高效液相色譜法測(cè)定曼陀羅子不同炮制品中阿托品與東莨菪堿的含量Δ

朱衛(wèi)敏，鄧朝暉，姚 強(qiáng)，裴貴珍，賈麗華

(新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)醫(yī)院藥學(xué)部，新疆 烏魯木齊 830000)

曼陀羅子為茄科植物曼陀羅的干燥成熟種子，是維吾爾醫(yī)習(xí)用藥材，有毒，具有鎮(zhèn)靜、止癰、安神、止咳、平喘的功效，主要用于治療關(guān)節(jié)骨痛、胃痛腹痛和咳嗽氣喘等[1]。因曼陀羅子有毒，臨床應(yīng)用需特別謹(jǐn)慎，一般用量為0.05～0.1 g，用量稍大，可能會(huì)出現(xiàn)中毒反應(yīng)[2-5]。本研究采用高效液相色譜法(high performance liquid chromatography，HPLC)測(cè)定兩種不同炮制方法(甘草制和醋制)制成的曼陀羅子中阿托品和東莨菪堿的含量，并與生品進(jìn)行對(duì)比，比較三者的成分含量，為臨床安全用藥提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)[6-8]。

1 材料

1.1 儀器

Waters 2695 型高效液相色譜儀(美國(guó)waters公司);C21-WK2102型電磁爐(廣東美的生活電器制造有限公司);多功能粉碎機(jī)(九太800Y，永康市鉑歐五金制品有限公司);KQ5200DA型數(shù)控超聲儀(昆山市超聲儀器有限公司)。

1.2 試劑

氫溴酸東莨菪堿對(duì)照品(批號(hào)為AF8071307，中國(guó)藥品生物制品檢定所)；硫酸阿托品對(duì)照品(批號(hào)為AF8041420，中國(guó)藥品生物制品檢定所)；甲醇為色譜純(Fisher公司)，水為二次蒸餾水， 其他試劑均為分析純，使用前均經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾。

1.3 藥品

曼陀羅種子自購(gòu)，經(jīng)劉強(qiáng)教授鑒定為正品曼陀羅種子。(1)生品，將曼陀羅子藥材通過挑選的方法除去石頭、泥沙及碎屑等雜質(zhì)，備用。(2)醋制品，取凈選后的曼陀羅子藥材500 g，加入醋(乙酸含量5%)10 g，泡潤(rùn)，待藥材吸盡醋后放入鍋中，以160 ℃的溫度不停翻炒，炒制10 min，放涼過篩后備用[9]。(3)甘草制品，取甘草片100 g，加水浸泡30 min，煎煮3次，每次30 min，合并甘草汁，得藥汁300 ml；稱取曼陀羅子藥材500 g，加入甘草汁300 ml后悶潤(rùn)，待吸盡藥汁后炒制，炒制溫度控制在160 ℃，炒制10 min，放涼過篩后備用[10-11]。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

Super C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動(dòng)相甲醇-水(V∶V=30∶70，水中含0.02 mol/L醋酸鈉溶液、0.02%三乙胺，用醋酸調(diào)pH至6.0)，流速1.0 ml/min，檢測(cè)波長(zhǎng)215 nm，柱溫室溫(25 ℃)，進(jìn)樣量10 μl[12]。在該色譜條件下待測(cè)組分可達(dá)到基線分離，見圖1。

A.對(duì)照品；B.樣品；1.氫溴酸東莨菪堿；2.硫酸阿托品A. reference substance; B. sample; 1. scopolamine hydrobromide; 2. atropine sulfate圖1 曼陀羅子生品的HPLC圖Fig 1 HPLC of Datura stramonium L.

2.2 對(duì)照品溶液的制備

精確稱取適量氫溴酸東莨菪堿、硫酸阿托品對(duì)照品，用二次蒸餾水溶解并定容于2 ml容量瓶中，分別配制成含氫溴酸東莨菪堿、硫酸阿托品均為1.0 mg/ml的混合對(duì)照品溶液[13]。

2.3 供試品溶液的制備

將曼陀羅子生品和兩種炮制品粉碎后，過80目篩，取三種藥材粉末各5 g，精密稱定，置錐形瓶中，加入2 mol/L鹽酸溶液10 ml，超聲處理(功率250 W，頻率40 kHz)30 min，放冷，濾過，濾渣和濾器用2 mol/L鹽酸溶液10 ml分?jǐn)?shù)次洗滌，合并濾液和洗液，用濃氨試液調(diào)節(jié)pH至9，用三氯甲烷振搖提取4次，每次10 ml，合并三氯甲烷液，回收溶劑至干，殘?jiān)昧鲃?dòng)相溶解，轉(zhuǎn)移至10 ml容量瓶中，加流動(dòng)相至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得[14]。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線及檢出限

