葛花總黃酮對(duì)2型糖尿病大鼠認(rèn)知功能障礙及海馬中腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子表達(dá)的影響Δ

徐 琳，李建霞，趙維娟，許雪廷，李 娜，周 燕，洪福娣

(1.北京朝陽(yáng)急診搶救中心藥劑科，北京100000； 2.中國(guó)人民解放軍總醫(yī)院第七醫(yī)學(xué)中心藥理科，北京 100700)

2型糖尿病(type 2 diabetes，T2DM)老年患者數(shù)迅速增加，已成為一個(gè)重大的公共衛(wèi)生問(wèn)題[1]。衰老和糖尿病與認(rèn)知功能障礙風(fēng)險(xiǎn)增加有關(guān)[2]。目前可獲得的研究數(shù)據(jù)表明，伴隨動(dòng)脈粥樣硬化疾病，腦血管或其他疾病可能是T2DM患者認(rèn)知減退的重要決定因素[3]。最近，一些放射學(xué)研究結(jié)果表明，糖尿病患者的認(rèn)知障礙伴有腦萎縮和缺血性白質(zhì)病變。由腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(BDNF)基因編碼的BDNF是生長(zhǎng)因子的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)蛋白家族成員，并且存在于腦和外周。BDNF在大腦中的主要作用是支持有絲分裂后神經(jīng)元的存活以及新神經(jīng)元、突觸的生長(zhǎng)和分化[4]。BDNF在對(duì)學(xué)習(xí)、記憶和執(zhí)行功能至關(guān)重要的區(qū)域中表達(dá)，即海馬、皮質(zhì)和基底前腦。BDNF可激活細(xì)胞內(nèi)絲裂原活化蛋白激酶/細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶級(jí)聯(lián)信號(hào)通路，影響突觸可塑性和緩解抑郁癥狀[5]。葛花總黃酮可有效清除自由基，抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡[6]。本研究擬探討葛花總黃酮對(duì)T2DM大鼠認(rèn)知功能障礙及海馬中BDNF表達(dá)的影響，為T2DM認(rèn)知功能障礙的治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物及分組

清潔級(jí)Wistar大鼠，6～8周齡，170～220 g，雌雄各半，購(gòu)自北京維通利華公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(京)2018-0013，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK(京)2018-0061，動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)：2019031309。大鼠喂養(yǎng)在單獨(dú)的籠子里(濕度：60±5%，12 h黑暗/光照循環(huán))，自由飲水、進(jìn)食。隨機(jī)分為5組：對(duì)照組、模型組、吡拉西坦組[10 mg/kg，預(yù)實(shí)驗(yàn)求出吡拉西坦對(duì)2型糖尿病大鼠的半數(shù)有效量(ED50)為20 mg/kg，以1/2 ED50為作用劑量]、葛花總黃酮低劑量組(20 mg/kg，預(yù)實(shí)驗(yàn)求出葛花總黃酮對(duì)2型糖尿病大鼠的ED50為80 mg/kg，以1/4 ED50為作用劑量)、葛花總黃酮高劑量組(40 mg/kg，預(yù)實(shí)驗(yàn)求出葛花總黃酮對(duì)2型糖尿病大鼠的ED50為80 mg/kg，以1/2 ED50為作用劑量)，每組20只。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)過(guò)中國(guó)人民解放軍總醫(yī)院動(dòng)物倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。

