高產(chǎn)β-環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶菌株的篩選、產(chǎn)酶條件優(yōu)化及酶學(xué)性質(zhì)研究

張興榮，李 峰，賀連智，徐 慧，譚少君，楊 丹，黃艷紅

（山東省食品發(fā)酵工業(yè)研究設(shè)計(jì)院，山東 濟(jì)南 250014）

環(huán)糊精（cyclodextrin，CD）是由D-吡喃葡萄糖通過(guò)α-1,4-糖苷鍵首尾相連而成的環(huán)狀低聚糖的總稱[1]，通常含有6～12個(gè)葡萄糖基單元，其中研究得較多的是含有6～8個(gè)葡萄糖單元的分子，分別為α-環(huán)糊精、β-環(huán)糊精、γ-環(huán)糊精[2]。其中β-環(huán)糊精具有獨(dú)特分子囊結(jié)構(gòu)[3]，該性質(zhì)近年來(lái)在食品領(lǐng)域中得到廣泛的開(kāi)拓與應(yīng)用，如轉(zhuǎn)化食品的形態(tài)、控制食品中香料及香味的揮發(fā)釋放速度、改善食品的口感等[4]。

在醬油發(fā)酵體系中β-環(huán)糊精是由β-環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶（β-cyclodextringlycosyltransferase，β-CGTase）作用于原料中的淀粉、糖原等物質(zhì)產(chǎn)生的。醬油中風(fēng)味化合物有300多種，大多數(shù)成分揮發(fā)性高且穩(wěn)定性差[5-6]，β-環(huán)糊精能與醬油中的香氣成分、維生素、色素等形成相對(duì)穩(wěn)定的復(fù)合物，在一定程度上減少其揮發(fā)和氧化[7-8]，還能夠掩蓋醬油發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生的不快氣味，改善醬油的品質(zhì)，此外它同其他糖類共同構(gòu)成了醬油的體態(tài)和甜味，在一定程度上提高了產(chǎn)品的質(zhì)量[9]。目前，研究較多的產(chǎn)β-CGTase微生物為芽孢桿菌，如地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）[10]、嗜堿芽孢桿菌（Bacillus alcalophilus）、嗜熱脂肪芽孢桿菌（Bacillus stearothermophilus）、凝結(jié)芽孢桿菌（Bacillus coagulans）[11]，而霉菌在這方面的研究較少。米曲霉是醬油生產(chǎn)過(guò)程中的重要菌株，該菌生長(zhǎng)快較粗放，產(chǎn)酶種類豐富，目前對(duì)其的研究也主要集中在果膠酶[12-13]、脂肪酶[14]、蛋白酶[15]、淀粉酶[16]等，鮮有文獻(xiàn)報(bào)道其產(chǎn)β-CGTase。

本研究從醬醪中篩選出一株產(chǎn)β-CGTase的霉菌，通過(guò)形態(tài)觀察及分子生物學(xué)技術(shù)對(duì)其菌種鑒定，采用單因素及響應(yīng)面法對(duì)其產(chǎn)酶培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化，并對(duì)其所產(chǎn)β-CGTase的酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行研究，以此為米曲霉產(chǎn)β-環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶及其在醬油中的應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)和科學(xué)的指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品

醬醪樣品：山東巧媳婦食品集團(tuán)有限公司。

1.1.2 培養(yǎng)基

分離培養(yǎng)基[17]：牛肉膏3.0 g/L、蛋白胨5.0 g/L、葡萄糖2.5 g/L、瓊脂20 g/L，自然pH，115 ℃滅菌20 min。

篩選培養(yǎng)基[18]：可溶性淀粉10 g/L、蛋白胨5 g/L，酵母膏5 g/L、K2HPO40.2 g/L、MgSO4·7H2O 0.2 g/L、Na2CO30.2 g/L、酚酞0.3 g/L、甲基橙0.1 g/L、瓊脂20 g/L，115 ℃滅菌20 min。

種子培養(yǎng)基為馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)基[19]：200 g馬鈴薯洗凈去皮切碎，加1 000 mL蒸餾水煮沸20 min，紗布過(guò)濾，加入20 g葡萄糖充分溶解，115 ℃滅菌20 min。

基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基[2]：蛋白胨10 g/L、葡萄糖20 g/L，K2HPO40.2 g/L，MgSO4·7H2O 0.2 g/L，自然pH，115 ℃滅菌20 min。

