復(fù)方替硝唑溶液制備工藝影響因素考察及其穩(wěn)定性研究

龔 亞，李 敏，曹 健

(陸軍軍醫(yī)大學(xué)第二附屬醫(yī)院藥劑科，重慶 400037)

復(fù)方替硝唑溶液在臨床上可用于口腔厭氧菌感染及其他細(xì)菌感染引起的咽峽炎、牙周炎及口腔潰瘍等，其主藥為替硝唑和醋酸氯己定[1]。復(fù)方替硝唑溶液為某三級(jí)甲等醫(yī)院口腔科治療厭氧菌常用漱口水之一，據(jù)統(tǒng)計(jì)，2019年其口腔科門(mén)診適應(yīng)證患者使用該藥的百分比為26%。鑒于替硝唑和醋酸氯己定均在水中微溶，制備工藝中常采用熱水溶解主藥后冷卻，再進(jìn)行后續(xù)制備[1-3]。然而，在制劑配制量較大的情況下，溶液初始溫度較高、冷卻時(shí)間較長(zhǎng)可能影響藥物的穩(wěn)定性[4]。本研究對(duì)替硝唑和醋酸氯己定溶液的水浴溫度和時(shí)間進(jìn)行考察，明確其對(duì)復(fù)方替硝唑溶液制備工藝的影響；并參考相關(guān)文獻(xiàn)[5-12],采用經(jīng)典恒溫加熱法對(duì)復(fù)方替硝唑溶液進(jìn)行穩(wěn)定性預(yù)測(cè)，為實(shí)際生產(chǎn)條件提供參考。

1 材料

1.1 儀器

Agilent 1200型高效液相色譜儀，包括脫氣機(jī)、四元泵、自動(dòng)進(jìn)樣系統(tǒng)、柱溫箱、G1314B紫外檢測(cè)器及Chemstation工作站(美國(guó)Agilent公司)；DF-101S集熱式加熱攪拌器(常州普天儀器制造有限公司)；PHS-3C型精密pH計(jì)(上海雷磁儀器廠)；ME235S十萬(wàn)分之一電子天平(德國(guó)Sartorius公司)。

1.2 藥品與試劑

替硝唑?qū)φ掌?中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)為100336-200703，純度99.8%)；醋酸氯己定對(duì)照品(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)為100183-201003，純度96.2%)；替硝唑原料藥(浙江蘇泊爾制藥有限公司，批號(hào)為001-180446，純度99.7%)；醋酸氯己定原料藥(錦州九泰藥業(yè)有限責(zé)任公司，批號(hào)為161105，純度99.8%)；復(fù)方替硝唑溶液(陸軍軍醫(yī)大學(xué)第二附屬醫(yī)院，批號(hào)為190624)。甲醇為色譜純；磷酸二氫鉀、磷酸為分析純；水為純化水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱為依利特Hypersil BDS-C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相以甲醇為A相，甲醇-0.05 mol/L磷酸二氫鉀溶液(pH=3.5)(V∶V=20∶80)為B相，梯度洗脫(0～8 min，0% A→55% A；8～15 min，55% A；15～15.1 min，55% A→0% A；15.1～20 min，0% A)；檢測(cè)波長(zhǎng)280 nm；流速1.0 ml/min；柱溫25 ℃；采集時(shí)間20 min；進(jìn)樣量10 μl[13]。

2.2 溶液的制備

2.2.1 替硝唑?qū)φ掌啡芤旱闹苽洌壕芊Q(chēng)取替硝唑?qū)φ掌愤m量，置于容量瓶中，加水溶解并稀釋制成約含替硝唑0.2 mg/ml的溶液，作為替硝唑?qū)φ掌啡芤骸?/p>

2.2.2 醋酸氯己定對(duì)照品溶液的制備：精密稱(chēng)取醋酸氯己定對(duì)照品適量，置于容量瓶中，加水溶解并稀釋制成約含醋酸氯己定0.2 mg/ml的溶液，作為醋酸氯己定對(duì)照品溶液。

2.2.3 混合對(duì)照品溶液的制備：分別精密稱(chēng)取替硝唑、醋酸氯己定對(duì)照品各適量，置于同一容量瓶中，加水溶解并稀釋制成約含替硝唑、醋酸氯己定各0.2 mg/ml的溶液，作為混合對(duì)照品溶液。

2.2.4 供試品溶液的制備：上述同法采用替硝唑和醋酸氯己定原料藥制備替硝唑溶液、醋酸氯己定溶液及其混合溶液，各溶液中替硝唑和醋酸氯己定含量均約為0.2 mg/ml。

2.3 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

取混合對(duì)照品溶液、復(fù)方替硝唑溶液和復(fù)方替硝唑溶液加速試驗(yàn)樣品(90 ℃水浴1 h)適量，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖，見(jiàn)圖1。由圖1可知，主成分替硝唑、醋酸氯己定的出峰時(shí)間分別為6.1、14.6 min，二者分離度>1.5，理論板數(shù)均>2 000，出峰順序與文獻(xiàn)[13]報(bào)道一致。

A.混合對(duì)照品；B.復(fù)方替硝唑溶液；C.復(fù)方替硝唑溶液加速 試驗(yàn)樣品(90 ℃水浴1 h)； 1.替硝唑；2.醋酸氯己定A. mixed reference substance; B. compound tinidazole solution; C.accelerated test sample of compound tinidazole solution (water bath at 90 ℃ for 1 h)； 1. tinidazole; 2. chlorohexidine acetate圖1 系統(tǒng)適用性高效液相色譜圖Fig 1 HPLC chromatograms of instrument suitability