取適量對(duì)照品儲(chǔ)備液，分別配制成質(zhì)量濃度為1.38 mg/ml的氫溴酸東莨菪堿和1.075 mg/ml的硫酸阿托品對(duì)照溶液。按“2.1”項(xiàng)下方法進(jìn)樣，測(cè)定峰面積(Y,mAU)，以對(duì)照品質(zhì)量為橫坐標(biāo)(X，μg)作圖，回歸分析得出2種組分的標(biāo)準(zhǔn)曲線，見表1。

2.5 精密度試驗(yàn)

在“2.1”項(xiàng)色譜條件下，取氫溴酸東莨菪堿和硫酸阿托品質(zhì)量濃度分別為1.38、1.075 mg/ml的混合對(duì)照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣5次，測(cè)得氫溴酸東莨菪堿和硫酸阿托品峰面積的RSD分別為0.23%、0.22%，均<2.0%，表明儀器精密度良好。

表1 兩種有效成分的標(biāo)準(zhǔn)曲線與線性范圍Tab 1 linearity and equation of two effective components

2.6 重復(fù)性試驗(yàn)

準(zhǔn)確稱取同一批樣品5份約5.0 g，按“2.3”項(xiàng)下方法處理，在相同色譜條件下，分別取供試品溶液10 μl進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果顯示，氫溴酸東莨菪堿和硫酸阿托品的RSD分別為1.5%、1.4%。

2.7 加樣回收率試驗(yàn)

準(zhǔn)確稱取已知含量的同批樣品5份約5.0 g，分別加入與樣品中氫溴酸東莨菪堿和硫酸阿托品相當(dāng)?shù)膶?duì)照品，按“2.3”項(xiàng)下方法處理，按“2.1”項(xiàng)下條件檢測(cè)，測(cè)定其加樣回收率，結(jié)果見表2。

表2 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果Tab 2 Results of recovery test

2.8 含量測(cè)定

精密稱定甘草制、醋制和生品曼陀羅子各3份，按“2.3”項(xiàng)下方法處理，按“2.1”項(xiàng)下條件進(jìn)樣，記錄峰面積并計(jì)算出東莨菪堿和阿托品的含量，見表3—4(表中，S1、S2、S3為曼陀羅子生品三組平行樣品；C1、C2、C3為曼陀羅子醋制三組平行樣品；G1、G2、G3為曼陀羅子甘草制三組平行樣品)。由于曼陀羅子的主要毒性成分為生物堿，本研究選用東莨菪堿和阿托品2種成分作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，來判斷哪種炮制方法可以降低上述成分的含量。分析數(shù)據(jù)可知：甘草制和醋制均能降低曼陀羅子中東莨菪堿和阿托品的含量，其中甘草制曼陀羅子中阿托品的含量明顯低于醋制品，而東莨菪堿在兩種炮制品中含量相差不大。綜合分析可得，用甘草汁炮制曼陀羅子的方法優(yōu)于醋制法。

表3 不同炮制品中東莨菪堿的含量Tab 3 Content of scopolamine in different processed products

表4 不同炮制品中阿托品的含量Tab 4 Content of atropine in different processed products

3 討論

甘草具有緩解藥物毒性、烈性的作用[6]。本研究采用甘草炮制曼陀羅子來降低曼陀羅子的毒性。醋的味酸、苦，性溫，并能除臭矯味，除去藥材的腥臭和毒性。曼陀羅子的主要毒性成分是生物堿，經(jīng)醋制后可以中和游離生物堿，降低曼陀羅子的毒性。

曼陀羅子為種子類藥材，含有油脂，三氯甲烷萃取過程中乳化現(xiàn)象比較嚴(yán)重，需采用靜置、加熱等方法來消除乳化現(xiàn)象。

參照文獻(xiàn)[9],以甲醇-水(V∶V=40∶60)為流動(dòng)相，水相中含0.02 mol/L醋酸鈉、0.02%三乙胺，用醋酸調(diào)節(jié)pH至6.0，結(jié)果出峰時(shí)間不夠理想，氫溴酸東莨菪堿的出峰時(shí)間在5 min之前且峰形不好。嘗試調(diào)節(jié)甲醇相與水相的比例，出峰時(shí)間相應(yīng)延長(zhǎng)，并得到了很好的分離效果。

本研究通過對(duì)曼陀羅子生品、甘草制品及醋制品中2種毒性成分的含量進(jìn)行對(duì)比，最終確定甘草汁炮制曼陀羅子減毒的效果優(yōu)于醋制法，可為今后臨床安全用藥提供依據(jù)。