1.1.3 試劑

甲基橙、酚酞、Na2CO3、K2HPO3、MgSO4、淀粉、葡萄糖、環(huán)糊精、蔗糖、NH4Cl、（NH4）2SO4、酵母膏、蛋白胨等（均為分析純）：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；2×Taq聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）預(yù)混試劑Ⅱ、脫氧核糖核酸（desoxyribonucleic acid，DNA）提取試劑盒：天根生化科技（北京）有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

MJ-54A高壓蒸汽滅菌鍋：世得凱儀器設(shè)備（上海）有限公司；HH-BLL-600電熱恒溫培養(yǎng)箱：上海躍進(jìn)醫(yī)療機(jī)械廠；HDB-03HD生物顯微鏡：上海漢德檢測(cè)技術(shù)有限公司；JD200-3電子分析天平：沈陽(yáng)龍騰電子有限公司；SW-CJ-2FD超凈工作臺(tái)：江蘇蘇靖集團(tuán)有限公司；NSK-2102C恒溫培養(yǎng)箱：上海蘇坤實(shí)業(yè)有限公司；A200朗基全觸屏PCR儀：廣州飛迪生物科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 產(chǎn)β-環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶菌株的分離

無(wú)菌條件下稱取10 g醬醪于100 mL無(wú)菌水中，30 ℃振蕩培養(yǎng)1 h，梯度稀釋后涂布于分離培養(yǎng)基，30 ℃培養(yǎng)72 h，挑選不同形態(tài)的霉菌菌落進(jìn)行劃線，直至形成單菌落，將其劃線于斜面培養(yǎng)基，4 ℃保存。

1.3.2 產(chǎn)β-環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶菌株的篩選[20]

初篩：將分離得到的菌株接種于篩選培養(yǎng)基上，30 ℃培養(yǎng)2～3 d，觀察是否出現(xiàn)淡黃色接近無(wú)色的斑點(diǎn)，挑選出產(chǎn)透明圈的菌株。

復(fù)篩：將初篩得到的菌株接種到種子培養(yǎng)基中，30 ℃、150 r/min培養(yǎng)24 h，按照1%（V/V）的接種量將種子液接種到基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中，裝液量100 mL/250 mL，30 ℃、150 r/min條件下培養(yǎng)72 h，3 000 r/min離心10 min，制取粗酶液，參照文獻(xiàn)[11]測(cè)定酶活。

1.3.3 高產(chǎn)β-環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶菌株的鑒定

形態(tài)觀察：將篩選得到的菌株接種于分離培養(yǎng)基，30 ℃培養(yǎng)72 h，觀察菌落形態(tài)的大小，菌絲的高矮，孢子顏色等狀況，同時(shí)制水浸片觀察菌絲體有無(wú)橫隔、分生孢子梗、頂囊及分生孢子著生狀況等。

分子生物學(xué)鑒定：采用DNA提取試劑盒對(duì)篩選菌株的DNA進(jìn)行提取，以其為模板，通過(guò)引物ITS4（5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'）和ITS5（5'-GGAAGTAAAAGTCG TAACAAGG-3'）對(duì)篩選菌株的5.8 ITS rDNA基因序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增體系：模板2 μg，引物ITS4（10 μmol/L）2 μL，引物ITS5（10 μmol/L）2 μL，2×TaqMix 25 μL，加雙蒸水（ddH2O）補(bǔ)充至50 μL。PCR擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性50 s，55 ℃退火50 s，72 ℃延伸50 s，共32個(gè)循環(huán)；72 ℃再延伸10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)純化后委托鉑尚生物技術(shù)（上海）有限公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果提交至美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心（national center for biotechnology information，NCBI）的GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行BLAST同源性搜索，選同源性較高的模式菌株的5.8 ITS rDNA基因序列，使用MEGA 7.0軟件中的鄰接（neighbor-joining，NJ）法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1.3.4 菌株D5產(chǎn)β-環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶培養(yǎng)基組成優(yōu)化

（1）單因素試驗(yàn)