1.2 藥品、試劑及儀器

葛花總黃酮、吡拉西坦(純度均為99.99%，美國(guó)Sigma公司，批號(hào)為SR0607、SJ5037)；鏈脲佐菌素(STZ，寶生物工程大連有限公司，批號(hào)為040M1357)；DAB顯色試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司，批號(hào)為190107)；EXPRESS一步法SYBR?GreenERTMSuperMix試劑盒(美國(guó)賽默飛世爾科技公司，批號(hào)為SC0132-6)；聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100)、磷酸緩沖鹽溶液(PBS)、Trizol試劑(碧云天生物技術(shù)研究所，批號(hào)為C5514、C0722及ST-1337)；BDNF兔抗體、山羊抗兔二抗(上海斯信生物科技有限公司，批號(hào)為M9 012 K、M7205S)；抗生物素蛋白-生物素-過(guò)氧化物酶復(fù)合物試劑盒(美國(guó)Vector Laboratories公司，批號(hào)為SC8023)；3,3-二氨基聯(lián)苯胺四鹽酸試劑、甲酚紫乙酸酯溶液(上海北諾生物科技有限公司，批號(hào)為190314、190208)；白細(xì)胞介素4(IL-4)、白細(xì)胞介素8(IL-8)及腫瘤壞死因子α(TNF-α)酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定試劑盒(上海邦奕生物科技有限公司，批號(hào)為SV916、SV009及SV753)。MK3型酶標(biāo)儀(美國(guó)熱電公司)；OlympusCX43型顯微鏡(日本奧林巴斯公司)；NanoDrop 2000 UV-vis型分光光度計(jì)(美國(guó)Thermo Scientific公司)；AS-98 StepOneTM型實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)(美國(guó)ABI公司)。

1.3 各實(shí)驗(yàn)組的制備

對(duì)照組大鼠喂食標(biāo)準(zhǔn)飼料。模型組、吡拉西坦組及葛花總黃酮組(低及高劑量組)大鼠喂食高脂高糖飼料，持續(xù)4周；于大鼠腹腔一次性注射STZ，劑量為50 mg/kg，72 h后檢測(cè)血糖，1周內(nèi)血糖保持>16.7 mmol/L被認(rèn)為是T2DM模型建立成功[7]。從建模成功后第1日開始，吡拉西坦組、葛花總黃酮組大鼠分別給予吡拉西坦(10 mg/kg)、葛花總黃酮(低及高劑量組：20、40 mg/kg)灌胃，對(duì)照組和模型組大鼠灌胃0.9%氯化鈉溶液，1日1次，持續(xù)給予140 d，各組給藥體積均為10 ml/kg。

1.4 Morris水迷宮試驗(yàn)

參考相關(guān)文獻(xiàn)，記錄大鼠從入水點(diǎn)找到平臺(tái)所需的時(shí)間(即逃避潛伏期時(shí)間)、經(jīng)過(guò)原平臺(tái)位置的次數(shù)及原平臺(tái)象限停留時(shí)間等指標(biāo)[8]。

1.5 大鼠海馬神經(jīng)元病理學(xué)觀察

大鼠海馬神經(jīng)元組織常規(guī)脫水、脫蠟、包埋，蘇木精-伊紅(HE)染色，觀察病理學(xué)結(jié)構(gòu)變化。

1.6 大鼠海馬組織BDNF mRNA表達(dá)水平測(cè)定

使用Trizol試劑從大鼠海馬中提取總RNA,使用NanoDrop 2000 UV-vis型分光光度計(jì)評(píng)估分離的RNA的數(shù)量和質(zhì)量。在AS-98 StepOneTM型實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)上使用EXPRESS一步法SYBR?GreenERTMSuperMix試劑盒進(jìn)行QRT-PCR以分析BDNF的轉(zhuǎn)錄水平，并使用2-ΔΔCt方法分析數(shù)據(jù)，相對(duì)表達(dá)水平計(jì)算為2-[(CtBDNF)-(β-肌動(dòng)蛋白的Ct)]。β-肌動(dòng)蛋白用作內(nèi)源對(duì)照基因。引物由寶生物工程(大連)有限公司合成。引物序列為：BDNF正向引物，5′-GGAGACCCTCC GCAACTGT-3′；反向引物，5′-GAGCTATGATGTATCTTAGTG GGTATGAG-3′；β-肌動(dòng)蛋白正向引物，5′-TGGCGAGACAT TCCAAGTTTG-3′；反向引物，5′-AGAGTCATCGTCGTTGC TGATG-3′。PCR方案為：逆轉(zhuǎn)錄酶活化和cDNA合成(5 min、50 ℃)，PCR活化(2 min、95 ℃)，40個(gè)循環(huán)變性(15 s、95 ℃)和退火/延伸(在60 ℃下1 min)。

