柴胡桂枝湯對(duì)泛耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌侵襲的人肺癌A549細(xì)胞的保護(hù)作用Δ

馬致潔，于小紅，章從恩，馬曉晶，王鐵山，李 慧，林龍飛，趙奎君，黃璐琦1,#

(1.中國中醫(yī)科學(xué)院博士后科研流動(dòng)站，北京 100700； 2.中國中醫(yī)科學(xué)院中藥資源中心，北京 100700； 3.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院藥學(xué)部，北京 100050； 4.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院臨床檢驗(yàn)中心，北京 100050; 5.中國中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所，北京 100700)

鮑曼不動(dòng)桿菌(Acinetobacterbaumannii，AB)為非發(fā)酵革蘭陰性桿菌，是一種嚴(yán)格需氧、非乳糖發(fā)酵的條件致病菌，也是院內(nèi)感染的重要病原菌[1-2]。隨著抗菌藥物的廣泛使用，AB逐漸產(chǎn)生耐藥性，當(dāng)AB對(duì)5大類抗菌藥物中的3類及以上藥物產(chǎn)生耐藥性，即被稱為泛耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌(pan-drug-resistantAcinetobacterbaumannii，PDR-AB)，包括頭孢菌素類(如頭孢他啶或頭孢吡肟)、碳青霉烯類(如亞胺培南)、β-內(nèi)酰胺酶抑制劑(如頭孢哌酮舒巴坦)、氟喹諾酮類(如環(huán)丙沙星)和氨基糖苷類(如阿米卡星)。PDR-AB是重癥肺炎的發(fā)病原因之一，受到醫(yī)學(xué)界廣泛關(guān)注[3-5]。課題組前期研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，柴胡桂枝湯干預(yù)大鼠白細(xì)胞減少性泛耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌肺炎有一定效果[6]。本研究進(jìn)一步建立PDR-AB侵襲人肺癌A549細(xì)胞模型，深入研究柴胡桂枝湯對(duì)泛耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌肺炎的作用機(jī)制，為泛耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌肺炎的臨床中醫(yī)治療提供新的思路和方法。

1 材料

1.1 儀器

AL204電子天平(Mettler Toledo公司)；5424R型離心機(jī)(德國Eppendorf公司)；CKX41型光學(xué)顯微鏡(日本Olympus公司)；RE-52 A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)；光學(xué)顯微鏡(日本Olympus公司)；SpectraMax?M3酶標(biāo)儀(Molecular Devices公司)；Vortex Genie 2多用途旋渦混合器(美國Scientific Industries公司)；DM2500倒置顯微鏡(德國Leica公司)；DK-99-Ⅱ恒溫水浴鍋(天津市泰斯特儀器有限公司)；Free-Zone?冷凍干燥機(jī)(美國Labconco公司)。

1.2 藥材

桂枝(批號(hào)：16092701；來源：廣東省)，甘草(批號(hào)：16062303；來源：內(nèi)蒙古自治區(qū))，黃芩(批號(hào)：17050801；來源：山西省)，柴胡(批號(hào)：16111801；來源：陜西省)，大棗(批號(hào)：16080304；來源：山西省)，半夏(批號(hào)：16040501；來源：甘肅省)，白芍(批號(hào)：17042502；來源：河南省)，人參(批號(hào)：17041503；來源：山西省)，上述藥材均經(jīng)趙奎君教授鑒定為正品，且皆購于盛世百草藥業(yè)有限公司。

1.3 試劑

哥倫比亞血瓊脂培養(yǎng)基(梅里埃生物制品有限公司，批號(hào)：1006806800)；DMSO(美國Sigma公司，批號(hào)：101381217)；DMEM(高糖)完全培養(yǎng)基(美國Gibco公司，批號(hào)：8118183)；胎牛血清(美國Gibco公司，批號(hào)：1624110)；磷酸鹽緩沖液(PBS，美國Hyclone公司，批號(hào)：AD20616267)；普通肉湯培養(yǎng)基(北京陸橋公司，批號(hào)：170319)； CCK-8試劑(日本同仁化學(xué)研究所Dojindo Lab公司，貨號(hào)：53445)。