在基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，采用單因素輪換法，依次考察碳源種類（淀粉、環(huán)糊精、葡萄糖、蔗糖）及添加量（0.1%、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%）、氮源種類（蛋白胨、酵母膏、硫酸銨、氯化銨）及添加量（0.25%、0.50%、0.75%、1.00%、1.25%、1.50%、1.75%、2.00%）、Na2CO3添加量（0.05%、0.15%、0.25%、0.35%、0.45%、0.55%、0.65%）對(duì)菌株D5產(chǎn)β-環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶的影響。

（2）響應(yīng)面試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)，以β-環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶活力（Y）為響應(yīng)值，以淀粉添加量（A）、酵母膏添加量（B）及Na2CO3添加量（C）為考察指標(biāo)，根據(jù)Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，采用3因素3水平響應(yīng)面分析法對(duì)菌株D5產(chǎn)β-環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶的培養(yǎng)基組成進(jìn)行優(yōu)化，響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平見(jiàn)表1。

表1 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平Table 1 Factors and levels of Box-Behnken tests design

1.3.5 菌株D5產(chǎn)β-環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶發(fā)酵條件優(yōu)化

在最佳培養(yǎng)基組成的基礎(chǔ)上，依次考察培養(yǎng)溫度（20℃、25 ℃、30 ℃、35 ℃、40 ℃、45 ℃、50 ℃）及時(shí)間（12 h、24 h、36 h、48 h、60 h、72 h、84 h、96 h）對(duì)菌株D5產(chǎn)β-環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶的影響。

1.3.6 菌株D5產(chǎn)β-環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶酶學(xué)性質(zhì)的研究

（1）不同pH值對(duì)酶活性的影響

β-環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶在不同pH值（3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、10.0）的反應(yīng)體系中進(jìn)行酶促反應(yīng)，測(cè)定β-環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶的活性，以最高酶活力為100%，計(jì)算相對(duì)酶活，確定其最適反應(yīng)pH值。

（2）不同溫度對(duì)酶活性的影響

在最適pH條件下，設(shè)置反應(yīng)體系溫度為25 ℃、30 ℃、35 ℃、40 ℃、45 ℃、50 ℃、55 ℃、60 ℃、65 ℃、70 ℃、75 ℃，測(cè)定β-環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶的活性，以最高酶活力為100%，計(jì)算相對(duì)酶活，確定其最適反應(yīng)溫度。

（3）不同離子對(duì)酶活性的影響

在最適pH及溫度條件下，添加Mn2+、Fe2+、Cu2+、Zn2+、Ca2+5種離子溶液，調(diào)節(jié)離子的濃度為2.5 mmol/L，測(cè)定β-環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶的活性，以空白對(duì)照的酶活力為100%，計(jì)算相對(duì)酶活，確定其對(duì)酶促反應(yīng)的影響。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)β-環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶菌株分離及篩選結(jié)果

圖1 菌株D5的初篩結(jié)果Fig.1 Primary screen results of strain D5

圖2 3株菌所產(chǎn)β-環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶活力的測(cè)定結(jié)果Fig.2 Determination results of activity of β-CGTase produced by 3 strains

從醬醪中共分離得到5株霉菌，通過(guò)初篩得到3株產(chǎn)透明圈的菌株，編號(hào)分別為D1、D2、D5，其中菌株D5產(chǎn)生的透明圈見(jiàn)圖1。發(fā)酵后測(cè)定3株菌株的β-環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶活力，結(jié)果見(jiàn)圖2。由圖2可知，3株菌株中，菌株D5所產(chǎn)β-環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶活力最高，為1 814 U/mL，因此，選取β-環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶活力最高的菌株D5為目標(biāo)菌株。

2.2 高產(chǎn)β-環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶菌株的鑒定

2.2.1 形態(tài)觀察

菌株D5的菌落形態(tài)及菌體形態(tài)見(jiàn)圖3。由圖3可知，菌株D5在分離培養(yǎng)基上生長(zhǎng)迅速，30 ℃培養(yǎng)72 h，菌落直徑為2～3 cm。菌落初期呈白色、黃色，后期變?yōu)榈G褐色，分生孢子頭呈放射狀，孢子呈黃綠色球形，大小均勻。

圖3 菌株D5的菌落（a）及菌體（b）形態(tài)Fig.3 Colony (a) and mycelium (b) morphology of strain D5

2.2.2 分子生物學(xué)鑒定

基于菌株D5的5.8 ITS rDNA基因序列，使用MEGA 7.0軟件中的NJ法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 基于5.8 ITS rDNA基因序列菌株D5的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.4 Phylogenetic tree of strain D5 based on 5.8 ITS rDNA gene sequences

