子-κB與不穩(wěn)定型心絞痛患者血小板活化參數(shù)的關(guān)系[J].中國(guó)醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2019，16（2）：41-44，62.

[24]? 章平衡，劉健，談冰，等.新風(fēng)膠囊通過(guò)降低NF-κB通路活性改善類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者血瘀狀態(tài)[J].中華中醫(yī)藥雜志，2016，31（11）：4684-4689.

[25]? 楊淑霞，黃秀萍，李璐，等.NT-proBNP/BNP比值、CHE、IL-6與心力衰竭合并肺部感染患者心功能和感染指標(biāo)的關(guān)系[J].成都醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2019，14（3）：363-366.

[26]? 曾石鋒，楊國(guó)勛.炎癥因子與冠心病關(guān)系的進(jìn)展[J].中西醫(yī)結(jié)合心血管病電子雜志，2020，8（8）：15-16.

（收稿日期：2020-05-08）