特發(fā)性膜性腎病患者腎組織中SOD2和IgG4的表達(dá)及意義

王斯 ，劉茂東 ，遲雁青 ，康英麗 ，李英

（1.杭州市中醫(yī)院，浙江 杭州 310007；2.河北醫(yī)科大學(xué)第三醫(yī)院，河北 石家莊 050017）

氧化應(yīng)激與腎臟疾病的發(fā)病關(guān)系密切，其參與海曼腎炎（IMN動(dòng)物模型）[1-2]、糖尿病腎病及慢性腎衰竭等[3-4]發(fā)病過(guò)程。錳超氧化物歧化酶（SOD2）屬于金屬酶類(lèi)，是抗氧化細(xì)胞保護(hù)系統(tǒng)的主要組成部分，可將毒性的超氧化物陰離子（02-）轉(zhuǎn)化為過(guò)氧化氫和雙原子氧，在機(jī)體氧化與抗氧化平衡中起重要的作用，與很多疾病的發(fā)生發(fā)展密不可分[5-6]。近年來(lái)，特發(fā)性膜性腎?。↖MN）的發(fā)病率逐年上升，但具體發(fā)病機(jī)制未知，目前認(rèn)為與IMN產(chǎn)生的特異IgG4足細(xì)胞自身抗體和抗原結(jié)合形成上皮下免疫復(fù)合物、激活補(bǔ)體系統(tǒng)后導(dǎo)致足細(xì)胞損傷和凋亡、產(chǎn)生大量蛋白尿有關(guān)。國(guó)外學(xué)者Prunotto等[7]用結(jié)合蛋白組學(xué)法測(cè)定人類(lèi)IMN患者血清和腎小球中的抗足細(xì)胞膜蛋白抗體，在患者血清中發(fā)現(xiàn)了SOD2和IgG4抗體，免疫熒光檢測(cè)到SOD2及IgG4共同沉積在腎小球中。本文主要探討SOD2在IMN患者腎組織中的表達(dá)及其與IgG4表達(dá)部位的關(guān)系，為SOD2在IMN發(fā)病中的作用提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2013年6-12月河北醫(yī)科大學(xué)第三醫(yī)院經(jīng)腎活檢確診的IMN住院患者，并選擇同期繼發(fā)性膜性腎?。⊿MN）、微小病變性腎?。∕CD）住院患者作為對(duì)照。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）臨床及腎活檢病理檢查均符合 IMN、SMN、MCD的診斷，SMN患者臨床上須有繼發(fā)因素，腎活檢病理符合不典型膜性腎疾病理表現(xiàn)；（2）既往未接受過(guò)激素、免疫抑制劑或腎移植治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并其他腎臟、心臟、肝臟疾病及糖尿病等系統(tǒng)性疾病。IMN組41 例，男 19 例，女 22 例，年齡（5.8±13.0）歲；SMN組 13 例，男6 例，女 7 例，年齡（8.6±14.2）歲；MCD組 6 例，男 4 例，女 2 例，年齡（2.8±14.8）歲。三組一般資料差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)審批通過(guò)且患者知情同意。

1.2 方法 收集患者性別、年齡、24小時(shí)尿蛋白定量、血肌酐等資料。免疫組化法檢測(cè)患者腎組織SOD2及IgG4的表達(dá)：腎組織蠟塊切片后脫臘并進(jìn)行抗原修復(fù)，后將切片放入3% H2O2溶液中清除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，滴加一抗，滴加二抗孵育，DAB顯色，蘇木素復(fù)染細(xì)胞核，經(jīng)分化、返藍(lán)、脫水、透明后封片。顯微鏡隨機(jī)選取10個(gè)視野，用Image-ProPlus 6.0軟件進(jìn)行半定量分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料采用（±s）表示，正態(tài)分布資料多組間比較采用方差分析；計(jì)數(shù)資料用百分率表示，并采用χ2檢驗(yàn)；相關(guān)性檢驗(yàn)采用線性相關(guān)分析。

2 結(jié)果

2.1 SOD2和IgG4的表達(dá) （1）SOD2在各組的腎小管上皮細(xì)胞中均有表達(dá)，且表達(dá)無(wú)明顯差異；SOD2在IMN組腎小球中有一定表達(dá)，在SMN組和MCD組腎小球中僅微量表達(dá)（圖1A-1C）。腎小球基底膜、上皮下SOD2的表達(dá)IMN組較SMN組、MCD組均顯著增強(qiáng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），SMN組與MCD 組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。（2）IgG4 在IMN組腎小球基底膜、上皮下均有表達(dá)，而在SMN組、MCD組腎小球基底膜中未見(jiàn)表達(dá)（圖1D-1F）。IMN組與SMN組、MCD組比較，腎小球內(nèi)IgG4表達(dá)增強(qiáng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；SMN 組與 MCD組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。詳見(jiàn)表1。

表1 三組SOD2和IgG4在腎小球基底膜、上皮下的表達(dá)

2.2 相關(guān)性分析 在IMN組中，腎小球內(nèi)SOD2的表達(dá)與24小時(shí)尿蛋白定量呈顯著負(fù)相關(guān) （r=-0.354，P=0.023）；IgG4 的表達(dá)與 24 小時(shí)尿蛋白定量呈正相關(guān)（r=0.361，P=0.021）；SMN 組、MCD 組腎小球內(nèi)SOD2、IgG4的表達(dá)與24小時(shí)尿蛋白定量均無(wú)相關(guān)性（P＞0.05）。詳見(jiàn)表 2。