1.4 人肺癌A549細(xì)胞

人肺癌A549細(xì)胞，由首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院臨床醫(yī)學(xué)研究所提供，形狀為梭型，貼壁生長，培養(yǎng)基為高糖DMEM+10%FBS；細(xì)胞生長至90%左右匯合時(shí)進(jìn)行1∶3傳代，每2～3 d 1次。

1.5 菌株

臨床分離的耐藥AB菌株，由北京友誼醫(yī)院臨床醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中心提供，采用VITEK2 compact系統(tǒng)對(duì)病原菌進(jìn)行鑒定及最小抑菌濃度(MIC)測定，并根據(jù)美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)(CLSI)2017年M100-S27標(biāo)準(zhǔn)判定細(xì)菌耐藥性，測試抗菌藥物、MIC及結(jié)果見表1。結(jié)果顯示，該菌株為PDR-AB，其中替加環(huán)素最小抑菌濃度為4 μg/ml，已達(dá)中介，屬替加環(huán)素非敏感菌株，臨床劑量的替加環(huán)素?zé)o法完清除該菌株[6]。

表1 MIC測定結(jié)果Tab 1 Result of MIC

2 方法

2.1 柴胡桂枝湯樣品制備

稱取桂枝、黃芩、人參、芍藥和生姜各3 g，柴胡8 g，半夏4 g，甘草2 g，大棗9 g，8倍量水充分潤濕，放置浸泡30 min，加熱煮沸后回流提取1 h，趁熱3層紗布過濾，濾渣加6倍量水回流提取30 min，濾過，合并濾液，濃縮至液體無流動(dòng)性，置冷凍干燥機(jī)中進(jìn)行干燥48 h，制粉保存，待用。

精密稱定柴胡桂枝湯干粉5 mg加0.9%氯化鈉溶液10 ml進(jìn)行溶解，并用DMEM(高糖)完全培養(yǎng)基依次稀釋為480、240、120、60、30、15、7.5、3.75及1.875 mg/ml濃度的柴胡桂枝湯溶液(以生藥量計(jì))，冷藏，備用。

2.2 細(xì)胞培養(yǎng)方法

取出凍存的人腫瘤A549細(xì)胞，快速放入水浴中，不斷轉(zhuǎn)動(dòng)，使管內(nèi)培養(yǎng)液2 min融化。用75%酒精噴濕凍存管外壁，立即放入超凈臺(tái)中，將融化的細(xì)胞液轉(zhuǎn)移至已加入3 ml DMEM(高糖)完全培養(yǎng)基的15 ml離心管中，上下吹打，混勻。800 r/min離心5 min，除去上清液，加入2 ml DMEM(高糖)完全培養(yǎng)基，反復(fù)吹打?yàn)榧?xì)胞懸液，轉(zhuǎn)移至細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，反復(fù)吹打，使細(xì)胞均勻鋪在培養(yǎng)瓶中，37 ℃，5%CO2進(jìn)行培養(yǎng)。