1.7 大鼠海馬組織BDNF蛋白表達(dá)水平測(cè)定

將大鼠海馬組織切片，用含0.01%Triton X-100、10%正常山羊血清的PBS在室溫(25 ℃)下處理1 h，然后與BDNF兔抗體在4 ℃下孵育48 h。然后將切片用二抗(7.5 mg/ml生物素化的山羊抗兔)在室溫下處理3 h，并用抗生物素蛋白-生物素-過(guò)氧化物酶復(fù)合物(1∶100稀釋)在室溫下孵育1 h，用3,3-二氨基聯(lián)苯胺四鹽酸試劑在室溫下顯色20 min，然后在0.25%甲酚紫乙酸酯溶液中溫育。在400倍鏡下觀察500個(gè)細(xì)胞，評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)：+3分為>50%陽(yáng)性染色細(xì)胞(強(qiáng)表達(dá))，+2分為>20%～50%陽(yáng)性染色細(xì)胞(中度表達(dá))，+1分為5%～20%陽(yáng)性染色細(xì)胞(弱表達(dá))，0分為<5%陽(yáng)性染色細(xì)胞(陰性表達(dá))。

1.8 酶聯(lián)免疫吸附法測(cè)定大鼠海馬組織中IL-4、IL-8及TNF-α蛋白水平

制作海馬組織勻漿后，采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)海馬組織中IL-4、IL-8及TNF-α蛋白水平，具體操作方法按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 五組大鼠認(rèn)知功能指標(biāo)水平比較

模型組大鼠逃避潛伏期時(shí)間明顯長(zhǎng)于對(duì)照組，經(jīng)過(guò)原平臺(tái)位置的次數(shù)明顯少于對(duì)照組，原平臺(tái)象限停留時(shí)間明顯短于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。吡拉西坦組、葛花總黃酮組大鼠逃避潛伏期時(shí)間明顯短于模型組，經(jīng)過(guò)原平臺(tái)位置的次數(shù)明顯多于模型組，原平臺(tái)象限停留時(shí)間明顯長(zhǎng)于模型組；且葛花總黃酮高劑量組大鼠逃避潛伏期時(shí)間明顯短于葛花總黃酮低劑量組，經(jīng)過(guò)原平臺(tái)位置的次數(shù)明顯多于葛花總黃酮低劑量組，原平臺(tái)象限停留時(shí)間明顯長(zhǎng)于葛花總黃酮低劑量組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。葛花總黃酮低劑量組大鼠逃避潛伏期時(shí)間明顯長(zhǎng)于吡拉西坦組，經(jīng)過(guò)原平臺(tái)位置的次數(shù)明顯少于吡拉西坦組，原平臺(tái)象限停留時(shí)間明顯短于吡拉西坦組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；葛花總黃酮高劑量組與吡拉西坦組大鼠的避潛伏期時(shí)間、經(jīng)過(guò)原平臺(tái)位置的次數(shù)及原平臺(tái)象限停留時(shí)間的差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表1。

表1 五組大鼠認(rèn)知功能指標(biāo)水平比較Tab 1 Comparison of cognitive function indicators of rats among five groups

2.2 五組大鼠海馬神經(jīng)元結(jié)構(gòu)比較

對(duì)照組大鼠海馬區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞結(jié)構(gòu)正常；模型組大鼠海馬區(qū)神經(jīng)元大量壞死，有明顯炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；吡拉西坦組、葛花總黃酮組大鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞壞死減少，且神經(jīng)元細(xì)胞結(jié)構(gòu)較為完整，見圖1。

A.對(duì)照組；B.模型組；C.吡拉西坦組；D.葛花總黃酮組 低劑量組；E.葛花總黃酮組高劑量組A. control group; B. model group; C. piracetam group; D. pueraria lobata total flavonoids low dose group; E. pueraria lobata total flavonoids high dose group圖1 五組大鼠海馬神經(jīng)元結(jié)構(gòu)圖(HE染色，×400)Fig 1 Hippocampal neuron structure of rats among five groups (HE staining, ×400)