由圖4可知，菌株D5與米曲霉（Aspergillus oryzae）（MH793844.1）聚于一支，親緣關(guān)系最近，相似度為98%，結(jié)合形態(tài)觀察結(jié)果，最終鑒定菌株D5為米曲霉（Aspergillus oryzae）。

2.3 菌株D5產(chǎn)β-環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶發(fā)酵培養(yǎng)基組成優(yōu)化單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 碳源對(duì)菌株D5產(chǎn)β-環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶的影響

在基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，4種碳源對(duì)菌株D5產(chǎn)β-環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶的影響見(jiàn)圖5。由圖5可知，以淀粉為碳源時(shí)，β-環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶活力最高，為2059.01U/mL，因此選取淀粉為最佳碳源。這與曹新志等[21]對(duì)嗜堿芽孢桿菌產(chǎn)環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶最優(yōu)發(fā)酵碳源結(jié)果一致。淀粉添加量對(duì)菌株D5產(chǎn)β-環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶的影響見(jiàn)圖6。由圖6可知，隨著淀粉添加量的增加，β-環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶活力呈先升高后下降的趨勢(shì)。當(dāng)?shù)矸厶砑恿繛?.5%時(shí)，β-環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶活力最高，為2 319 U/mL，因此確定最佳淀粉添加量為1.5%。

圖5 不同碳源對(duì)菌株D5產(chǎn)β-環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶活力的影響Fig.5 Effect of different carbon sources on the activity of β-CGTase produced by strain D5

圖6 淀粉添加量對(duì)菌株D5產(chǎn)β-環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶活力的影響Fig.6 Effect of starch addition on the activity of β-CGTase produced by strain D5

2.3.2 氮源對(duì)菌株D5產(chǎn)β-環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶的影響

在最佳碳源的基礎(chǔ)上，考察氮源種類對(duì)菌株D5產(chǎn)β-環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶的影響，結(jié)果見(jiàn)圖7。由圖7可知，菌株D5能利用無(wú)機(jī)氮源，但是在添加無(wú)機(jī)氮源的條件下β-環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶活力較低，而添加酵母膏的培養(yǎng)基發(fā)酵后，β-環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶活力最高為2 161.03 U/mL，分析原因可能是酵母膏中富含多種需氨基酸、維生素、核甘酸、多肽及微量元素更適合菌株的生長(zhǎng)與產(chǎn)酶。因此選取酵母膏為最適氮源。酵母膏添加量對(duì)菌株D5產(chǎn)β-環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶的影響見(jiàn)圖8。由圖8可知，隨著酵母膏添加量的增加，β-環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶活力呈先升高后下降的趨勢(shì)。當(dāng)酵母膏添加量為1.75%時(shí)，β-環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶活力最高，為2537U/mL，因此確定最佳酵母膏添加量為1.75%。

圖7 不同氮源對(duì)菌株D5產(chǎn)β-環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶活力的影響Fig.7 Effect of different nitrogen sources on the activity of β-CGTase produced by strain D5

圖8 不同酵母膏添加量對(duì)菌株D5產(chǎn)β-環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶活力的影響Fig.8 Effect of yeast extract addition on the activity of β-CGTase produced by strain D5

2.3.3 Na2CO3添加量對(duì)菌株D5產(chǎn)β-環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶的影響

在最優(yōu)氮源和碳源的基礎(chǔ)上，考察不同的Na2CO3添加量對(duì)菌株D5產(chǎn)β-環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶的影響，結(jié)果見(jiàn)圖9。

圖9 Na2CO3添加量對(duì)菌株D5產(chǎn)β-環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶的影響Fig.9 Effect of Na2CO3 addition on the activity of β-CGTase produced by strain D5

由圖9可知，隨著Na2CO3添加量的增加，β-環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶活力呈先升高后下降的趨勢(shì)。當(dāng)Na2CO3添加量為0.35%時(shí)，β-環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶活力最高，為2788U/mL，因此確定最佳Na2CO3添加量為0.35%。