2.3 指標(biāo)檢測方法

2.3.1 藥物對(duì)人腫瘤A549細(xì)胞的抑制作用及對(duì)PDR-AB侵襲的人肺癌A549細(xì)胞的保護(hù)作用研究：(1)抑制作用實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞培養(yǎng)后取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞胰酶消化使其脫壁，用10%胎牛血清DMEM(高糖)完全培養(yǎng)基重懸成單細(xì)胞懸液。以1×104孔密度將A549細(xì)胞接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，培養(yǎng)24 h后，棄去原有細(xì)胞培養(yǎng)液，PBS洗3次，加入已配置好的不同濃度柴胡桂枝湯(480、240、120、60、30及15 mg/ml)100 μl，每個(gè)濃度重復(fù)6孔。對(duì)照組只加含10%胎牛血清的DMEM(高糖)完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h后，棄去孔內(nèi)液體，PBS洗3次，每孔加入CCK-8溶液10 μl，繼續(xù)培養(yǎng)0.5～2 h，酶標(biāo)儀檢測450 nm處的吸光度。(2)保護(hù)作用實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞接種至96孔細(xì)胞培養(yǎng)板并培養(yǎng)24 h后，棄去原有細(xì)胞培養(yǎng)液，PBS洗3次，每孔加入108cfu/ml PDR-AB 10 μl，并分別加入各濃度柴胡桂枝湯(終濃度為30、15、7.5、3.75及1.875 mg/ml)、替加環(huán)素溶液各90 μl。模型組加DMEM(高糖)完全培養(yǎng)基90 μl，空白組加DMEM(高糖)完全培養(yǎng)基100 μl，每孔做6個(gè)重復(fù)，輕輕混勻，37 ℃，5%CO2，培養(yǎng)24 h。PBS洗3次，每孔加入100 μg/ml替加環(huán)素100 μl，37 ℃，5%CO2，培養(yǎng)1 h，充分殺死AB。CCK-8溶液檢測細(xì)胞存活率[7-8]。

2.3.2 藥物對(duì)PDR-AB黏附與侵襲人肺癌A549細(xì)胞的影響：(1)黏附實(shí)驗(yàn)：細(xì)胞接種至96孔細(xì)胞培養(yǎng)板并培養(yǎng)24 h后，棄去原有細(xì)胞培養(yǎng)液，PBS洗3次，每孔加入108cfu/ml PDR-AB 10 μl，并加入各濃度柴胡桂枝湯(終濃度為30、15及7.5 mg/ml、及替加環(huán)素溶液各90 μl。模型組加DMEM(高糖)完全培養(yǎng)基 90 μl，空白組加DMEM(高糖)完全培養(yǎng)基100 μl，每孔做6個(gè)重復(fù)，輕輕混勻，37 ℃溫箱，5%CO2，培養(yǎng)3 h后，滅菌PBS洗3次，每孔加入0.25%胰酶20 μl和0.5% Triton X-100 80 μl，裂解10 min，反復(fù)吹打，吸取裂解懸液至1.5 ml離心管后，再加PBS 100 μl沖洗孔內(nèi)殘留細(xì)菌，將收集裂解液依次稀釋至合適濃度，平板法細(xì)菌計(jì)數(shù)，試驗(yàn)重復(fù)3次[9-10]。(2)侵襲實(shí)驗(yàn)：用以上相同方法感染細(xì)胞3 h，滅菌PBS洗3次后，每孔加入100 μg/ml替加環(huán)素細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)液100 μl作用40 min以殺滅細(xì)胞外細(xì)菌，PBS洗滌3次后，按以上方法裂解細(xì)胞，平板法計(jì)數(shù)，試驗(yàn)重復(fù)3次。

2.3.3 藥物對(duì)PDR-AB生物被膜形成能力的檢測：挑取血瓊脂培養(yǎng)板上單個(gè)菌落，用0.9%氯化鈉溶液調(diào)制成1麥?zhǔn)蠞舛染鷳乙海?6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔加入含有各濃度柴胡桂枝湯(終濃度為30、15及7.5 mg/ml)的LB肉湯190 μl，菌懸液10 μl，每孔做3個(gè)重復(fù)。37 ℃靜置培養(yǎng)，每隔48 h換液，第5日進(jìn)行檢測，吸棄培養(yǎng)液，用0.9%氯化鈉溶液洗滌3次出去浮游菌，每孔加入99%甲醇200 μl固定20 min；吸棄甲醇，用0.9%氯化鈉溶液洗滌2次室溫(25 ℃)開蓋放置1 min后每孔加入1%結(jié)晶紫染液200 μl染色10 min。染色完畢后用蒸餾水洗滌2次，待干。各孔加入95%乙醇200 μl充分溶解結(jié)晶紫，酶標(biāo)儀讀取570 nm處的吸光度(A570)[11-13]。