2.4 溫度和時(shí)間的考察

將替硝唑溶液、醋酸氯己定溶液、混合溶液分別置于50、60、70、80及90 ℃恒溫水浴鍋中，于0、1、2、4、6和8 h取樣，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件，測(cè)定替硝唑降解產(chǎn)物(保留時(shí)間為4.6 min)、替硝唑(保留時(shí)間為6.1 min)和醋酸氯己定(保留時(shí)間為14.6 min)的相對(duì)百分含量。替硝唑及其降解產(chǎn)物含量見(jiàn)圖2—3，醋酸氯己定在本研究條件下降解量<3%。由圖2—3可知，降解產(chǎn)物在替硝唑溶液中的出現(xiàn)時(shí)間為70 ℃下6 h、80和90 ℃下1 h，在混合溶液中分別為60 ℃下8 h、70 ℃下2 h、80和90 ℃下1 h。結(jié)果表明，隨溫度升高、時(shí)間延長(zhǎng)，替硝唑含量降低，降解產(chǎn)物隨之增多，且醋酸氯己定的存在對(duì)替硝唑的降解具有協(xié)同作用，故復(fù)方替硝唑溶液配制過(guò)程中建議替硝唑在60 ℃以下單獨(dú)溶解；醋酸氯己定在本研究條件下相對(duì)穩(wěn)定。

2.5 復(fù)方替硝唑溶液穩(wěn)定性預(yù)測(cè)

按經(jīng)典恒溫加熱法，將復(fù)方替硝唑溶液分裝于干燥潔凈的100 ml容量瓶中，分別置于50、60、70、80、85、90及95 ℃恒溫水浴鍋中，于0、6、12、24、36和48 h取樣，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件，測(cè)定替硝唑和醋酸氯己定的濃度。測(cè)定結(jié)果顯示，醋酸氯己定穩(wěn)定性遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于替硝唑，替硝唑降解情況見(jiàn)圖4。

表1 復(fù)方替硝唑溶液中替硝唑降解速率常數(shù)Tab 1 Degradation rate constant of tinidazole in compound tinidazole solution

3 討論

某院自制制劑留樣觀察結(jié)果證明，復(fù)方替硝唑溶液在

A.50 ℃；B.60 ℃；C.70 ℃；D.80 ℃；E.90 ℃A.50 ℃; B. 60 ℃; C. 70 ℃; D. 80 ℃; E. 90 ℃圖2 溫度和時(shí)間對(duì)替硝唑含量的影響Fig 2 Effects of temperature and time on the contents of tinidazole

A.50 ℃；B.60 ℃；C.70 ℃；D.80 ℃；E.90 ℃A. 50 ℃; B. 60 ℃; C. 70 ℃; D. 80 ℃; E. 90 ℃圖3 溫度和時(shí)間對(duì)替硝唑降解產(chǎn)物含量的影響Fig 3 Effects of temperature and time on the contents of degradation product of tinidazole

圖4 溫度和時(shí)間對(duì)復(fù)方替硝唑溶液中替硝唑含量的影響Fig 4 Effects of temperature and time on the contents of tinidazole in compound tinidazole solution

1年有效期內(nèi)穩(wěn)定性良好。復(fù)方替硝唑溶液留樣觀察、穩(wěn)定性預(yù)測(cè)及替硝唑溶液溫度考察圖譜中，均出現(xiàn)同一降解產(chǎn)物峰，結(jié)合文獻(xiàn)，推測(cè)該降解產(chǎn)物為2-甲基-5-硝基咪唑(替硝唑雜質(zhì)Ⅰ)[15-18]，為該制劑有關(guān)物質(zhì)的考察提供了參考。

醋酸氯己定相對(duì)穩(wěn)定[19-20]。在復(fù)方替硝唑溶液生產(chǎn)和儲(chǔ)存過(guò)程中主要考慮替硝唑的穩(wěn)定情況。醋酸氯己定對(duì)替硝唑的降解具有協(xié)同作用，經(jīng)測(cè)定，本研究中替硝唑溶液、醋酸氯己定溶液及混合溶液的pH分別為5.8、6.5及6.7。涂家生等[15]的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，替硝唑溶液在pH為4.0～5.5范圍內(nèi)最穩(wěn)定，當(dāng)pH>6.5，則降解明顯加快。因此，推測(cè)該協(xié)同作用是醋酸氯己定引起溶液pH改變所致。

《中華人民共和國(guó)藥典》[2]凡例中規(guī)定，熱水溫度指70～80 ℃。經(jīng)驗(yàn)證，替硝唑和醋酸氯己定的溶解度分別為4.7和12.8 mg/ml(25 ℃)。實(shí)際生產(chǎn)過(guò)程中，替硝唑和醋酸氯己定在初步溶解階段，其濃度遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于本研究所用的溶液濃度，且生產(chǎn)量大、冷卻時(shí)間長(zhǎng)，因此，工藝中采用熱水助溶對(duì)替硝唑含量的影響更大。鑒于醋酸氯己定對(duì)替硝唑的降解具有協(xié)同作用，在復(fù)方替硝唑溶液配制過(guò)程中，結(jié)合實(shí)際工作，建議替硝唑在60 ℃以下單獨(dú)溶解，減少降解產(chǎn)物的生成。