表2 三組SOD2/IgG4與24小時(shí)尿蛋白定量的相關(guān)性

3 討論

SOD2是廣泛的抗氧化細(xì)胞保護(hù)系統(tǒng)的重要組成部分，存在于人體細(xì)胞線粒體基質(zhì)內(nèi)[8-9]，可將毒性的超氧化物離子（02-）轉(zhuǎn)化為過(guò)氧化氫和雙原子氧，對(duì)抗并阻斷氧自由基對(duì)細(xì)胞造成的損害，并及時(shí)修復(fù)受損細(xì)胞，在清除自由基、維持線粒體及機(jī)體氧化應(yīng)激平衡中具有重要作用。在腎臟中，SOD2廣泛表達(dá)于腎小管上皮細(xì)胞[10]，特別是皮質(zhì)，而在腎小球中的表達(dá)則少見(jiàn)報(bào)道[7]，SOD2在腎臟表達(dá)的升高與腎臟的毒性損傷密切相關(guān)。

本研究發(fā)現(xiàn)，SOD2在各組腎小管上皮細(xì)胞中均有表達(dá)，且表達(dá)無(wú)明顯差異，這與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致[7]。同時(shí)，SOD2在IMN腎小球基底膜、上皮下表達(dá)水平較高，在SMN組、MCD組僅微量表達(dá)，且SOD2在IMN中的表達(dá)水平與24小時(shí)尿蛋白定量呈負(fù)相關(guān)，在SMN組、MCD組中未發(fā)現(xiàn)存在相關(guān)性，提示SOD2可能是IMN腎小球特異性表達(dá)的物質(zhì)，推測(cè)IMN發(fā)病過(guò)程中可能存在腎臟的氧化損傷，導(dǎo)致足細(xì)胞受損，大量SOD2從線粒體中釋放，發(fā)揮抗氧化功能，修復(fù)受損細(xì)胞，降低尿蛋白的產(chǎn)生，對(duì)腎臟起到積極的保護(hù)作用，同時(shí)在氧化與抗氧化過(guò)程中發(fā)揮重要作用。

Mubarak等[11-13]檢測(cè)了IMN患者腎臟中抗足細(xì)胞抗體的種類(lèi)及含量，發(fā)現(xiàn)IgG4是所有抗體中最常見(jiàn)的亞型，抗體滴度IMN比健康人和病理對(duì)照組均高，腎活檢組織中可觀察到IgG4和C3呈顆粒狀沉積在腎小球基底膜，電鏡可見(jiàn)免疫復(fù)合物沉積在腎小球基底膜上皮下。本研究結(jié)果顯示，IgG4在大部分IMN患者腎小球基底膜上皮下均有表達(dá)，較SMN、MCD表達(dá)顯著增強(qiáng)，與文獻(xiàn)報(bào)道一致。且IMN組IgG4的表達(dá)水平與24小時(shí)尿蛋白定量呈正相關(guān)，在SMN組、MCD組中未發(fā)現(xiàn)存在相關(guān)性。由此證實(shí)IgG4為IMN的主要致病抗體，與蛋白尿的形成密切相關(guān)。

圖1 三組腎組織中SOD2和IgG4的表達(dá)。1A-1C：SOD2在IMN、SMN、MCD中的表達(dá)，紅色箭頭標(biāo)注的為SOD2在腎小管上皮細(xì)胞的表達(dá)（棕色著色區(qū)），綠色箭頭標(biāo)注的為SOD2在腎小球基底膜、上皮下的表達(dá)（棕色著色區(qū)）；1D-1F：IgG4在IMN、SMN、MCD中的表達(dá)，藍(lán)色箭頭標(biāo)注為IgG4在腎小球基底膜、上皮下的表達(dá) （棕色著色區(qū)）。 （En Vision×200）

有國(guó)外學(xué)者在IMN患者血清中檢測(cè)到特定的抗SOD2 IgG4抗體，其將IMN腎小球微切割后也洗脫出高滴度的抗SOD2 IgG4抗體，推測(cè)SOD2在腎組織中的表達(dá)及抗體的形成可能與IMN的發(fā)病過(guò)程有關(guān)[7]。本研究觀察到SOD2與IgG4在IMN腎小球中的表達(dá)部位基本一致，均沉積在腎小球基底膜及上皮下，由此推測(cè)，SOD2不僅在氧化應(yīng)激時(shí)對(duì)腎組織具有保護(hù)作用，當(dāng)氧化應(yīng)激過(guò)度時(shí)，SOD2也可能作為一種足細(xì)胞致病抗原，與IgG4形成免疫復(fù)合物，沉積在腎臟，激活補(bǔ)體系統(tǒng)后形成膜攻擊復(fù)合物致足細(xì)胞損傷，參與IMN的發(fā)病過(guò)程。

綜上所述，SOD2在IMN腎小球基底膜、上皮下表達(dá)增高，且與24小時(shí)尿蛋白定量呈負(fù)相關(guān)，提示SOD2在IMN腎臟氧化物應(yīng)激時(shí)對(duì)機(jī)體起保護(hù)作用，降低尿蛋白的產(chǎn)生；SOD2與IgG4均在IMN腎小球基底膜上皮下沉積，推測(cè)SOD2也可能作為足細(xì)胞致病抗原參與IMN的發(fā)病過(guò)程。