2.3.4 藥物對(duì)PDR-AB侵襲A549細(xì)胞的細(xì)胞因子釋放能力的影響：細(xì)胞接種至96孔細(xì)胞培養(yǎng)板并培養(yǎng)24 h后，棄去原有細(xì)胞培養(yǎng)液，PBS洗3次，每孔加入108cfu/ml PDR-AB 10 μl，并加入各濃度柴胡桂枝湯(終濃度為30、15及7.5 mg/ml)、替加環(huán)素溶液各90 μl。模型組加DMEM(高糖)完全培養(yǎng)基90 μl，空白組加DMEM(高糖)完全培養(yǎng)基100 μl，每孔做3個(gè)重復(fù)，輕輕混勻，37 ℃溫箱，5%CO2，培養(yǎng)24 h后，吸取上清液至1.5 ml離心管中，5 000 g，4 ℃離心15 min后收集上清液備用[7]。具體步驟按試劑盒說明書進(jìn)行操作。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 藥物對(duì)人腫瘤A549細(xì)胞的抑制作用及對(duì)PDR-AB侵襲的人肺癌A549細(xì)胞的保護(hù)作用

結(jié)果顯示，柴胡桂枝湯提取物60、120、240及480 mg/ml可顯著抑制A549細(xì)胞，見表2；因此,后期研究選擇柴胡桂枝湯濃度應(yīng)<60 mg/ml。

表2 柴胡桂枝湯提取物對(duì)A549細(xì)胞的抑制作用Tab 2 Inhibitory effect of Chaihu Guizhi decoction extract

CCK-8檢測結(jié)果顯示，柴胡桂枝湯(30、15及7.5 mg/ml)對(duì)PDR-AB侵襲的A549細(xì)胞有保護(hù)作用，可顯著提高A549細(xì)胞存活率，與模型組比較的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表3。

表3 柴胡桂枝湯提取物對(duì)A549細(xì)胞的保護(hù)作用Tab 3 Protective effect of Chaihu Guizhi decoction extract on A549 cells %)

3.2 藥物對(duì)PDR-AB黏附與侵襲作用的影響

結(jié)果顯示，與模型組相比，柴胡桂枝湯組(30、15及7.5 mg/ml)可顯著抑制PDR-AB對(duì)A549細(xì)胞的黏附作用，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05；其中柴胡桂枝湯濃度為30、15 mg/ml時(shí)，P<0.01);與模型組相比，柴胡桂枝湯組(30 mg/ml)可顯著抑制PDR-AB對(duì)A549細(xì)胞的侵襲作用，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表4。

表4 柴胡桂枝湯提取物對(duì)PDR-AB黏附與侵襲作用的 影響Tab 4 Effect of Chaihu Guizhi decoction extract on adhesion and invasion of PDR-AB %)

3.3 柴胡桂枝湯對(duì)PDR-AB生物被膜形成能力的影響

結(jié)果顯示，與模型組相比，柴胡桂枝湯(30、15 mg/ml)可顯著抑制PDR-AB生物被膜的形成(P<0.05;其中柴胡桂枝湯濃度為30 mg/ml時(shí)，P<0.01)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表5。

表5 柴胡桂枝湯對(duì)鮑曼不動(dòng)桿菌生物被膜形成能力的 影響Tab 5 Effect of Chaihu Guizhi decoction on the forming ability of Acinetobacter Baumannii biofilm

3.4 柴胡桂枝湯對(duì)TNF-α和IL-6釋放的影響

結(jié)果顯示，與空白組相比，模型組TNF-α和IL-6的濃度顯著升高，差異有極顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，證明PDR-AB侵襲A549細(xì)胞促進(jìn)了細(xì)胞因子的釋放；與模型組相比，柴胡桂枝湯(30、15 mg/ml)可顯著降低TNF-α和IL-6釋放水平，差異有極顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見表6。