2.4 菌株D5產(chǎn)β-環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶發(fā)酵培養(yǎng)基組成優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以β-環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶活力（Y）為響應(yīng)值，淀粉添加量（A）、酵母膏添加量（B）及Na2CO3添加量（C）為自變量，根據(jù)Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，采用3因素3水平響應(yīng)面分析法對(duì)菌株D5產(chǎn)β-環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶的培養(yǎng)基組成進(jìn)行優(yōu)化，試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見(jiàn)表2，方差分析結(jié)果見(jiàn)表3。

表2 菌株D5產(chǎn)β-環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶發(fā)酵培養(yǎng)基組成優(yōu)化Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Design and results of Box-Behnken tests for fermentation medium component optimization of β-CGTase production by strain D5

表3 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果方差分析Table 3 Analysis of variance of response surface test results

采用Design-Expert V8.0.6軟件對(duì)表2的結(jié)果進(jìn)行回歸性分析，以酶活（Y）為因變量，淀粉添加量（A）、酵母膏添加量（B）、Na2CO3添加量（C）為自變量，建立回歸方程：

由表3可知，模型的P＜0.05，顯著，失擬值P＞0.05，不顯著，說(shuō)明該模型較為適合，試驗(yàn)點(diǎn)均可用模型描述。此外，決定系數(shù)R2為0.991 5，表明該模型有較好的可信度，即該模型能夠很好的解釋發(fā)酵培養(yǎng)基組成對(duì)菌株D5產(chǎn)β-環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶活力的影響。由表3亦可知，一次項(xiàng)A及二次項(xiàng)C2對(duì)結(jié)果影響極顯著（P＜0.01），一次項(xiàng)B及二次項(xiàng)B2對(duì)結(jié)果影響顯著（P＜0.05），其他因素對(duì)結(jié)果影響不顯著（P＞0.05）。根據(jù)離散分析，3個(gè)因素的影響顯著性排序?yàn)锳＞B＞C，即淀粉添加量＞酵母膏添加量＞碳酸鈉添加量。

根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果建立響應(yīng)面分析圖，結(jié)果見(jiàn)圖10。

圖10 各因素交互作用對(duì)菌株D5產(chǎn)β-環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶活力影響的響應(yīng)面及等高線Fig.10 Response surface plots and contour lines of effects of interaction between each factors on the activity of β-CGTase produced by strain D5

由圖10可知，淀粉與酵母膏添加量之間的交互作用對(duì)β-環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶活力的影響最大，其次是淀粉添加量與Na2CO3添加量的交互作用，酵母膏添加量與Na2CO3添加量的交互作用最小，與方差分析結(jié)果一致。

由模型計(jì)算得到最佳培養(yǎng)基組成為淀粉添加量2.5%，酵母膏添加量1.85%，Na2CO3添加量0.35%，在此優(yōu)化條件下，菌株D5產(chǎn)β-環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶的酶活為3017.10U/mL。

2.5 菌株D5產(chǎn)β-環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶發(fā)酵條件的研究

2.5.1 發(fā)酵溫度對(duì)菌株D5產(chǎn)β-環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶的影響

發(fā)酵溫度對(duì)菌株D5產(chǎn)β-環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶活力的影響見(jiàn)圖11。由圖11可知，隨著發(fā)酵溫度的升高，β-環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶活力呈先升高后下降的趨勢(shì)，溫度對(duì)米曲霉的生長(zhǎng)狀態(tài)有重要影響，溫度較低或較高都會(huì)對(duì)其生長(zhǎng)有抑制作用，其產(chǎn)酶過(guò)程也相應(yīng)的受到抑制。當(dāng)發(fā)酵溫度為30 ℃時(shí)，β-環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶活力最高，為3 099.17 U/mL。因此，確定最優(yōu)發(fā)酵溫度為30 ℃，這與朱德艷[22]的研究結(jié)果一致。

圖11 不同發(fā)酵溫度對(duì)菌株D5產(chǎn)β-環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶活力的影響Fig.11 Effect of different fermentation temperature on the activity of β-CGTase produced by strain D5

2.5.2 發(fā)酵時(shí)間對(duì)菌株D5產(chǎn)β-環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶的影響

圖12 不同發(fā)酵時(shí)間對(duì)菌株D5產(chǎn)β-環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶活力的影響Fig.12 Effect of different fermentation time on the activity of β-CGTase produced by strain D5