2.3 五組大鼠海馬組織BDNF mRNA表達(dá)水平比較

模型組大鼠BDNF mRNA表達(dá)水平明顯低于對(duì)照組；吡拉西坦組、葛花總黃酮組大鼠BDNF mRNA表達(dá)水平明顯高于模型組；且葛花總黃酮高劑量組大鼠BDNF mRNA表達(dá)水平明顯高于葛花總黃酮低劑量組，上述差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。葛花總黃酮低劑量組大鼠BDNF mRNA表達(dá)水平明顯低于與吡拉西坦組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；葛花總黃酮高劑量組大鼠BDNF mRNA表達(dá)水平與吡拉西坦組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表2。

表2 五組大鼠海馬組織 BDNF mRNA表達(dá)水平比較Tab 2 Comparison of BDNF mRNA expression levels in hippocampus of rats among five groups

2.4 五組大鼠海馬組織 BDNF 蛋白表達(dá)水平比較

模型組大鼠BDNF蛋白表達(dá)水平明顯低于對(duì)照組；吡拉西坦組、葛花總黃酮組大鼠BDNF蛋白表達(dá)水平明顯高于模型組；且葛花總黃酮高劑量組大鼠BDNF蛋白表達(dá)水平明顯高于葛花總黃酮低劑量組，上述差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。葛花總黃酮低劑量組大鼠BDNF蛋白表達(dá)水平明顯低于吡拉西坦組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；葛花總黃酮高劑量組大鼠BDNF蛋白表達(dá)水平與吡拉西坦組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表3。

表3 五組大鼠海馬組織BDNF蛋白表達(dá)水平比較Tab 3 Comparison of BDNF protein expression levels in hippocampus of rats among five groups

2.5 五組大鼠海馬組織IL-4、IL-8及TNF-α蛋白表達(dá)水平比較

模型組大鼠IL-4、IL-8及TNF-α蛋白表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組；吡拉西坦組、葛花總黃酮組大鼠IL-4、IL-8及TNF-α蛋白表達(dá)水平明顯低于模型組；且葛花總黃酮高劑量組大鼠IL-4、IL-8及TNF-α蛋白表達(dá)水平明顯低于葛花總黃酮低劑量組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。葛花總黃酮低劑量組大鼠IL-4、IL-8及TNF-α蛋白表達(dá)水平高于吡拉西坦組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；葛花總黃酮高劑量組大鼠IL-4、IL-8及TNF-α蛋白表達(dá)水平與吡拉西坦組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表4。

表4 五組大鼠海馬組織IL-4、IL-8及TNF-α蛋白 表達(dá)水平比較Tab 4 Comparison of IL-4, IL-8 and TNF-α protein expression levels in hippocampus of rats among five groups

3 討論

葛花總黃酮可顯著改善胰島素抵抗引起的低血糖癥狀，其機(jī)制與葛花總黃酮降低炎癥因子水平、激活核因子κB途徑以及改變胰島素信號(hào)通路有關(guān)[9]。在神經(jīng)系統(tǒng)中，葛花總黃酮可減輕大鼠腦缺血再灌注引起的神經(jīng)細(xì)胞凋亡。最近的研究結(jié)果表明，葛花總黃酮對(duì)氧化損傷導(dǎo)致的腦損傷具有保護(hù)作用[10]。

認(rèn)知功能研究結(jié)果顯示，吡拉西坦組、葛花總黃酮組大鼠逃避潛伏期時(shí)間短于模型組，經(jīng)過(guò)原平臺(tái)位置的次數(shù)多于模型組，原平臺(tái)象限停留時(shí)間長(zhǎng)于模型組；提示葛花總黃酮對(duì)T2DM大鼠認(rèn)知功能障礙具有明顯治療作用。結(jié)合病理分析，對(duì)照組大鼠海馬區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞結(jié)構(gòu)正常；模型組大鼠海馬區(qū)神經(jīng)元大量壞死，有明顯炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；吡拉西坦組、葛花總黃酮低、高劑量組大鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞壞死減少，且神經(jīng)元細(xì)胞結(jié)構(gòu)較為完整；說(shuō)明葛花總黃酮對(duì)局灶性腦缺血大鼠海馬神經(jīng)元損傷具有保護(hù)作用。