表6 柴胡桂枝湯對(duì)TNF-α和IL-6釋放的影響Tab 6 Effects of Chaihu Guizhi decoction on the release of TNF-α and IL-6

4 討論

A549細(xì)胞是腺癌人類肺泡基底上皮細(xì)胞，最早是在1972年由D.J.Giard等通過1名58歲白人男性的外植體腫瘤，轉(zhuǎn)移并培養(yǎng)肺腫瘤組織而得到的[14]。A549細(xì)胞廣泛用于藥物代謝的體外模型，還可以作為轉(zhuǎn)染宿主[15-17]。本研究建立了PDR-AB侵襲人肺癌A549細(xì)胞模型，評(píng)價(jià)柴胡桂枝湯干預(yù)后的效果，并探討作用機(jī)制。

PDR-AB侵襲人肺癌A549細(xì)胞后，細(xì)胞存活率顯著降低，促進(jìn)細(xì)胞炎癥因子TNF-α和IL-6釋放。本研究結(jié)果顯示，柴胡桂枝湯提取物可通過減少細(xì)胞死亡和降低促炎細(xì)胞因子的釋放來減弱PDR-AB對(duì)A549細(xì)胞的毒性作用，提高細(xì)胞存活率；可顯著降低PDR-AB對(duì)A549細(xì)胞的黏附與侵襲作用，顯著抑制PDR-AB生物被膜的形成。

細(xì)菌與細(xì)胞相互作用的第1步是黏附，AB能黏附于喉上皮細(xì)胞、氣管上皮細(xì)胞和肺泡上皮細(xì)胞等多種真核細(xì)胞[18]。侵襲是細(xì)菌與細(xì)胞作用的第2步，AB黏附于細(xì)胞后啟動(dòng)侵襲機(jī)制而進(jìn)入宿主細(xì)胞內(nèi)。AB侵入宿主細(xì)胞是其躲避免疫識(shí)別的一種方式，是非典型的細(xì)胞內(nèi)致病菌。目前研究結(jié)果表明，細(xì)菌侵襲細(xì)胞能力是細(xì)菌毒力大小的有效外在表現(xiàn)[19]。本研究結(jié)果顯示，柴胡桂枝湯提取物可顯著降低PDR-AB對(duì)A549細(xì)胞的侵襲與黏附能力，降低PDR-AB的毒力，達(dá)到保護(hù)A549細(xì)胞的作用。

生物被膜是細(xì)菌黏附于載體表面，分泌多糖蛋白復(fù)合物、纖維蛋白和脂質(zhì)蛋白等，將其自身包繞其中而形成的模性結(jié)構(gòu)。生物被膜使細(xì)菌抵抗干燥、營養(yǎng)缺乏等不利生存的能力增強(qiáng)，同時(shí)增強(qiáng)抗消毒劑和耐藥性[20-21]。本研究結(jié)果表明，柴胡桂枝湯提取物可有效抑制PDR-AB生物被膜的形成，降低PDR-AB的生存能力，降低其對(duì)A549細(xì)胞的侵襲作用。

本研究結(jié)果表明，柴胡桂枝湯提取物對(duì)PDR-AB侵襲的A549細(xì)胞有一定的保護(hù)作用。柴胡桂枝湯提取物一方面通過降低促炎細(xì)胞因子TNF-α和IL-6的釋放水平來減輕炎癥反應(yīng)；另一方面降低PDR-AB對(duì)A549細(xì)胞的黏附與侵襲作用，使PDR-AB毒力降低，減輕對(duì)A549細(xì)胞的殺傷作用。此外，柴胡桂枝湯提取物可顯著抑制PDR-AB生物被膜的形成，降低其生存能力，由此對(duì)A549細(xì)胞起到保護(hù)作用，提高其存活率。本研究結(jié)果可為臨床治療AB感染提供參考。