發(fā)酵時(shí)間對(duì)菌株D5產(chǎn)β-環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶酶活的影響見(jiàn)圖12。由圖12可知，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)β-環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶活力逐漸升高；當(dāng)發(fā)酵時(shí)間為72 h時(shí)，酶活最高為3 208.01 U/mL；隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)逐漸消耗不利于產(chǎn)酶，因此確定最優(yōu)的發(fā)酵時(shí)間為72 h。

2.6 菌株D5產(chǎn)β-環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶酶學(xué)性質(zhì)研究結(jié)果

2.6.1 pH對(duì)β-環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶活力的影響

pH對(duì)β-環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶活力的影響見(jiàn)圖13。由圖13可知，隨著反應(yīng)體系pH值在3.0～8.5范圍內(nèi)升高，β-環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶的活力呈上升趨勢(shì)。當(dāng)反應(yīng)體系的pH值＞8.5之后酶活開(kāi)始下降，這表明反應(yīng)液的pH值太高不利于β-環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶的催化降解反應(yīng)，因此確定其酶解的最適反應(yīng)pH值為8.5，可見(jiàn)該酶是一種堿性β-CGTase。在不同pH條件下底物分子和酶分子的帶電狀態(tài)不同，從而影響酶和底物的結(jié)合，影響酶的穩(wěn)定性。孟艷芬等[23]在對(duì)芽孢桿菌產(chǎn)生的β-CGTase酶學(xué)性質(zhì)的研究中得出其最適pH值為9.0，同為堿性β-CGTase。

圖13 不同pH值對(duì)β-環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶活力的影響Fig.13 Effect of different pH on the activity of β-CGTase

2.6.2 溫度對(duì)β-環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶活力的影響

圖14 不同溫度對(duì)β-環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶活力的影響Fig.14 Effect of different temperature on the activity of β-CGTase

在最適pH 8.5的條件下，溫度對(duì)β-環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶活力的影響見(jiàn)圖14。由圖14可知，隨著反應(yīng)體系溫度在25～50 ℃范圍內(nèi)升高，β-環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶的相對(duì)酶活呈上升趨勢(shì)，當(dāng)反應(yīng)體系的溫度＞50 ℃之后，β-環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶的相對(duì)酶活開(kāi)始下降，這表明溫度太高不利于β-環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶的催化降解反應(yīng)，因此確定該酶的最適反應(yīng)溫度為50 ℃。

2.6.3 金屬離子對(duì)β-環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶活力的影響

金屬離子對(duì)β-環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶的影響見(jiàn)圖15。由圖15可知，Mn2+、Fe2+、Cu2+、Zn2+、Ca2+對(duì)β-CGTase的活力有一定影響，Ca2+對(duì)酶活的影響較小，其他離子均對(duì)該酶的活力有抑制作用，其抑制程度的大小分別為Zn2+＞Mn2+＞Cu2+＞Fe2+，與孟艷芬等[23]的研究結(jié)果一致。

圖15 不同金屬離子對(duì)β-環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶活力的影響Fig.15 Effect of different metal ions on the activity of β-CGTase

3 結(jié)論

本研究從醬醪中篩選得到一株高產(chǎn)β-環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶（β-CGTase）菌株D5，通過(guò)形態(tài)觀察及分子生物學(xué)鑒定其為米曲霉（Aspergillus oryzae），采用單因素輪換法和響應(yīng)面法對(duì)該菌產(chǎn)酶培養(yǎng)基組成進(jìn)行優(yōu)化，得出最佳培養(yǎng)基組成為淀粉2.5%、酵母膏1.85%、Na2CO30.35%、K2HPO40.02%、MgSO4·7H2O0.02%，最佳發(fā)酵溫度為30℃，發(fā)酵時(shí)間為72 h，在此最優(yōu)發(fā)酵條件下，β-CGTase活力為3 208.01 U/mL。β-CGTase的最適反應(yīng)溫度為50 ℃、最適反應(yīng)pH值為8.5，除Ca2+外，Mn2+、Fe2+、Cu2+、Zn2+對(duì)該酶的活力有抑制作用，其抑制程度大小為Zn2+＞Mn2+＞Cu2+＞Fe2+。β-CGTase是醬油發(fā)酵體系中研究較少的一種酶類，米曲霉產(chǎn)β-CGTase的研究能夠指導(dǎo)醬油的釀造過(guò)程，對(duì)改善醬油的品質(zhì)有重要意義。