BDNF是在發(fā)育中的大腦里高度表達(dá)的關(guān)鍵神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，在神經(jīng)元的存活和維持中起著重要作用。有證據(jù)表明，BDNF在心理障礙如抑郁癥和精神分裂癥的發(fā)病機(jī)制和藥物治療中發(fā)揮重要作用[7,11-13]。近期的研究結(jié)果表明，神經(jīng)細(xì)胞中的胰島素受體后信號(hào)傳導(dǎo)障礙是導(dǎo)致T2DM認(rèn)知功能障礙的主要機(jī)制[14]。大量研究結(jié)果表明，T2DM認(rèn)知功能障礙是慢性非特異性炎癥，涉及炎癥細(xì)胞因子、免疫系統(tǒng)。炎癥可干擾胰島素受體通路，導(dǎo)致BDNF調(diào)控表達(dá)失衡[15-16]。具體而言，炎癥可以誘導(dǎo)BDNF的絲氨酸/蘇氨酸磷酸化，影響B(tài)DNF和胰島素受體之間的相互作用，抑制BDNF的正常酪氨酸磷酸化，降低BDNF活性，從而降低神經(jīng)細(xì)胞中葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4(GLUT4)的表達(dá)。因此，胰島素的生物活性降低可導(dǎo)致T2DM認(rèn)知功能障礙的發(fā)生[17]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組比較，模型組大鼠BDNF mRNA和蛋白表達(dá)水平降低；與模型組比較，吡拉西坦組、葛花總黃酮組大鼠BDNF mRNA和蛋白表達(dá)水平明顯升高。這與上述結(jié)論符合，同時(shí)也提示葛花總黃酮通過(guò)促進(jìn)BDNF mRNA和蛋白表達(dá)，降低胰島素抵抗，減輕認(rèn)知障礙。

動(dòng)物研究結(jié)果一致表明，神經(jīng)炎癥在T2DM認(rèn)知功能障礙的發(fā)病機(jī)制中起重要作用，神經(jīng)炎癥主要由神經(jīng)和體液信號(hào)傳導(dǎo)途徑介導(dǎo)[18]。T2DM認(rèn)知功能障礙的潛在機(jī)制之一可能是干擾BDNF基因的表達(dá)和功能。在T2DM炎癥反應(yīng)期間，促炎細(xì)胞因子(如白細(xì)胞介素1β)的釋放損害了海馬中的BDNF誘導(dǎo)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，小鼠脂多糖暴露后發(fā)生的BDNF水平降低與TNF-α有關(guān)[19-20]。本研究結(jié)果同時(shí)發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠IL-4、IL-8及TNF-α蛋白表達(dá)水平高于對(duì)照組；吡拉西坦組、葛花總黃酮組大鼠IL-4、IL-8及TNF-α蛋白表達(dá)水平低于模型組；且葛花總黃酮高劑量組大鼠IL-4、IL-8及TNF-α蛋白表達(dá)水平低于葛花總黃酮低劑量組。說(shuō)明炎癥因子IL-4、IL-8及TNF-α水平的降低與葛花總黃酮能改善T2DM大鼠認(rèn)知功能障礙有關(guān)。

綜上所述，葛花總黃酮對(duì)T2DM大鼠認(rèn)知功能障礙的療效顯著，其機(jī)制與葛花總黃酮通過(guò)促進(jìn)BDNF mRNA和蛋白表達(dá)，降低IL-4、IL-8及TNF-α表達(dá)水平，減輕胰島素抵抗以及炎癥反應(yīng)有關(guān)。